滅活劑、保護(hù)劑和免疫佐劑介紹

1、滅活劑、保護(hù)劑和免疫佐劑介紹 滅活劑 滅活 inactivation指破壞微生物的生物學(xué)活性、繁殖能力和致病性，但盡可能不影響其免疫原性。或指破壞診斷血清或待檢血清中的補(bǔ)體活性，以避免補(bǔ)體對(duì)診斷試驗(yàn)的干擾作用。 滅活劑 inactivator用于滅活微生物的化學(xué)試劑或藥物。甲醛溶液：規(guī)程（2000）中的26種滅活疫苗 滅活機(jī)理：甲醛的醛基作用于微生物蛋白質(zhì)的氨基產(chǎn)生羥甲 基胺，作用于羧基形成亞甲基二醇單酯，作用于 羥基生成羥基甲酚，作用于巰基形成亞甲基二醇 滅活濃度：多數(shù)為 滅活原則：低濃度、短時(shí)間而又能達(dá)到徹底滅活目的； 必要時(shí)可在滅活后加入硫代硫酸鈉，以中斷其反應(yīng)。 烷化劑（alkylat

2、ing agent）滅活機(jī)制： 1. 烷化DNA分子中的鳥(niǎo)嘌呤或腺嘌呤等，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯(lián)，因改變DNA的結(jié)構(gòu)而破壞其功能，妨礙RNA的合成，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂。 2. 與酶系統(tǒng)和核蛋白起作用而干擾核酸代謝。優(yōu)點(diǎn)：能破壞病毒的核酸芯髓，使病毒完全喪失感染力，而 不損害其蛋白衣殼，保留其保護(hù)性抗原。烷化劑類滅活劑： 乙?；蚁﹣啺罚ˋEI)、二乙烯亞胺(BEI) 、縮水甘油醛1、乙?；蚁﹣啺罚∟-acetyl ethylenimine，AEI）淡黃色澄明液體，有輕微氨臭味，能與水或醇任意混合。04可保存1年，在-20可保存2年AEI功能基團(tuán)是乙烯亞胺基，可用于口蹄疫滅活苗。口蹄疫

3、病毒液: 終濃度，308h, 加2硫代硫酸鈉阻斷2、二乙烯亞胺（binary ethylenimine，BEI）市購(gòu)商品為的BEI溶液，在04可保存1個(gè)月;終濃度0.02%, 加入2硫代硫酸鈉中斷滅活。3、縮水甘油醛（glycidaldchyde，GDA）大腸桿菌、噬菌體、新城疫病毒滅活效果優(yōu)于甲醛。本品易揮發(fā)，水溶液含量為1531mg/mL。04 3個(gè)月含量漸下降，約半年失效；20只能保存10d。 4、-丙酰內(nèi)酯（propiolactone）又名羥基丙酸-內(nèi)酯無(wú)色有刺激氣味的液體，水溶液應(yīng)密封于玻璃瓶中5保存水中溶解度37，能與丙酮、醚和氯仿任意混合對(duì)皮膚、粘膜及眼有強(qiáng)刺激性，對(duì)動(dòng)物有致癌性

4、。病毒滅活后，能保持良好的免疫原性主要用于狂犬病滅活疫苗的制備。影響滅活作用的因素 滅活劑特異性 微生物種類與特性 滅活劑濃度 滅活時(shí)間 酸堿度（pH） 有機(jī)物的存在 保護(hù)劑（protector）又稱穩(wěn)定劑（stabilizer）：指一類能防止生物活性物質(zhì)在冷凍真空干燥時(shí)受到破壞的物質(zhì)。 分類：（根據(jù)其作用機(jī)理）滲透劑：如二甲基亞砜（DMSO）、甘油和蔗糖等非滲透劑：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白質(zhì)等（根據(jù)其分子量大?。└叻肿游镔|(zhì)、低分子物質(zhì)。（按其化學(xué)性質(zhì)）復(fù)合物、糖類、鹽類、醇類、酸類和聚合物 復(fù)合物 脫脂乳、明膠、蛋白質(zhì)、蛋白胨、糊精、血清、甲基纖維素等糖類 蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖

5、、果糖等鹽類 乳酸鈣、谷氨酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、醋酸銨、硫代硫酸鈉等醇類 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸類 檸檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合物 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等一些常用的冷凍干燥保護(hù)劑 分 類 保 護(hù) 劑 疫苗凍干保護(hù)劑組成1. 營(yíng)養(yǎng)液： 可修復(fù)因凍干而受損的細(xì)胞，使凍干制品含有一定量水分； 可促進(jìn)高分子物質(zhì)形成骨架，使凍干制品呈多孔的海綿狀， 增加溶解度2. 賦形劑： 防止低分子物質(zhì)的碳化和氧化，保護(hù)活性物質(zhì)不受加熱影響 使凍干制品形成多孔性、疏松的海綿狀物，增加溶解度3. 抗氧化劑： 抑制凍干制品中的酶作用，增加生物活性物質(zhì)在凍干后貯存期間的穩(wěn)定性，如維生素

6、C、維生素E和硫代硫酸鈉等。 防止活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶而導(dǎo)致生 物活性物質(zhì)的損傷； 降低細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差、防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)水結(jié)晶，以保 持細(xì)胞的活力； 保護(hù)或提供細(xì)胞復(fù)蘇所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于生活力的復(fù) 蘇和迅速修復(fù)自身。 凍干保護(hù)劑作用機(jī)制影響保護(hù)劑效能的因素1保護(hù)劑種類 2保護(hù)劑組分濃度3保護(hù)劑配制方法4保護(hù)劑酸堿度（pH）獸醫(yī)生物制品常用的保護(hù)劑：15%蔗糖（乳糖）脫脂乳保護(hù)劑 2明膠蔗糖保護(hù)劑3聚乙烯吡咯烷酮乳糖保護(hù)劑 4SPGA保護(hù)劑 免疫佐劑 免疫佐劑( Immunologic Adjuvant)概念當(dāng)一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合或同時(shí)注射于動(dòng)物體內(nèi)，能非特異性地

7、改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮其輔佐作用的物質(zhì) 可以增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。作用特點(diǎn)： 明顯增強(qiáng)抗原性微弱的物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。 用最少的抗原和最少的接種次數(shù)，產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答。免疫佐劑作用方式： 改變正常免疫機(jī)能，吸引大量巨噬細(xì)胞以吞噬抗原； 改變抗原的構(gòu)型，使抗原物質(zhì)降解，并加強(qiáng)其免疫原性； 延長(zhǎng)抗原在組織內(nèi)的貯存時(shí)間，使抗原緩慢降解和緩釋，并發(fā)揮免疫系統(tǒng)的細(xì)胞間協(xié)同作用（巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞，T細(xì)胞與B細(xì)胞）。 抗原遞呈（antigen presentation） 抗原尋的（antigen targeting）免疫調(diào)節(jié)（immune modulation）

8、佐劑免疫作用機(jī)理抗原遞呈： 指抗原分子遞呈給T細(xì)胞的方法。佐劑與疫苗聯(lián)合使用，有助于抗原性物質(zhì)在胞內(nèi)被加工，被MHC分子特異性的結(jié)合、保護(hù)、運(yùn)輸并遞呈給效應(yīng)細(xì)胞?？乖瓕さ模╝ntigen targeting） 指抗原傳遞給免疫系統(tǒng)中適當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞的效率。包括吸引巨噬細(xì)胞到達(dá)組織部位、活化吞噬細(xì)胞、促進(jìn)抗原與細(xì)胞受體的結(jié)合等有重要作用。免疫調(diào)節(jié)（immune modulation） 是指任何可以修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)抗原或表位進(jìn)行加工的機(jī)制。通過(guò)這種機(jī)制，可以改變特異性免疫應(yīng)答的本質(zhì)或強(qiáng)度。T細(xì)胞有Th1和Th2兩個(gè)亞類。同一抗原和不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應(yīng)。因此，通過(guò)篩選特定的佐劑，可

9、以達(dá)到誘導(dǎo)正確的免疫應(yīng)答的目的。 1. 按佐劑物理性質(zhì) 顆粒型佐劑 非顆粒型佐劑2. 按佐劑的生物學(xué)性質(zhì)（即Ballanti分類法） 微生物及其組分 非微生物物質(zhì)3. 按佐劑在體內(nèi)存留的時(shí)間 貯存型佐劑（depot type adjuvant） 非貯存型（non-depot type adjuvant）佐劑的分類（一）顆粒性佐劑1鹽類佐劑 氫氧化鋁膠、明礬、磷酸鋁等。2油水乳劑佐劑 弗氏完全佐劑（Freunds complete adjuvant, FCA）、弗 氏不完全佐劑（ FIA）和礦物油白油佐劑。3免疫刺激復(fù)合物佐劑（ISCOM）4蜂膠佐劑（propolis）5脂質(zhì)體佐劑（liposo

10、mes）。6其他：MF59佐劑、微囊化佐劑（microencapsulation)、 硬脂酰酪氨酸佐劑和菊粉等。（二）非顆粒性佐劑1肽類佐劑（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、 去胞壁酰多肽、脂肽和免疫調(diào)節(jié)多肽。2表面活性分子類佐劑：海藻糖合成衍生物（TDM）3核酸及其衍生物類佐劑：合成核苷酸聚合體、CpG 4含硫復(fù)合物類佐劑：左旋咪唑5碳水化合物高分子類佐劑：香菇多糖、DEAE-葡聚糖6細(xì)胞因子類佐劑（cytokine）：IL-2、IL-4和-IFN等。7脂質(zhì)分子類佐劑：脂多糖、vit A和vit E等脂溶性維生素8其他：霍亂毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破傷風(fēng)類 毒素

11、（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；維生素B12等。鋁鹽類佐劑 1氫氧化鋁膠 (鋁膠）合成方法: （1）用鋁粉加燒堿合成法 （2）用明礬加碳酸鈉合成法 （3）用三氯化鋁與氫氧化鈉合成 注意事項(xiàng)： 氫氧化鋁吸附力較強(qiáng)，所以要用軟化水或去離子水洗滌。 氫氧化鋁膠為兩性化合物，過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)失去膠態(tài)。故要 掌握好化合時(shí)的pH值。 貯存鋁膠應(yīng)放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，嚴(yán)密封蓋，貯放期不超過(guò)3個(gè)月。 鋁膠室溫保存，以免破壞膠態(tài)。 是指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。 該類佐劑主要在抗原尋的過(guò)程中起作用，使抗原在注射部位保持穩(wěn)定，為抗原在淋巴系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)提供載體，增加單核細(xì)胞的形成和積聚。油水乳

12、劑疫苗的免疫效力高低，直接與乳化作用的好壞和乳劑成分的質(zhì)量等有關(guān)。一種好的乳劑疫苗應(yīng)是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘度低，顆粒均勻，穩(wěn)定性良好，呈乳白色?！叭閯笔菍⒁环N溶液或干粉分散成細(xì)小的微粒，混懸于另一不相溶的液體中所成的分散體系。被分散的物質(zhì)稱為分散相（內(nèi)相），承受分散相的液體稱連續(xù)相（外相），兩相間的界面活性物質(zhì)稱為乳化劑。 油乳佐劑乳化劑 天然乳化劑：阿拉伯膠、海藻酸鈉、蛋黃以及煉乳 人工合成乳化劑離子型 陰離子類乳化劑：十二烷基磺酸鈉和硬脂酸鋁 陽(yáng)離子類乳化劑：氯化苯甲烴銨、溴化十六烷三甲基非離子型：月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和單油酸脂、 司本-80、吐溫-80白油佐劑國(guó)

13、內(nèi)外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4 7號(hào)或10號(hào)白油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):無(wú)色無(wú)味50運(yùn)動(dòng)粘度7m2s左右紫外吸收A250-350，紫外消光系數(shù)12108；單環(huán)芳烴與雙環(huán)芳烴含量低于，無(wú)多環(huán)芳烴；小鼠腹腔注射或家免皮下注射白油，觀察60d，表現(xiàn)正常。乳劑配方與乳化方法（1）劑在水中法： 將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加入，可直接生成O/W乳劑。若欲得W/O型，可繼續(xù)加入油，直到發(fā)生變型。該法通常用勻漿器或膠體磨，高速攪拌而得到較好的乳劑。（2）劑在油中法： 將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，繼

14、續(xù)加入至變型。該法制成的乳劑，一般均勻顆粒直徑在左右，比較穩(wěn)定。免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用的佐劑配制: (1)弗氏佐劑：礦物油75%85，乳化劑1525%，混合后經(jīng)除菌過(guò)濾而成為FIA；如向其中加入m1死結(jié)核桿菌即為FCA。使用時(shí)，將含抗原的水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即可成為均勻的乳劑。(2) 白油佐劑：9份油和1份司本-80混合后加2吐溫-80和12%硬脂酸鋁，經(jīng)高壓滅菌后備用，注射前將配好的油佐劑與抗原水相1：1混合，強(qiáng)力振搖，可配制成性狀良好的乳劑疫苗。大量生產(chǎn)乳劑疫苗: 油相: 94白油、6司本-80、1%2硬脂酸鋁，滅菌即可； 水相：抗原液加24%吐溫-80 乳化：將油相與水相按3：

15、12：1比例配制，先緩速混合，再 通過(guò)膠體磨充分乳化，可獲得穩(wěn)定的油包水乳劑苗。 或者將粘稠的W/O乳劑疫苗，再加2吐溫-80生理鹽 水，通過(guò)攪拌或膠體磨乳化，可制成雙相乳劑疫苗。 油乳劑檢驗(yàn)（1）粘度測(cè)定：流出法、Saybolt粘度計(jì)法。吸管內(nèi)口直徑為，室溫下吸滿lml乳劑，垂直放出所需時(shí)間作為粘度單位。以 2-6 S為合格，不得多于10-15 S。（2）乳劑穩(wěn)定性測(cè)定： 加速老化法：疫苗于37貯存10-30d不破乳。 離心加速分層法：3000rpm離心15min不分層，相當(dāng)于保存1年以上不破乳。蜂膠佐劑（ Propolis） 是一種優(yōu)良的天然藥物 供免疫佐劑用的蜂膠外觀應(yīng)具備其固有的特征

16、具有廣泛的生物活性和藥理作用（抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎） 具有免疫增強(qiáng)作用： 能保持抗原特性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)抗體的 產(chǎn)生，提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫力。 （1）蜂膠的處理： 蜂膠（4以下貯存） 粉碎過(guò)篩 按1：4（W/V）加95乙醇 室溫浸泡2448h 冷卻 過(guò)濾或離心取上清 透明栗色純凈蜂膠浸液 4以下保存?zhèn)溆?除去干渣計(jì)算出浸液中含蜂膠量。 （2）蜂膠佐劑疫苗的制備： 滅活菌液或病毒液，加入蜂膠乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂膠10mg，邊加邊搖蕩，成為乳濁狀，即可。 蜂膠佐劑疫苗制備方法：細(xì)胞因子類免疫佐劑 （cytokine）細(xì)胞因子的概念 是機(jī)體的各種細(xì)胞在其生命周期

17、中所釋放的具有不同生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，是免疫細(xì)胞間相互作用的調(diào)節(jié)信號(hào)。該類物質(zhì)相互誘生，相互影響，構(gòu)成一個(gè)巨大的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)（cytokine network）系統(tǒng)，各種細(xì)胞借助自己所釋放的細(xì)胞因子完成各自的功能，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。細(xì)胞因子類免疫佐劑 （cytokine）細(xì)胞因子的分類（根據(jù)生物活性）1. 經(jīng)典的細(xì)胞因子：淋巴毒素（LT）、腫瘤壞死因子（TNF） 干擾素（INF）2. 對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫具有調(diào)節(jié)作用的因子： 白細(xì)胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF）1多效性： 免疫調(diào)節(jié)作用的多樣性 作用方式的非特異性：不表現(xiàn)抗原特異性2靶細(xì)胞的多樣性：構(gòu)成機(jī)體細(xì)胞細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)3多源性：4高

18、效性：有免疫激素（immune hormone）之稱5快速反應(yīng)性：即對(duì)激發(fā)因素的迅速反應(yīng)細(xì)胞因子的作用特點(diǎn) 多樣性Pleiotropism 交叉性Redundancy 協(xié)同性Synergy 對(duì)抗性Antagonism1作為免疫佐劑，提高疫苗的免疫效果2作為免疫治療劑，預(yù)防和治療某些病原感染3通過(guò)基因重組，構(gòu)建新型基因工程疫苗 IL-2-AIV-HA重組痘病毒細(xì)胞因子的應(yīng)用幾種重要的細(xì)胞因子 白細(xì)胞介素-2（IL-2） 白細(xì)胞介素-4（IL-4） 白細(xì)胞介素-12（IL-12） -干擾素（IFN-）誘導(dǎo)或增強(qiáng)CTL活性,增強(qiáng)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN和CSF協(xié)同刺激B細(xì)胞增值及分泌免疫球蛋白促進(jìn)少突

19、膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和增殖及增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬殺傷能力 刺激物：抗原或 促有絲分裂原 （ConA） T細(xì)胞分泌 糖蛋白，含133aa 分子量15-35kDa 7030min及pH 值2-9范圍內(nèi)穩(wěn)定 無(wú)抗原特異性。刺激物：抗原或絲裂原；由Th細(xì)胞產(chǎn)生分子量1520kDa，有23個(gè)糖基化部位，140個(gè)氨基酸一種強(qiáng)有力的佐劑候選因子 是目前發(fā)現(xiàn)的唯一主要由B細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，與IL-2有協(xié)同作用，所以曾被稱為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子（CLMF）和天然殺傷細(xì)胞刺激因子（NKSF）。 糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）兩個(gè)亞單位構(gòu)成，兩個(gè)亞單位完全由不同的基因所編碼，只有

20、結(jié)合為一個(gè)完整的分子時(shí)才能發(fā)揮生物學(xué)活性。 IL-12活性高于IL-2和IFN，在極低濃度時(shí)就有顯著活性，對(duì)滅活疫苗、腫瘤和寄生蟲抗原具有有效的佐劑活性。 IL-12誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1應(yīng)答反應(yīng)尤為引人注目，可望用于主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的疫苗佐劑。 目前，我國(guó)已開(kāi)發(fā)研制成功豬白細(xì)胞干擾素（swine interferon）。該制品系用雞新城疫病毒誘導(dǎo)健康豬白細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、滅活病毒、除菌、分裝等工藝制成。用于防治豬流行性腹瀉。 CpG DNA，CpG OND CpG DNA：指含有非甲基化CpG（胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸）基序的脫氧核糖核酸DNA。 CpG基序（ motif）：指以非甲基化的CpG為基元

21、構(gòu)成的回文序列，其堿基排列大多為5-Pur Pur- CG- Pyr Pyr-3，具有較強(qiáng)免疫活性，稱為免疫刺激序列（ISS，immunostimulatory DNA sequences）。 CpG OND：含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸 。細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞的分化CpGDNA的免疫刺激效應(yīng)（作用機(jī)制）溫度能量酸化內(nèi)體小泡DNA-PKTLR-9胞質(zhì)內(nèi)受體蛋白有絲分裂原蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等信號(hào)通路 引起B(yǎng)細(xì)胞分化，分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子和表達(dá)MHCII、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止B細(xì)胞的凋亡。 直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，分泌IL-12、INF-r等T

22、hl樣為主的細(xì)胞因子，并刺激MHCII、B7-1、B7-2的表達(dá)。 在IL-12協(xié)同下激活NK細(xì)胞，殺傷活性增強(qiáng)，并分泌IFN-r，IFN-r反過(guò)來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的激活。 協(xié)同刺激抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞分化，在Thl細(xì)胞因子的作用下，顯著增強(qiáng)獲得性細(xì)胞免疫-優(yōu)良的T細(xì)胞免疫佐劑。1 CpGDNA對(duì)多種免疫細(xì)胞有激活作用 含有GACGTT-基序的CpG OND小鼠淋巴細(xì)胞含有AGCGTG基序的CpG OND小鼠的NK細(xì)胞含有GTCGTT基序的CpG OND人淋巴細(xì)胞含有ATCGAT基序的CpG OND雞外周血單核細(xì)胞含有GTCGTT基序的CpG OND牛B細(xì)胞的增殖和分

23、泌IL-6 PBMC分泌IL-6、IL-l2和IFN-r；含有ATCGAT基序的CpG OND豬 (Kamstrup，2001)2CpG OND免疫刺激作用具有物種和細(xì)胞特異性CpGODN的體內(nèi)效應(yīng)與應(yīng)用1對(duì)天然免疫系統(tǒng)的刺激活性 （1）抗感染 ：?jiǎn)魏死钏固貤U菌、利什曼原蟲、 瘧原蟲、單純皰疹病毒 （2）抗腫瘤活性 ：黑色素瘤 2. 對(duì)特異性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用疫苗佐劑 （1）CpG ODN對(duì)蛋白質(zhì)抗原的作用 能夠增強(qiáng)許多抗原誘導(dǎo)的Thl型反應(yīng)HbsAg、牛皰疹病毒I型糖蛋白 D、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、瘧疾的多肽、麻疹病毒、放線桿菌 胸膜肺炎、流感病毒疫苗、貓皰疹病毒、貓細(xì)小病毒和貓白血病病

24、毒 （2）CpG ONG對(duì)DNA疫苗的作用3過(guò)敏性疾病治療 霍亂毒素（CT） 大腸桿菌不耐熱毒素（LT） 破傷風(fēng)類毒素（TT）基因工程減毒素 （一）霍亂毒素（CT） 良好的粘膜免疫佐劑 由A和B兩個(gè)區(qū)構(gòu)成的蛋白 B區(qū)具有主要免疫學(xué)作用，內(nèi)含5種獨(dú)立的非共價(jià)連接的B亞單 位（CTB），無(wú)毒性，可與細(xì)胞結(jié)合。 A區(qū)是CT的生物學(xué)活性部分，具有酶活性。 仙臺(tái)病毒CT；CTB流感病毒HA；鏈球菌表面蛋白CTB； CT毒素A和B兩個(gè)亞單位的表達(dá)質(zhì)粒DNA作為佐劑與DNA疫苗聯(lián)和應(yīng)用，還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（如IFN-）和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（如IL-4），具有很強(qiáng)的佐劑作用。 （二）大腸

25、桿菌不耐熱毒素（LT） 大腸桿菌LT毒素有A和B兩個(gè)亞單位，有一定抗原性 A亞單位基因工程點(diǎn)突變體LT(R192G) 無(wú)毒性作用，但仍保留了其佐劑效應(yīng) 可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部粘膜免疫反應(yīng)。利用基因突變技術(shù)，構(gòu)建的A和B兩個(gè)亞單位的表達(dá)質(zhì)粒DNA聯(lián)合應(yīng)用，也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（IFN-）和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（IL-4）。而且，LT毒素表達(dá)質(zhì)粒作為佐劑，可協(xié)助DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，有望成為一種新型免疫增強(qiáng)劑。免疫刺激復(fù)合物（ immunostimulating complex， ISCOM） ISCOM由抗原物質(zhì)與由皂樹(shù)皮提取的一種糖苷Quil A和膽固醇按1:

26、1:1混合后自發(fā)形成的一種具有較高免疫活性的脂質(zhì)小泡。 ISCOM直徑40nm，每個(gè)ISCOM約含1012分子的蛋白質(zhì)。 ISCOM應(yīng)用于多種細(xì)菌、病毒和寄生蟲病的疫苗，具有產(chǎn)生“全面”免疫應(yīng)答的效力，可長(zhǎng)期增強(qiáng)特異性抗體應(yīng)答。 ISCOM能有效地通過(guò)粘膜給藥，從而可以用于抗呼吸道感染。 目前，獸用ISCOM疫苗已在國(guó)外投放市場(chǎng)。 制劑生產(chǎn)的基本技術(shù)菌種與毒種選育技術(shù)生產(chǎn)用菌種和毒種是獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)的關(guān)鍵，也是生物制品質(zhì)量的直接保證。獸醫(yī)生物制品菌種和毒種篩選的基本原則是：根據(jù)所生產(chǎn)生物制品的用途、使用方法、使用方式、生產(chǎn)過(guò)程和條件等因素，從細(xì)菌和病毒的安全性、免疫原性、遺傳穩(wěn)定性及生產(chǎn)實(shí)用

27、性等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)和篩選。生物制品菌（毒）種標(biāo)準(zhǔn) 生物學(xué)特性明顯、歷史清楚遺傳學(xué)上相對(duì)純一與穩(wěn)定反應(yīng)原性與免疫原性優(yōu)良毒力應(yīng)在規(guī)定范圍以內(nèi)強(qiáng)菌（毒）種選育毒力測(cè)定：MLD（最小致死量）、LD50（半數(shù)致死量）、CELD50（雞胚半數(shù)致死量）、TCID50（細(xì)胞半數(shù)感染量）抗原性測(cè)定：抗體效價(jià)、保護(hù)力穩(wěn)定性測(cè)定綜合判定，凍干保存：凍感后菌種4，毒種-20弱菌（毒）種選育自然弱毒株的選育：ND LaSota 株、MD FC126株經(jīng)典方法誘變： 化學(xué)：烷化劑物理：熱和干燥生物途徑：非易感動(dòng)物、適應(yīng)細(xì)胞、雜交細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌繁殖規(guī)律與生長(zhǎng)條件：二分裂，4個(gè)期：遲緩期，對(duì)數(shù)增殖期，穩(wěn)定期，衰退期。細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)：水、碳、氮及無(wú)機(jī)鹽環(huán)境條件：氣體、溫度、pH、滲透壓培養(yǎng)基：水、肉湯、蛋白胨、瓊脂、明膠、酵母浸夜、鹽類和化學(xué)試劑 培養(yǎng)