細(xì)胞器線粒體的分離與觀察

1、細(xì)胞器線粒體的分離與觀察高熹 1120152430 （李安一）（北京理工大學(xué)生命學(xué)院16121501班）摘要：差速離心法是交替使用低速和高速離心， 用不同強(qiáng)度的離心力使具有不同 質(zhì)量的物質(zhì)分級(jí)分離的方法。此法適用于混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大組分的 分離。離心分離出細(xì)胞核與線粒體，進(jìn)行染色，對(duì)細(xì)胞核和線粒體的形態(tài)進(jìn)行觀 察并記錄。關(guān)鍵詞：差速離心法；細(xì)胞核；線粒體；實(shí)驗(yàn)。1引言差速離心主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收 集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類(lèi)推，達(dá)到 分離不同大

2、小顆粒的目的。線粒體是真核細(xì)胞特有的，司能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。細(xì)胞種的能源物質(zhì)一 一糖、脂肪、部分氨基酸在此進(jìn)行最終的氧化，并通過(guò)偶聯(lián)磷酸華生成ATP供給細(xì)胞生理活動(dòng)之需。對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的研究通常是在離體線粒體上進(jìn)行 的。制備線粒體用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行差速離心的方法。在一給定的離心場(chǎng)中（對(duì)于所使用的離心機(jī)，就是選用一定的轉(zhuǎn)速），球形顆粒的沉降速度取決 于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心某一時(shí)間內(nèi)，組 織勻降中的各種細(xì)胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位 置。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離 心管底部，從而分批收

3、集。細(xì)胞器中最先沉降的是細(xì)胞核，其次是線粒體，其他 更輕的細(xì)胞器和大分子可依次再分離。懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度 上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性， 在pH7.2的條件下，亞細(xì)胞組分不容易重新 聚集，有利于分離。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意樣品保持 4,避免酶失活。線粒體的鑒定用詹納斯2W舌染法。詹納斯綠B （janus green B ）是對(duì)線粒體專(zhuān)一的活細(xì)胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引而 堆積在線粒體膜上。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠 色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無(wú)色。Giemsa染液為天青色素、伊

4、紅、次甲藍(lán)的混合物，本染色液最適于血液涂 抹標(biāo)本、血球、瘧原蟲(chóng)、立克次體以及骨髓細(xì)胞、脊髓細(xì)胞等的染色。染前用蛋 白酶等進(jìn)行處理，然后再用姬姆薩染液染色，在染色體上，可以出現(xiàn)不同濃淡的 橫紋樣著色。姬姆薩染液可將細(xì)胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色，胞漿染成粉紅色，在光鏡下呈現(xiàn)出清晰的細(xì)胞及染色體圖像。2實(shí)驗(yàn)器材及材料實(shí)驗(yàn)材料大鼠肝臟。實(shí)驗(yàn)儀器高速離心機(jī)，解剖刀剪，小燒杯，冰浴盤(pán)，漏斗，尼龍織物，玻璃均漿器 圖1玻璃勻漿器玻璃勻漿器的作用：讓玻璃管與柱塞之間微小的縫隙和細(xì)微的凹凸咬合，將其柱塞轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，產(chǎn)生碾切作用，使生物細(xì)胞和其他較硬的細(xì)胞組織被輕易的碾碎。(1)洗干凈，烘干，太臟用酸泡洗。(2)選擇合適

5、的勻漿緩沖液，配置好。(3)在冰上勻漿，勻的次數(shù)依實(shí)驗(yàn)樣品和目的而定。(4)勻漿完畢，倒出樣品。實(shí)驗(yàn)試劑(1)生理鹽水。(2) 1 %詹納斯綠B染液,生理鹽水配制。(3)蔗糖Tris 鹽酸緩沖液(pH7.4) :0.25mol/L 蔗糖 + 0.01mol/L Tris- 鹽酸緩沖液(pH7.4) ,0.1mol/L Tris10ml,0.1mol/L 鹽酸 8.4m,加重蒸水到 100ml,加蔗糖到0.25mol/L。蔗糖為密度梯度離心用 D(+)蔗糖,0.34mol/L 蔗糖 + 0.01mol/L Tris- 鹽酸緩沖液(pH7.4)配制如上，加蔗糖到 0.34mol/L。(4)固定液：

6、甲醇一冰醋酸(9: 1)。(5) Giemsa染液:Giemsa粉0.5g ,甘油33ml。先往Giemsa粉中加少量甘 油在研缽內(nèi)，研磨至無(wú)顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56左右保溫2h,令其充分溶解，最后加甲醇混勻，成為 Giemsa原液，保存于棕色瓶中。用時(shí)吸出少量 用1/15mol/L磷酸緩沖液作1020倍稀釋。1/15mol/L磷酸緩沖液(pH6.8): 1/15mol/L KH 2P050ml,1/15mol/L Na 2HP(450ml。3實(shí)驗(yàn)步驟(1)制備大鼠肝臟細(xì)胞勻漿實(shí)驗(yàn)前大鼠空腹12h,擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用 濾紙吸干。稱(chēng)取肝組織1g,剪碎，用預(yù)冷到

7、04 C的0.25mol/L緩沖蔗糖溶 液洗滌數(shù)次。然后在04 C條件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L緩沖蔗糖 溶液將肝組織勻漿，蔗糖溶液分?jǐn)?shù)次添加，勻漿用雙層尼龍織物過(guò)濾備用。 注意 盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時(shí)間，整個(gè)分離過(guò)程不宜過(guò)長(zhǎng)，以保持組分 生理活性。(2)先將9ml 0.34mol/L緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心的加 入9ml肝勻漿使其覆蓋在上層。用冷凍控溫高速離心機(jī)按照?qǐng)D2順序進(jìn)行差速離 心。圖2差速離心順序圖(3)分離物鑒定細(xì)胞核：取細(xì)胞核沉淀一滴涂片，在甲醇冰醋酸溶液中固定15min,充分吹干，滴Giemsa染液(原液1020倍稀釋)染色10分鐘。自

8、來(lái)水沖洗，吹干， 鏡檢。觀祭結(jié)果。線粒體：取線粒體沉淀涂片，注意勿太濃密，不待干即滴加1 %詹納斯綠B染液染色20min,蓋上蓋玻片鏡檢。觀察結(jié)果。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3細(xì)胞核染色觀察圖圖4細(xì)胞核染色局部放大圖圖5線粒體染色觀察圖圖6線粒體染色局部放大圖圖7借鑒線粒體染色圖5結(jié)果分析圖3和圖4中我們可以清楚的看到分離成單個(gè)的被染成紫顏色的細(xì)胞核，易于辨認(rèn)。而在線粒體染色圖5和圖6中，線粒體染色可能出現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)失敗，無(wú)明顯可辨的染色后的線粒體。在圖7借鑒的照片中，我們可以看見(jiàn)成單顆裝橢圓形 的線粒體。6實(shí)驗(yàn)反思本次實(shí)驗(yàn)成敗關(guān)鍵在于推片，即制作臨時(shí)涂片時(shí)，可取一片載玻片作推片， 將推片自液滴左側(cè)向右側(cè)移動(dòng)，使液滴均勻地附著在兩片之間。細(xì)胞核的推片和 染色較為成功，可以觀察到較好的結(jié)果。而線粒體組觀察較為模糊不清，分析原 因?yàn)?，染色時(shí)候，滴加染液后只計(jì)時(shí)，沒(méi)有時(shí)刻保持觀察樣品，室內(nèi)溫度較高， 導(dǎo)致染色液干結(jié)，干結(jié)后影響了觀察。后來(lái)又用清水沖洗玻片，未有明顯改善。綜上，由線粒體染色中較為失敗的玻片得出反思， 以后實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)又無(wú)需 操作的步驟不能放任不管，