分子實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、蚯蚓纖溶酶的純化與鑒定姓名：程輝088316150張忠先088316118班級：科文08生物一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握從生物體中分離純化蛋白質(zhì)的基本原理。2、掌握蛋白質(zhì)分離的基本操作技術(shù)。3、掌握蛋白質(zhì)的抽提與沉淀技術(shù)鹽析。4、掌握蛋白質(zhì)脫鹽的方法和操作步驟。5、掌握凝膠層析分離蛋白質(zhì)的原理和技術(shù)步驟。6、掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的原理和操作技能。7、掌握酶活性的檢測方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：1）、蛋白質(zhì)鹽析：鹽在水中電離所形成的正負(fù)離子可吸引水分子，從而爭取蛋白質(zhì)分子上的水化膜，還可以中和部分電荷，致使蛋白質(zhì)聚集，從而達(dá)到鹽析沉淀蛋白質(zhì)的目的。2）、脫鹽：經(jīng)中性鹽析分離純化的蛋白質(zhì)溶液，尚需要

2、通過脫鹽及濃縮的方法才能得到所需要的蛋白質(zhì)。使用葡聚糖凝膠G-100裝柱過濾，即凝膠層析法脫鹽，效果比較好。經(jīng)過葡聚糖凝膠G-100柱，經(jīng)生理鹽水洗脫，一開始洗脫出來的為各種蛋白質(zhì)，隔一段時間洗脫出來的為鹽，從而達(dá)到使蛋白質(zhì)脫鹽的目的。3）、離子交換層析：其是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對溶液中各種離子的結(jié)和力不同而達(dá)到分離的目的。4）、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：在此系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）和少量巰基乙醇，單體蛋白質(zhì)或亞基的多肽鏈處于伸展?fàn)顟B(tài)，此時SDS以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合體。結(jié)果：1、所有的

3、SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體都具有相同的荷質(zhì)比。2、具有相同的構(gòu)象。因此蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與原來所帶的電荷和分子形狀無關(guān)。三、材料與試劑：1）、材料：處理過的蚯蚓、葡聚糖凝膠SephadexG-1002）、試劑：葡聚糖凝膠SephadexG-100、DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換劑、0.2M磷酸鹽緩沖液、60%飽和度的硫酸銨、PH=8.0的磷酸鹽緩沖液、1MNacl、檢測板、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、電極緩沖液、樣品緩沖液、30%Arc-bis貯液、10%過硫酸胺、TEMED原液、染色液CBBR250、脫色液。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、粗酶液的抽提：1）、

4、蚯蚓沖洗干凈（可先讓其吐泥1-2天），稱取2克左右。2）、放入兩倍體積的pH8.0的0.02M磷酸鹽緩沖液用勻漿器勻漿，置于4攝氏度條件下浸提1224小時。2、鹽析：1）、離心6000rpm,10min取上清，用60%飽和度的硫酸銨鹽析24小時。2）、離心10000rpm,2min取沉淀、進(jìn)行脫鹽3、脫鹽（凝膠過濾，采用葡聚糖凝膠SephadexG-100）：1）、凝膠處理：取國產(chǎn)SephadexG-100以蒸餾水浸泡過夜（必要時加熱溶脹），傾出上清液及微細(xì)及破損凝膠顆粒，即可準(zhǔn)備裝柱。2）、裝柱：取直徑0.81.2cm,長1720cm層析住，先將柱垂直放好，關(guān)閉出水口，自頂部緩緩加入稀薄的S

5、ephadexG-100懸液，待底部凝膠沉淀12cm，再打開出水口，繼續(xù)加入上述懸液，至凝膠沉積達(dá)15cm即可，關(guān)閉出水口。操作過程中注意防止產(chǎn)生氣泡與分層，表面需平整。如果表面出現(xiàn)凹陷現(xiàn)象，可用細(xì)玻璃棒輕輕攪動表面使凝膠自然沉降。3）、連接檢測器。4）、平衡：用45個柱體積的緩沖液洗脫。5）、加樣：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。加入蛋白質(zhì)樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動加到色譜柱的頂端。加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后，關(guān)閉出口。加入磷酸緩沖液到適當(dāng)高度。（注意：樣品的體積越小，濃度越大效果越好。）6）

6、、洗脫：啟動蠕動泵，打開下端出口，進(jìn)行洗脫，根據(jù)A280收集蛋白質(zhì)。4、離子交換層析（采用DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換劑）：1）、裝柱及緩沖液平衡：柱膠要求均一、粗短，膠面要求平整；柱裝好后用兩個柱床體積的緩沖液平衡2）、上樣：對樣品液的體積和濃度無要求。3）、洗脫（流速不超過0.75ml/min,采用梯度洗脫）：啟動蠕動泵，打開下端出口，進(jìn)行洗脫，根據(jù)峰值收集蛋白質(zhì)。4）、檢驗(yàn)收集的峰值蛋白質(zhì)活性。5、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對纖溶酶進(jìn)行純化和鑒定：1）、配置不連續(xù)的凝膠（5%濃縮膠，12%的分離膠，采用化學(xué)聚合法）：在模具中灌注分離膠后，小心地在分離膠的表面上加一層水

7、，封住膠面，以促使聚合并使凝膠表面平直。凝膠在3040攝氏度放置約40min1h后，可以看到一個界面，表示凝膠聚合。吸掉水用濃縮膠緩沖液貯液淋洗凝膠，然后灌注濃縮膠溶液，并插入與模具大小相同，與凝膠厚度相當(dāng)?shù)氖嶙?。為防止氣泡陷入，梳子?yīng)傾斜插入。聚合約40min1h。將聚合好的凝膠連同制膠模具裝置在電泳槽上，拔掉梳子，用電極緩沖液清洗樣品孔，然后將上下電極槽注滿電極緩沖液，檢查上槽無泄漏，即可加樣。2）、加樣：每空加30ul。（注意：（樣品處理）加樣前，樣品溶液與樣品緩沖液按1:1混合，100攝氏度煮沸35分鐘。）3）電泳：加樣完畢后，打開直流穩(wěn)定電源（負(fù)極接上槽，正極接下槽），80120v穩(wěn)

8、壓電泳至染料遷移至下端1cm處，停止電泳。4）剝膠、染色、脫色五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1）、脫鹽：rr-r數(shù)據(jù)體積：吸收值：1.98ml0.0055.7ml1.5077.5ml0.4792、離子交換層析：數(shù)據(jù)OD值0.1300.0920.0880.1690.1750.1450.2350.2600.224V/ml02.54.67.611.21416.116.817.5OD值0.2420.2270.2200.2050.30.3500.2100.1870.636V/ml2021.622.323.625263033.135OD值0.3500.2740.3420.3750.1540.1250.1100.2290.187V/ml36.437.438.639.641.24243.24547.2OD值0.1520.2750.2200.110V/ml49535455經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：在本次試驗(yàn)的最后一步電泳加樣時，我們誤將放于臺子上的樣品當(dāng)成樣品緩沖液來使用，導(dǎo)致首次加樣失敗。原因主要是平時我們在實(shí)驗(yàn)室中做實(shí)驗(yàn)時太心急，未能很好的聯(lián)系老師上課時所講的內(nèi)容，樣品緩沖液和樣品有著