煙草植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2223

1、煙草葉片的組織培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)通過配制3種不同的培養(yǎng)基來實(shí)現(xiàn)煙草種子苗葉片誘導(dǎo)、分化及植 株再生從而深刻理解植物細(xì)胞的全能性、學(xué)習(xí)和掌握植物組織培養(yǎng)技術(shù)，二、實(shí)驗(yàn)原理植物組織培養(yǎng)是從20世紀(jì)30年代初期發(fā)展起來的一項(xiàng)生物技術(shù)。由于其 擁有占地少、繁殖系數(shù)大等特點(diǎn)，現(xiàn)以在全世界的園林植物尤其是花卉的種苗 繁育上得到廣泛應(yīng)用。本文著重介紹組織培養(yǎng)技術(shù)的理論原理、操作過程、生 產(chǎn)技術(shù)以及經(jīng)濟(jì)核算等方面的內(nèi)容，使大家對組織培養(yǎng)在園林植物尤其是花卉 的種苗繁育的應(yīng)用有所了解，為以后的實(shí)際操作提供依據(jù)。在植物組織培養(yǎng)中，主要目標(biāo)是誘導(dǎo)愈傷組織形成和形態(tài)發(fā)生，使一個(gè)離 體的細(xì)胞、一塊組織或一個(gè)器官的細(xì)

2、胞，通過脫分化形成愈傷組織，并由愈傷 組織再分化形成植物體。從一塊外植體形成典型的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個(gè) 時(shí)期：起動(dòng)期、分裂期和形成期。培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)是組培法育苗中的關(guān)鍵步驟。根據(jù)理論與實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，對不 同種類的花卉及不同的取材部位，需設(shè)計(jì)出相適應(yīng)的配方，并從中篩選出最佳 者。繼代芽增殖培養(yǎng)：很多花卉植物經(jīng)過2-6周的培養(yǎng)即可分化出大量的不定 芽。根據(jù)情況可以將這些增殖了大量新芽的外植體重新分割進(jìn)行幾代培養(yǎng)，以 擴(kuò)大繁殖規(guī)模直至滿足繁殖需要為止。三、實(shí)驗(yàn)材料植物材料：煙草植株藥品： 激素（2,4-D、NAA、6-BA濃度均可）、1N NaOH、1N HCl 蒸餾水、70%酒精、0.01%升汞儀

3、器：1玻璃杯、1玻璃棒、1pH試紙(5.5-9.0) 1瓶無菌水、1個(gè)無菌燒杯、1母液濃縮母液配制1升成規(guī)定量倍數(shù)稱取量體積培養(yǎng)基吸包無菌濾紙、1個(gè)無菌白瓷板、培養(yǎng)瓶若干移液器、微波爐、滅菌器、 超凈工作臺、酒精燈、解剖刀、鑷子四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟4.1 MS培養(yǎng)基母液的配制編號種類1大量元素KNO3190010190001000100NH4NO316501016500MgSO4 - 7H2O370103700KH2PO41701017002CaCl2 - 2H2O44010440010001003微量元素MnSO4 4H2O22.31002230100010ZnSO4 7H2O8.610086

4、0H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4 7H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.54鐵鹽Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有機(jī)物甘氨酸2.010010050010鹽酸毗哆醇0.510025鹽酸硫銨素0.11005煙酸0.5100256肌酸100100500050010汪意:1.大量元素按照使用時(shí)高10倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量后，除CaCl22H2O 單獨(dú)配制外，其余化合物混合在500ml燒杯中加適量蒸餾水溶解，用玻璃棒攪拌促溶，

5、倒入1000ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽注明化合物名稱（或 編號），濃縮倍數(shù)，配制日期和配制者姓名，CaCl22H2O配制同上置于另一小口瓶中。微量元素母液的配制按要求濃縮100倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量除鐵鹽（FeSO4-7H2O和Na2- EDTA.2H2 O）作為一組單獨(dú)配制外，其余化合物可混合置于燒杯內(nèi)加少量蒸餾水溶解后， 定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽。3.鐵鹽配制將FeSO4-7H2O和Na2-EDTA.2H2O分別溶于450ml蒸餾水中，加熱，（很重要）不斷攪拌，溶解后，兩液混合，調(diào)PH至5.5加水定容至1000ml，置于

6、小口瓶中，貼 上標(biāo)簽。有機(jī)物母液配制，按母液要求濃縮50倍，除蔗糖按3%單獨(dú)臨時(shí)稱量外，其余分別稱量 后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽。母液最好在24C的冰箱中貯存，特別是有機(jī)類物質(zhì)，貯存時(shí)間不宜過長，無機(jī)鹽母液 最好在一個(gè)月內(nèi)用完，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀產(chǎn)生，就不能再使用。制備母液和營養(yǎng)培養(yǎng)基時(shí)，所用蒸餾水或無離子水必須符合標(biāo)準(zhǔn)要求，化學(xué)藥品必須 是高純度的（分析純）。稱量藥物采用高靈敏度的天平，每種藥品專用一藥匙。.生長調(diào)節(jié)劑母液配制：為了操作方便，節(jié)約時(shí)間，生長調(diào)節(jié)劑也可如同配制母液一樣，先配成原液，這樣配制 培養(yǎng)基時(shí)只要稍加計(jì)算，按需要量取即可。不同藥品在配制

7、時(shí)若不溶于水，可用少量不同的溶劑先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸 （IAA），赤霉素（GA3），2, 4-D等生長素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然 后加水，如溶解不完全再加熱。激動(dòng)素（KT）和6-芐基嘌吟（BA）可溶于少量1mol/L的 鹽酸中，葉酸需用少量稀氨水溶解。稱取50mg生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升則含有 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)0.5mg，配制后一般要求在低溫（04 C）保存，配制培養(yǎng)基時(shí)如每升（1000ml）需添加的生長調(diào)節(jié)劑物質(zhì)為0.5mg時(shí)，則取1ml母液即可。42培養(yǎng)基配制和滅4.2.1培養(yǎng)培養(yǎng)基配制程序本次實(shí)驗(yàn)使用（1 ）愈傷組織

8、誘導(dǎo)及其幼芽分化培養(yǎng)基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（3）生根培養(yǎng)基：MS+NAA 0.2 mg/L。注意事項(xiàng)：上述培養(yǎng)基均在MS固體培養(yǎng)基溶化后降低到50左右后，加入相應(yīng)激素所得，MS固體培養(yǎng)基的配置過程在此不作過多贅述上述培養(yǎng)基均附加3%蔗糖，0.8%瓊脂，pH5.8，培養(yǎng)溫度252C，光照強(qiáng)20001X。（一）.母液吸取量的計(jì)算配制培養(yǎng)基的升數(shù)公式1：母液吸取量=母液體積（C C）X母液濃縮倍數(shù)培養(yǎng)基要求的含量公式2：母液吸取量=（各種生長調(diào)節(jié)劑）母液每CC的含量（二

9、）各種母液按順序編號排列A.大量元素；B.CaCl2.2H2O ； C.微量元素；D.鐵鹽； E.有機(jī)物；F.生長素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA稱取50mg , NAA用少量95%酒精溶解 后加蒸餾水定容至1000ml； G.細(xì)胞分裂素、激動(dòng)素（KT）配制0.5mg/ml的KT稱 50mgKT用少量1N HCL溶解后，加蒸餾水定容至100ml。（三）配制培養(yǎng)基（1000ml）瓊脂:稱取57g瓊脂，加入300ml蒸餾水，加熱溶解直至完全溶解為止.蔗糖3%用質(zhì)量較好的白糖代替，稱取30g白糖，溶于溶有瓊脂的300ml蒸餾水 中。各種母液的吸?。ㄅ囵B(yǎng)基1L）（1）用50ml量筒量取

10、大量元素母液（A）和CaCl22H2O母液（B）各100ml（2）分別用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），鐵鹽（D）母液各10ml（3）用10ml移液管或吸管吸取有機(jī)物（H） 10ml（4）移取激素將上述溶液全部混合于瓊脂與蔗糖溶液中，混合均勻后，加熱至80r左右，用酸度計(jì) 或精密PH試紙測定培養(yǎng)基的PH 一般要求5.86.0，過酸過堿則用1N NaoH和1N HCL調(diào) 整。分裝：用一個(gè)接有膠管的分裝器趁熱裝培養(yǎng)基，1000ml培養(yǎng)基分裝到25-30個(gè)三角瓶 中，每個(gè)三角瓶約30ml左右（一般占試管、三角瓶容量1/41/3左右）注：培養(yǎng)基勿碰瓶 壁。包裝：分裝好的三角瓶用封口膜包扎好，標(biāo)

11、明培養(yǎng)基代號即可進(jìn)行滅菌。用具清理和洗滌：各種母液按原位置擺整齊，用過的量筒，移液管、燒杯、鋁鍋等用水 洗滌干凈，然后按次序放回原處。4.2.2培養(yǎng)基的滅菌高壓蒸汽滅菌（高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法）具體操作步驟：高壓鍋放水至平把架；把包扎好的培養(yǎng)基裝入高壓鍋；蓋上熱壓鍋蓋，上緊螺帽（注意對角擰緊螺帽）關(guān)上氣閥和安全閥.然后接通電源.壓力計(jì)升至0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，排除冷空氣（此步很重要）。排除冷空氣后，關(guān)閉放氣閥，待壓力升到O.llMPa位置時(shí)，開始計(jì)算滅菌時(shí)間，具體方 法：當(dāng)壓力鍋指針升至0.12MPa時(shí)，關(guān)閉電源，待指針下降至O.llMPa時(shí)接通電源，不斷 重復(fù)此操作過程，維持20分

12、鐘。滅菌時(shí)間達(dá)到20分鐘后，除去電源，打開放氣閥（注意要逐漸放氣）待高壓鍋內(nèi)的空氣完 全排除后，打開熱壓滅菌鍋蓋（注意對角扭松螺帽）稍待冷后再把培養(yǎng)基取出。經(jīng)過滅菌的營養(yǎng)培養(yǎng)基不宜放置太長，應(yīng)盡早使用，但為了在使用前能檢查培養(yǎng)基有 無微生物污染，可將培養(yǎng)基置于25C下保存4天，如果培養(yǎng)基需要貯存較長時(shí)間，可在 4 C低溫下保存。滅菌高壓鍋有大型臥式、中型立式、小型手提式等多種型號和規(guī)格，無論哪種型號，操 作的步驟都很相近。進(jìn)水f放進(jìn)培養(yǎng)基f蓋緊鍋蓋f關(guān)上放汽閥f檢查安全閥f接上加熱源f待壓力升至 0.05MPa時(shí)排鍋內(nèi)冷空氣，關(guān)上放氣閥f 0.11MPa（121C）下滅菌2025分鐘，保持穩(wěn)定

13、壓 力f除熱源f逐漸打開放氣閥f鍋內(nèi)空氣排除完后f開放鍋蓋f稍冷后取出培養(yǎng)基。4.3植物材料表面滅菌消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng) 基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手 續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。1,接種步驟：第一步：清理材料ff流水沖洗f加入吐溫（或洗衣粉）清洗f自來水沖洗 第二步：對材料的表面浸潤滅菌：70%酒精浸10-30秒ff無菌水 第三步：滅菌劑處理ff 0.1-1%升汞5-8 min （或其他滅菌劑）第四步：無菌水進(jìn)行沖洗注意事項(xiàng)：,滅菌劑一般要臨時(shí)配制，現(xiàn)配現(xiàn)用.升汞可以短

14、期儲存.,對去除較容易的滅菌劑滅菌后無菌水沖洗3-4次，升汞一般5-8次，每次不少于3 min,滅菌時(shí)要輕輕的攪拌，消除氣泡，使消毒更徹底.滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。.滅菌液要充分浸沒材料2.無菌操作可按以下步驟進(jìn)行：（1）在接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時(shí)打開其內(nèi)紫外線燈進(jìn)行殺菌；（2）在接種前20分鐘，打開超凈工作臺的風(fēng)機(jī)以及臺上的紫外線燈；（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；（4）上工作臺后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺面；（5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端 處，

15、對培養(yǎng)皿要過火烤干；（6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等；材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。（如葉片切成 0.5cm2的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?-2片葉原基）在接種過程 中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。（7）接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要 大強(qiáng)度滅菌一次。4.4煙草葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽的分化于超凈臺中徹底沖洗外植體；70%酒精消毒3min；無菌水沖洗3遍，每 遍3mini；將煙草葉片殘留的水分用滅過菌的濾紙吸干；白瓷板上用消毒的 解剖刀分割為1-1.5cm2的

16、小塊；接入相應(yīng)的MS培養(yǎng)基上，每瓶接種4-5 塊。接入（1）中培養(yǎng)。約23d后，葉片外植體卷曲、增厚、膨脹；15d后外植體脫分化形成疏松絮狀淺黃綠色的愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率 為 100%；30d后，從葉片外植體產(chǎn)生的疏松愈傷組織上分化出許多淺黃綠色芽點(diǎn)；60d后，不僅從愈傷組織上分化出越來越多幼芽，芽誘導(dǎo)頻率（芽數(shù)/塊愈 傷組織）為2535，而且還可觀察到，該愈傷組織較早分化產(chǎn)生的幼芽葉片呈現(xiàn)不同程度白化（或缺綠）。但此時(shí)若將此缺綠幼芽切下，轉(zhuǎn)接至不加2,4-D的幼芽增殖培養(yǎng)基（2）上，35d后即可恢復(fù)正常，缺綠癥狀消失，并可不斷增殖，發(fā)育成綠色健壯 的小苗。誘導(dǎo)生根及移栽取約34cm長的無

17、根小苗接種于生根培養(yǎng)基（3）中，約78d后，幾乎所 有外植體均從其基部產(chǎn)生白色幼根，根誘導(dǎo)頻率為35,部分在培養(yǎng)基表面的 根具大量白色根毛。當(dāng)試管苗長至56cm高時(shí)，打開瓶口，在散射光下放置 2d后取出，洗去根部殘留培養(yǎng)基，種植于經(jīng)過消毒的珍珠巖、泥炭土和菜園土 等量混合的基質(zhì)中，成活率可達(dá)95%以上。數(shù)據(jù)記錄煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)情況編號每瓶接種數(shù)愈傷組織誘導(dǎo)率愈傷組織狀態(tài)染菌率煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)情況編號每瓶接種數(shù)愈傷組織誘導(dǎo)率愈傷組織狀態(tài)染菌率煙草葉片愈傷組織再生植株情況編號分化率每個(gè)愈傷組織分化芽數(shù)分化情況染菌率煙草葉片誘導(dǎo)生根情況編號生根率生根情況再生植株分化根數(shù)染菌率五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分

18、析1、將觀察結(jié)果加以描述和統(tǒng)計(jì)；對出現(xiàn)誘導(dǎo)失敗和污染的情況要加以認(rèn)真分析，找到原因。2、繪圖或照片六、思考題1、外植體脫分化形成愈傷組織的過程中，哪些激素起作用？2、如果時(shí)間允許，請?jiān)O(shè)計(jì)下游誘導(dǎo)愈傷組織分化和再生植株的實(shí)驗(yàn)附錄1常用植物激素類別名 稱縮寫詞分子量使用濃度范圍母液配制說明生長素2，4一二氯苯氧乙 酸2, 4D221.00.001 10mg/L生長素通常用NaOH 溶液滴至溶解成溶 液。能溶于乙醇IAA易被植 物細(xì)胞所氧 化。故培養(yǎng) 基中很少單 獨(dú)使用。a 一萘乙酸NAA186.20.001 10mg/L吲哚一3 一乙酸IAA175.20.001 10mg/L吲哚一3 一 丁酸IBA203.20.001 10mg/L細(xì) 胞 分 裂6芐基氨基嘌吟BA225.2分裂素通常能溶于稀NaOH, 含水乙醇或稀鹽酸玉米素不耐 熱，不能高