h定點(diǎn)突變與基因打靶技術(shù)解析課件

1、定點(diǎn)突變與基因打靶技術(shù)李冬民 博士 副教授Email：；西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系第1頁(yè)，共85頁(yè)。第一節(jié) 基因定點(diǎn)突變第2頁(yè)，共85頁(yè)?；蛲蛔儼▎蝹€(gè)堿基或片斷的替換，基因片斷的插入與刪除等。根據(jù)其特點(diǎn)可將基因突變技術(shù)分兩大類： 1.隨機(jī)突變 表型篩選 2.位點(diǎn)特異性突變 定點(diǎn)突變 I.基因突變第3頁(yè)，共85頁(yè)。點(diǎn)突變：指單個(gè)堿基的突變，簡(jiǎn)而言之突變發(fā)生在基因的一個(gè)點(diǎn)上，故稱點(diǎn)突變點(diǎn)突變的類型 1）堿基替換 a.轉(zhuǎn)換：同類堿基間 b.顛換：不同類型間的堿基 2）堿基的增加及缺失II.點(diǎn)突變第4頁(yè)，共85頁(yè)。點(diǎn)突變的分子效應(yīng)： 突變發(fā)生在基因編碼區(qū) a.同義突變:由于

2、遺傳密碼有兼性，若突變的密碼子編碼同樣的氨基酸一般對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能沒有影響 b.錯(cuò)義突變:堿基對(duì)的置換使mRNA的某一個(gè)密碼子變成編碼另一種氨基酸的密碼子的突變II.點(diǎn)突變第5頁(yè)，共85頁(yè)。c.無義突變（nonsense mutation ）：是指由于某個(gè)堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，從而使肽鏈合成提前終止。 編碼氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，使肽鏈合成中斷。 II.點(diǎn)突變 d.移碼突變:在正常地DNA分子中,堿基缺失或增加非3地倍數(shù),造成這位置之后的一系列編碼發(fā)生移位錯(cuò)誤的改變，這種現(xiàn)象稱移碼突變。 第6頁(yè)，共85頁(yè)。 1.定義：按照人們的意愿對(duì)基因的編碼區(qū)和表達(dá)

3、調(diào)控區(qū)定向進(jìn)行缺失、插入或堿基替換等過程。III.基因定點(diǎn)突變2.定點(diǎn)突變的研究意義：對(duì)調(diào)控區(qū)進(jìn)行突變研究基因結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系對(duì)編碼基因進(jìn)行突變檢驗(yàn)特定殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、催化活性和配基結(jié)合能力中的作用獲得突變蛋白第7頁(yè)，共85頁(yè)。3.定點(diǎn)突變的類型（1）寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變指用含有突變堿基的寡聚核苷酸片斷作為引物，在聚合酶的作用下啟動(dòng)DNA分子進(jìn)行復(fù)制。（2）盒式突變是利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。（3）PCR介導(dǎo)的基因突變III.基因定點(diǎn)突變第8頁(yè)，共85頁(yè)。DNA定點(diǎn)突變的種類寡聚核苷酸介導(dǎo)替換、插入、刪除盒式突變PCR介導(dǎo)第9頁(yè)，共85

4、頁(yè)。III.基因定點(diǎn)突變第10頁(yè)，共85頁(yè)。（1） 寡聚核苷酸介導(dǎo)法第11頁(yè)，共85頁(yè)。Kunkel法或稱 “U” 法dut-：dUTP 酶缺陷，細(xì)胞不能把 dUTP 轉(zhuǎn)化為 dUMP ，因此細(xì)胞內(nèi) dUTP 的含量大為增加，其中一些 dUTP 可摻入 DNA 中正常情況下由胸腺嘧啶占據(jù)的位置。背景介紹第12頁(yè)，共85頁(yè)。 在dut+的E. coli中 dUTP dUMP 在dUTP 酶缺失體中（dut- ） dUTP dUMP dUTP酶 dut：dUTPase突變，可導(dǎo)致E. coli內(nèi)dUTP的量增加，當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，可在很多應(yīng)該加dTTP的位置加入dUTP。第13頁(yè)，共85頁(yè)。Kunk

5、el法或稱 “U” 法ung-：UDG 酶缺陷， UDG 酶尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）可除去摻入 DNA 中的尿嘧啶殘基,產(chǎn)生脫堿基的位點(diǎn)。含有脫堿基的DNA鏈不再具備作為完整復(fù)制模板的能力背景介紹 制備單鏈DNA模板時(shí)用ung- dut-突變的大腸桿菌菌株如CJ236菌株，該菌株合成的DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。如M13噬菌體DNA中有20-30個(gè)尿嘧啶第14頁(yè)，共85頁(yè)。 在正常情況下，尿嘧啶-糖基化酶(ung+)可以去除摻入DNA中的尿嘧啶殘基。但在ung-的菌株中，此酶失活。 在大腸桿菌dut- ung-菌株中生長(zhǎng)的M13噬菌體的單鏈基因組DN

6、A中將含有20-30個(gè)尿嘧啶殘基。用這些噬菌體感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA鏈遭到破壞，感染力下降約5個(gè)數(shù)量級(jí)。 此法的成功關(guān)鍵，是要得到好的含單鏈模板DNA。第15頁(yè)，共85頁(yè)。 目標(biāo) DNA 插入 phagemid 載體并進(jìn)入 E.coli CJ236 。 由于該菌體 ung- dut- 突變，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶） M13K07 輔助感染下，產(chǎn)生帶 U 的單鏈 DNA 。 與引入誘變的 Oligo 復(fù)性。Kunkel 法過程包括：第16頁(yè)，共85頁(yè)。 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下，以帶 U 的單鏈 DNA 為模板合成

7、一條新鏈，形成雜合雙鏈。 感染 dut+ ung+ E.coliMV1190 后，在細(xì)胞分裂過程中，只有新合成的 DNA 鏈才能起模板作用合成新的并引入了誘變位點(diǎn)的子代雙鏈 DNA 。而有 U 的 DNA 鏈，在 dut+ 和 ung+ 產(chǎn)物的作用下，尿嘧啶被水解，從而失去作為模板的能力。第17頁(yè)，共85頁(yè)。無5-3外切活性3-5外切活性低噬菌粒載體（phagemid ）M13K07輔助感染產(chǎn)生帶 U 的單鏈 DNA 第18頁(yè)，共85頁(yè)。 這種方法得到的突變率太低，約為1-5%。主要原因是含突變位點(diǎn)的雙鏈DNA，轉(zhuǎn)入E.coli后，被其修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)了。第19頁(yè)，共85頁(yè)。第20頁(yè)，共85頁(yè)。要

8、求 5 端磷酸化。引物的終極條件：與靶 DNA 正確配對(duì)特異性地與靶 DNA 序列退火。 引物第21頁(yè)，共85頁(yè)。A.單核苷酸置換插入或缺失5 端完全配對(duì)，使得上游（引物）起始的 DNA 合成不容易將誘變寡核苷酸取代，約需 8-10bp 。 3 端所形成的雜交體足以引導(dǎo) DNA 合成。如果錯(cuò)配核苷酸太靠近 3 端， 3 端將不能形成穩(wěn)定的雜交體，易被外切活性降解。所以 3 端需有 7-9bp 完全配對(duì)；為便于篩選，應(yīng)選用可形成穩(wěn)定雜交體而長(zhǎng)度最短的誘變寡核苷酸。一般 17-19bp ，錯(cuò)配在中央，使得完全配對(duì)的雜交體與錯(cuò)配雜交體之間的熱穩(wěn)定性差異足夠大。第22頁(yè)，共85頁(yè)。B.多處缺失或變換

9、2 個(gè) bp 以上的 oligo 兩側(cè)需 12-15bp 側(cè)翼雙鏈區(qū)的 Tm 應(yīng)約為 35-40Tm = 4 （G + C） + 2 （A + T） 突變區(qū)域大，效率越低（兩側(cè)形成穩(wěn)定雜交體的能力是突變區(qū)長(zhǎng)度的函數(shù) 越低）。靶 DNA 盡可能短，應(yīng)測(cè)序確定其突變。 模板/結(jié)果第23頁(yè)，共85頁(yè)。2.盒式定點(diǎn)突變第24頁(yè)，共85頁(yè)。3. PCR介導(dǎo)的基因突變?cè)诨?和3末端產(chǎn)生突變重疊延伸PCR大引物PCR法第25頁(yè)，共85頁(yè)。（1）在基因5和3末端產(chǎn)生突變第26頁(yè)，共85頁(yè)。（2）重疊延伸PCR誘變法（Overlap extension） 對(duì)于兩個(gè)具有部分重疊序列的 DNA 片段，在經(jīng)過變性和

10、復(fù)性后，兩個(gè) DNA 片段之間通過同源序列形成部分雜合的雙鏈，在 DNA 聚合酶作用下，雜合雙鏈可互為引物和模板，引導(dǎo) DNA 的合成，從而形成雜合 DNA 雙鏈。第27頁(yè)，共85頁(yè)。該方法需要4個(gè)引物,包括2個(gè)含有突變堿基的反向互補(bǔ)的引物,2個(gè)上、下游通用引物。整個(gè)誘變過程需要3個(gè)PCR反應(yīng)分2輪進(jìn)行。第1輪PCR的2個(gè)反應(yīng)分別產(chǎn)生2個(gè)含突變位點(diǎn)的上下游DNA片段,這2個(gè)DNA片段的末端互補(bǔ)。第1輪PCR的產(chǎn)物需要經(jīng)凝膠電泳純化。第2輪PCR將上述2個(gè)PCR產(chǎn)物混合,通過末端互補(bǔ)配對(duì)互為引物延伸得到完整的含突變位點(diǎn)的全長(zhǎng)DNA再用通用引物擴(kuò)增誘變的全長(zhǎng)的DNA第28頁(yè)，共85頁(yè)。重疊延伸法定

11、點(diǎn)突變技術(shù)的原理示意圖第29頁(yè)，共85頁(yè)。第30頁(yè)，共85頁(yè)。重疊延伸PCR法小結(jié)缺點(diǎn)：需要2對(duì)引物，進(jìn)行3次PCR，并且需要對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行純化。優(yōu)點(diǎn)：幾乎沒有特殊限制，而且成功率高，因此運(yùn)用非常廣泛。 同時(shí)利用重疊延伸PCR技術(shù)可以對(duì)基因中心區(qū)段進(jìn)行取代、插入、缺失的突變。第31頁(yè)，共85頁(yè)。第32頁(yè)，共85頁(yè)。第33頁(yè)，共85頁(yè)。（3）大引物PCR誘變法 大引物PCR法由Kammann M等人于1989年提出,隨后經(jīng)Sarkar G和Sommer S S等人加以改進(jìn)。 該方法需2個(gè)側(cè)翼引物和1個(gè)內(nèi)部誘變引物,經(jīng)過2輪PCR獲得突變的全長(zhǎng)DNA。 第1輪PCR用誘變引物和1個(gè)側(cè)翼引物,擴(kuò)增產(chǎn)

12、物經(jīng)凝膠純化后作為大引物再與另一側(cè)翼引物進(jìn)行第2輪PCR,產(chǎn)生全長(zhǎng)的突變的DNA。第34頁(yè)，共85頁(yè)。大引物PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變?cè)淼?5頁(yè)，共85頁(yè)。 Picard V,1994和Song-Hua Ke,1997等分別建立了單管大引物PCR(Single-tube megaprimer PCR)。單管大引物法省去第1輪PCR產(chǎn)物的純化過程,實(shí)現(xiàn)在同一管中先后進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)。Song-Hua Ke提出的方案更加巧妙簡(jiǎn)單。 需設(shè)計(jì)Tm值不同的2個(gè)側(cè)翼引物,第1輪PCR反應(yīng)用低Tm值的側(cè)翼引物(F1)和誘變引物,用較低的退火溫度,擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生大引物。然后再加入高Tm值的側(cè)翼引物(F2)在較高的

13、退火溫度下進(jìn)行第2輪的反應(yīng),擴(kuò)增出全長(zhǎng)的含突變位點(diǎn)的DNA產(chǎn)物。第36頁(yè)，共85頁(yè)。單管大引物PCR誘變第37頁(yè)，共85頁(yè)。*以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)誘變技術(shù)存在的問題及解決對(duì)策1）.誘變產(chǎn)物的忠實(shí)性PCR產(chǎn)物有相對(duì)高的錯(cuò)誤率,除目的突變外,常包含一些非預(yù)定突變?？梢酝ㄟ^以下2個(gè)方法將錯(cuò)誤率降到最低。限制擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)應(yīng)用更好的熱穩(wěn)定DNA聚合酶,如Pfu,Vent等,它們具有35外切酶活性,并具有校正功能第38頁(yè)，共85頁(yè)。2）. 誘變的效率提高誘變效率是以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)誘變面臨的問題。通過PCR條件的優(yōu)化、不同Tm值的引物的巧妙的設(shè)計(jì)、不對(duì)稱擴(kuò)增、把引物標(biāo)記上生物素分離突變DNA等手段可以提

14、高誘變效率。PCR定點(diǎn)誘變方法的不斷創(chuàng)新和發(fā)展使得分子生物學(xué)關(guān)于基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)研究和基因工程中定點(diǎn)改造目的基因更加簡(jiǎn)便、高效、低耗。第39頁(yè)，共85頁(yè)。* 各種點(diǎn)突變方法的比較方法寡聚核苷酸介導(dǎo)的突變盒式突變PCR介導(dǎo)的突變優(yōu)點(diǎn)保真度高簡(jiǎn)單易行突變效率高操作簡(jiǎn)單突變成功率高缺點(diǎn)操作復(fù)雜周期長(zhǎng)合成多條引物成本高受到酶切位點(diǎn)的限制后續(xù)工作復(fù)雜TaqDNA聚合酶保真性偏低第40頁(yè)，共85頁(yè)。應(yīng)用產(chǎn)品一步反向PCR法Stratagen公司的QuikChange系列試劑盒SBS Genetech公司的Muta-direct Site Directed Mutagenesis KitStr

15、atagen公司的QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis KitTaKaRa公司的Multipoints Mutagenesis Kit 第41頁(yè)，共85頁(yè)。（1）一步反向PCR法第42頁(yè)，共85頁(yè)。一種簡(jiǎn)便快速的定點(diǎn)突變的方法 Stratagen公司研制的Quickchange試劑盒,可以雙鏈DNA質(zhì)粒為模板，只需一對(duì)引物，進(jìn)行一次PCR，在12d內(nèi)即可完成點(diǎn)突變過程。 DpnI識(shí)別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會(huì)出現(xiàn)，而且不止一次。 （2）Dpn法第43頁(yè)，共85頁(yè)。 以反向PCR為基礎(chǔ),直接以含有目的基因的環(huán)狀質(zhì)粒為模板,

16、用2個(gè)反向的、5端相鄰且磷酸化的引物向2個(gè)反方向延伸,擴(kuò)增出線性的雙鏈DNA,然后用Dpn酶降解甲基化或半甲基化(只含有1條模板鏈)的模板鏈（即來自質(zhì)粒）,而在體外合成的突變鏈不受Dpn酶的降解,這樣可以純化突變的雙鏈DNA。最后用連接酶連接形成帶突變基因的環(huán)狀質(zhì)粒。第44頁(yè)，共85頁(yè)。第45頁(yè)，共85頁(yè)。Overview of the QuikChange XL site-directed mutagenesis method.第46頁(yè)，共85頁(yè)。QuickChange ，GeneTailor，Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變，但它們與傳統(tǒng)

17、方法的區(qū)別主要在于可以對(duì)突變克隆進(jìn)行初步的篩選篩選原理：降解甲基化質(zhì)粒模板篩選依據(jù)： 來自大腸桿菌的質(zhì)粒99%發(fā)生甲基化； PCR是去甲基化過程，PCR產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）是去甲基化的產(chǎn)物。QuickChange ，GeneTailor，Easy /Fast Mutagenesis System三種市售點(diǎn)突變?cè)噭┖械谋容^第47頁(yè)，共85頁(yè)。篩選方法：體內(nèi)降解：原始質(zhì)粒模板可以被能降解甲基化質(zhì)粒的大腸桿菌（DMT）降解，而去甲基化的擴(kuò)增產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）不會(huì)被降解。體外降解：DpnI識(shí)別序列5-GmATC-3（在DNA序列中，一般每256bp中出現(xiàn)一次）。甲基化模板可被DpnI識(shí)別、切割，

18、而去甲基化的擴(kuò)增產(chǎn)物（發(fā)生突變的產(chǎn)物）不會(huì)被降解。第48頁(yè)，共85頁(yè)。Stratagene：QuickChange Mutagenesis System優(yōu)點(diǎn)：篩選方法：DpnI限制性內(nèi)切酶缺點(diǎn)：引物完全重疊，線性擴(kuò)增， 產(chǎn)物不可見，可操作性差擴(kuò)增產(chǎn)物為線狀無DMT體內(nèi)消化降解模板第49頁(yè)，共85頁(yè)。Invitrogen：GeneTailor Mutagenesis System優(yōu)點(diǎn)引物部分重疊，指數(shù)擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物可見，易于操作篩選方法：DMT體內(nèi)降解缺點(diǎn)：突變點(diǎn)在一條引物上無DpnI限制性內(nèi)切酶降解模板第50頁(yè)，共85頁(yè)。TransGen： 綜合了上述兩種試劑盒的優(yōu)點(diǎn)！引物部分重疊；優(yōu)化兩條引物

19、上均有突變點(diǎn)，突變效率高；DpnI體外降解篩選 + DMT體內(nèi)降解篩選=雙重篩選！第51頁(yè)，共85頁(yè)。TransGen:Easy/Fast Mutagenesis SystemEasy點(diǎn)突變與Fast點(diǎn)突變的區(qū)別Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶 擴(kuò)增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，擴(kuò)增10Kb左右的質(zhì)粒只需2個(gè)小時(shí)！第52頁(yè)，共85頁(yè)。引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增特點(diǎn)模板降解方法StratageneQuickChange完全重疊突變位點(diǎn)位于兩條引物上線性擴(kuò)增，產(chǎn)物不可見產(chǎn)物為線狀DpnI酶體外降解

20、InvitrogenGeneTailor部分重疊突變位點(diǎn)位于一條引物上指數(shù)擴(kuò)增，產(chǎn)物可見產(chǎn)物為環(huán)狀DMT細(xì)胞體內(nèi)降解TransGenEasy/Fast Mutagenesis部分重疊突變位點(diǎn)位于兩條引物上指數(shù)擴(kuò)增，產(chǎn)物可見產(chǎn)物為環(huán)狀DpnI酶體外降解DMT細(xì)胞體內(nèi)降解第53頁(yè)，共85頁(yè)。Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa) 適用于插入片段長(zhǎng)度在1.0kb以下的多點(diǎn)突變。市售多位點(diǎn)突變?cè)噭┖械?4頁(yè)，共85頁(yè)。Steps of Muta-direct Site-Directed Mutagenesis Kit第55頁(yè)，共85頁(yè)。Overvie

21、w of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method 資料表明，引入3個(gè)定點(diǎn)突變的效率為60%，5個(gè)定點(diǎn)突變的效率為30%。 第56頁(yè)，共85頁(yè)。第二節(jié) 基因打靶技術(shù)第57頁(yè)，共85頁(yè)。 基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息息的實(shí)驗(yàn)手段。通過對(duì)生物活體遺傳信息的定向修飾（包括基因滅活、點(diǎn)突變引入、缺失突變、外源基因定位引入、染色體組大片段刪除等），并使修飾后的遺傳信息在生物活體內(nèi)遺傳，表達(dá)突變的性狀，從而研究基因功能等生命科學(xué)的重大問題，以及提供相關(guān)的疾病治療、新藥篩選評(píng)價(jià)模型等。 基因打靶技術(shù)的概念第58頁(yè)，共85頁(yè)。基因

22、打靶（gene targeting）：是指通過DNA定 點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從 而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能?；蚯贸╧nock out of gene）：通過DNA同源重組， 使得胚胎干細(xì)胞特定的內(nèi)源基因被破壞而造成其 功能喪失，然后通過ES細(xì)胞介導(dǎo)得到該基因喪失 的小鼠模型的過程稱為基因敲除?；蚯萌耄╧nock in of gene）：利用基因同源重組， 將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中進(jìn)行同源重 組，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。第59頁(yè)，共85頁(yè)。 進(jìn)行基因打靶，首先要設(shè)計(jì)和合成一個(gè)將要導(dǎo)入靶細(xì)胞的靶載體。該載體不僅含有需要插入的DNA序列，其兩端還含有與靶基因座上的序列相

23、同的核苷酸片段，即同源重組指導(dǎo)序列。將此載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過外源載體和內(nèi)源靶位點(diǎn)相同的核苷酸序列之間的同源重組，使外源DNA定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞的特定的基因座上。因此，同源重組是基因打靶技術(shù)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。 基因打靶技術(shù)的原理 第60頁(yè)，共85頁(yè)。 基因打靶技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)成就的基礎(chǔ)之上。 同源重組是指發(fā)生在減數(shù)分裂或者有絲分裂過程中，相同或者相似DNA序列間的重組。它通常通過一對(duì)同源分子非姐妹染色體間的斷裂而產(chǎn)生新的重組片斷。 干細(xì)胞是指一類具有無限分裂能力的細(xì)胞，他們能通過一次不對(duì)稱分裂在復(fù)制自己的同時(shí)產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是從著床前的哺乳類胎盤中分

24、離的全能干細(xì)胞，具有在體外不分化的增殖能力，經(jīng)過長(zhǎng)期體外培養(yǎng)后仍然具有分化成所有3種胚層的發(fā)育潛能。 第61頁(yè)，共85頁(yè)。 由于在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組的機(jī)率非常低，因此要把發(fā)生定點(diǎn)整合的細(xì)胞從大量隨機(jī)整合的細(xì)胞中篩選出來，就成了基因打靶要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。 基因打靶篩選系統(tǒng) 第62頁(yè)，共85頁(yè)。1. 正向選擇法： 正向選擇法只適用于在靶細(xì)胞中能正常表達(dá)的基因。其原理是：構(gòu)建一個(gè)特殊的載體，此載體所攜帶的正向選擇標(biāo)記基因本身沒有自己的表達(dá)調(diào)控因子，而只能利用靶位點(diǎn)上相應(yīng)的表達(dá)調(diào)控元件來啟動(dòng)表達(dá)，從而發(fā)揮選擇標(biāo)記的作用。根據(jù)所用的表達(dá)調(diào)控元件的不同，此法又可分為無啟動(dòng)子篩選法和無Poly(A)

25、篩選法。 第63頁(yè)，共85頁(yè)。2. 正負(fù)篩選法（positive and negative selection, PNS） 這是目前最為常用的方法。正負(fù)篩選法的基本方法是：構(gòu)建一種特殊的載體，該載體含有一段與靶基因同源的序列，在這段序列的某一外顯子中插入Neo基因作為正選擇標(biāo)記；在同源序列之外的3末端，或3，5兩個(gè)末端接上單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶HSVTK基因的序列作為負(fù)篩選標(biāo)記。經(jīng)酶切后使載體線性化，然后導(dǎo)入細(xì)胞中，進(jìn)行體外培養(yǎng)，并以藥物G-418和GANC作雙重篩選。 第64頁(yè)，共85頁(yè)。圖2：正負(fù)選擇載體的篩選原理：正負(fù)選擇DNA；：染色體DNA；、之間斜線部分為同源區(qū)；A、B：染色體

26、上的兩個(gè)基因 E：外源基因；neo：G418抗性基因，即正選擇基因；HSK-TK：負(fù)選擇基因第65頁(yè)，共85頁(yè)。3. PCR 篩選法 PCR法就是選擇性地?cái)U(kuò)增發(fā)生同源重組的DNA片段。發(fā)生同源重組時(shí)，由于兩個(gè)引物分別從相對(duì)的兩個(gè)方向同時(shí)擴(kuò)增，結(jié)果是DNA片段的拷貝數(shù)以指數(shù)形式增加，得到已知長(zhǎng)度的DNA雙鏈片段。與之相反的是，在隨機(jī)整合中，由于只有一個(gè)引物且為單方向，所以擴(kuò)增的片段拷貝數(shù)呈線性比例，片段為單鏈，長(zhǎng)度不定。運(yùn)用PCR法進(jìn)行篩選時(shí)，必須對(duì)每個(gè)細(xì)胞克隆分別進(jìn)行擴(kuò)增，因此較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力。 第66頁(yè)，共85頁(yè)。基因打靶的必備條件 1. 胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)：取自小鼠受精卵發(fā)育第4、5天的胚

27、泡細(xì)胞 。特點(diǎn)：能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性。 2.打靶載體Neo 陽(yáng)性篩選標(biāo)志： 新霉素抗性基因，neor基因插入用于打靶的外源DNA中（一個(gè)啟動(dòng)子缺失的正向選擇基因 neo neomycin ），當(dāng)重組后neo 基因也被插入到染色體，因此發(fā)生同源重組的ES細(xì)胞能在含G418的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。（同源重組）HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：?jiǎn)渭儼捳畈《荆╤erpes simplex virus）的胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase）基因，該基因產(chǎn)物可分解單核苷酸類似物而生成毒性產(chǎn)物，產(chǎn)生自殺效果。 （鑒別非同源重組）第67頁(yè)，共85頁(yè)。 將HSV-tk基因插入外源基因外側(cè)的載體序列中。當(dāng)外

28、源DNA與細(xì)胞染色體上的同源序列發(fā)生同源重組時(shí)，載體部分(含HSV-tk基因)是不能被整合到染色體中的。 如果ES細(xì)胞在此種培養(yǎng)基中被殺死，說明含有HSV-tk基因載體部分插入基因組。可能發(fā)生非同源重組。 如果細(xì)胞能在含單核苷酸類似物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說明含有HSV-tk基因載體部分沒有重組到染色體中；可能發(fā)生同源重組?；虼虬械谋貍錀l件 第68頁(yè)，共85頁(yè)。隨機(jī)整合同源重組第69頁(yè)，共85頁(yè)。（一）首先要獲得并體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞；（二）構(gòu)建基因打靶載體：把目的基因及其調(diào)控序列等與內(nèi)源靶序列同源的序列，都重組到帶有標(biāo)記基因的載體上；（三）用電穿孔或顯微注射等方法將打靶載體（重組體）導(dǎo)入ES細(xì)胞；

29、（四）重組體轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞的鑒定；基因敲除的基本程序第70頁(yè)，共85頁(yè)。（五）ES細(xì)胞胚胎移植和嵌合體雜交育種：通過顯微注射或者胚胎融合的方法將經(jīng)過遺傳修飾的胚胎干細(xì)胞引入受體胚胎內(nèi)，經(jīng)過遺傳修飾的胚胎干細(xì)胞仍然保持分化全能性，可以發(fā)育為嵌合體動(dòng)物的生殖細(xì)胞。使得經(jīng)過修飾的遺傳信息經(jīng)生殖系統(tǒng)遺傳，最終獲得的帶有特定修飾的突變體動(dòng)物為研究者提供了一個(gè)特殊的研究體系，可以在生物活體中研究特定基因的功能?；蚯贸幕境绦虻?1頁(yè)，共85頁(yè)?；蚯贸幕境绦? 、構(gòu)建打靶載體 第72頁(yè)，共85頁(yè)。2. 將打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞 選取發(fā)育第4-5天的胚胎干細(xì)胞(ES) ， 將打靶載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞。通

30、過打靶載體上的目的基因的同源序列與染色體組上的待敲除基因發(fā)生重組置換，以載體上的neo基因置換ES細(xì)胞基因組的目的基因，從而得到喪失了目的基因的ES細(xì)胞（基因敲除細(xì)胞；同源重組）。一般多采用顯微注射法將打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞。并篩選打靶成功的陽(yáng)性細(xì)胞基因敲除細(xì)胞。 第73頁(yè)，共85頁(yè)。3 、將基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡中，使其原胚泡中的細(xì)胞共同組成胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，形成嵌合胚胎。4 、將10-20個(gè)胚泡植入假孕小鼠子宮中。5 、嵌合體的雜交育種把胚胎注入假孕小鼠Southern印記把細(xì)胞注入胚泡第74頁(yè)，共85頁(yè)。6、雜和小鼠（+/-）間雜交，獲得子二代小鼠 （+/+、-/-、+/-）。7、篩選的

31、-/-、+/-子二代小鼠。（+/-）（+/-）（+/-）（-/-）（+/+）（+/-）（+/-）（+/-）（+/-）（+/+）（-/-）第75頁(yè)，共85頁(yè)。圖1:基因打靶流程圖第76頁(yè)，共85頁(yè)。 基因打靶的效率可以用相對(duì)效率和絕對(duì)效率來表示。所謂絕對(duì)效率是指發(fā)生同源重組的細(xì)胞數(shù)與處理的細(xì)胞數(shù)之比；相對(duì)效率是指發(fā)生同源重組的細(xì)胞數(shù)與發(fā)生隨機(jī)整合的細(xì)胞數(shù)之比。影響打靶效率的因素很多，歸納起來，主要有以下幾種： 基因打靶效率的影響因素 1 同源片段來源及長(zhǎng)度的影響 2 調(diào)控元件的影響 3 外源DNA導(dǎo)入方法的影響4 靶基因位點(diǎn)的影響第77頁(yè)，共85頁(yè)。1 基因功能和基礎(chǔ)理論研究方面 新基因功能的研究是當(dāng)前分子生物學(xué)蓬勃發(fā)展的一個(gè)重要領(lǐng)域。基因靶位操作技術(shù)通過定點(diǎn)改造基因組中特定基因，有可能在細(xì)胞水平上研究特定基因的功能和調(diào)控機(jī)制，從定點(diǎn)突變的干細(xì)胞獲得突變基因型個(gè)體，而在生物體水平了解基因的胚胎發(fā)育和生理功能。定點(diǎn)突變細(xì)胞和基因突變型個(gè)體的獲得，為闡明基因的功能提供了最直接的途徑。 基因打靶技術(shù)的應(yīng)