免疫組化相關(guān)步驟

1、免疫組化操作步驟、儀器設(shè)備18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.水浴鍋、試劑PBS緩沖液(ph7.27.4)：NaC137mmol/L,KCl2.7mmol/L,Na2HPO44.3mmol/L,KH2PO41.4mmol/L.0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液(CB,ph6.0,1000ml)：檸檬酸三鈉3g,檸檬酸0.4g。0.5mol/LEDTA緩沖液(ph8.0)：700ml水中溶解186.1gEDTA&8226;2H2O，用10mmol/LNaOH調(diào)至ph8.0,加水至1000ml.1mol/L的TBS緩沖液(ph8.0)：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至ph

2、8.0,加水1000ml。酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。3%甲醇一H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制風(fēng)裱劑：a.甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(ph9.0-9.5)等量混合b油和TBS(PBS)配制TBS/PBSPH9.0-9.5,適用于熒光纖維鏡標(biāo)本;ph7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本、操作流程1、脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60C恒溫箱中烘烤20分鐘。a組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘b無(wú)水乙醇中浸泡五分鐘c95%乙醇中浸泡五

3、分鐘d75%乙醇中浸泡五分鐘2、抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：A抗原熱修復(fù)a高壓熱修復(fù)在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液(ph6.0).蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。b沸熱修復(fù)電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(ph6.0)至95C左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。c微波爐加熱在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(ph6.0)至沸騰后將組織芯片放入，斷電，

4、間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb等B酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37C，消化時(shí)間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP.Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等3、免疫組化染色

5、SP法脫蠟、水化PBS洗2-3次各5分鐘3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘PBS洗2-3次各5分鐘抗原修復(fù)PBS洗2-3次各5分鐘滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體滴加I抗50卩1,室溫靜置1小時(shí)或4C過夜或37C1小時(shí)4C過夜后需在37C復(fù)溫45分鐘PBS洗3次每次2分鐘滴加II抗45-50卩1，室溫靜置或37C1小時(shí)II抗中可加入0.05%的tween-20.PBS洗3次各5分鐘DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度PBS或自來水沖洗10分鐘蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化(17)自來水沖洗10-15分鐘(18)脫水、透明、封片、鏡檢。4、SA

6、BC法脫蠟、水化(2)PBS洗2次各5分鐘用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次抗原修復(fù)PBS洗5分鐘滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體滴加I抗50卩1,室溫靜置1小時(shí)或4C過夜或37C1小時(shí)PBS洗3次各2分鐘滴加生物素化II抗，20C-37C20分鐘PBS洗3次各2分鐘(11)滴加試劑SABC20C-30C20分鐘PBS洗4次各5分鐘DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化問題解答1、染色過強(qiáng)a抗體濃度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)降低抗體滴度、抗體孵育時(shí)間：室溫1小時(shí)或4度過夜b孵育溫度過高超過37度一般在室溫20-度2

7、8顯色時(shí)間過長(zhǎng)或濃度過高顯色時(shí)間不超過分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)2非特異性背景染色操作過程中沖洗不充分每步?jīng)_洗次每次分鐘組織中含過氧化物酶未阻斷可再配置新鮮封閉孵育時(shí)間延長(zhǎng)c組織中含內(nèi)原性生物素正常非免疫動(dòng)物血清再封閉d血清蛋白封閉不充分延長(zhǎng)血清蛋白封閉時(shí)間3、染色弱a抗體濃度過低、孵育時(shí)間過短提高抗體濃度、孵育時(shí)間不能少于60分鐘b試劑超過有效使用時(shí)間應(yīng)更換試劑c操作中添加試劑時(shí)緩沖液未瀝干每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋(應(yīng)防止切片干燥)d室溫太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-分6鐘0或4度冰箱過夜e蛋白封閉過度封閉不要超過12分鐘4、染色陰性a操作步驟錯(cuò)誤應(yīng)重試設(shè)陽(yáng)

8、性對(duì)照b組織中無(wú)抗原設(shè)陽(yáng)性對(duì)照以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果c一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤仔細(xì)確定一抗二抗種屬無(wú)誤免疫組化操作要點(diǎn)及技巧固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購(gòu)置前注意說明書。固定液：飽和苦味酸，甲醛，冰醋酸，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。液：即高碘酸鈉賴氨酸多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。組織脫水，透明：時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則在切片時(shí)容易碎片

9、，切不完整。操切片時(shí)展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌２伲ǎ┛酒?分鐘或7過夜，溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng)，抗原容易丟失。（）蠟塊及切片的保存：最好在C保存（）脫片問題：多聚賴氨酸為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，的多聚賴氨酸溶液可按稀釋成的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（和）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在：丙酮溶液中浸泡分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。（）滅活內(nèi)源性酶：系統(tǒng)：雙氧水滅活；系統(tǒng)：滅活。（8）暴露抗原：對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，

10、這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度（不同抗體的最佳修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說明書）。對(duì)于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。（）封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉（）抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對(duì)于稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。（）背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含。的洗，特別是在顯色之前要多洗。（2返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如）或的飽和溶液返藍(lán)。（3顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。

11、（）在整個(gè)操作過程中，切片千萬(wàn)不能干燥，否則會(huì)有非特異性染色。（5拍照：）更換樣品時(shí)，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動(dòng)！所有的樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要一會(huì)用高倍鏡，一會(huì)用低倍鏡，來回切換物鏡。2）數(shù)碼相機(jī)必須設(shè)置為手動(dòng)曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時(shí)間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數(shù)碼相機(jī)的自動(dòng)白平衡功能給關(guān)掉3）免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。測(cè)量其灰度應(yīng)在25左0右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機(jī)自動(dòng)白平衡在起作用。另外一個(gè)因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使

12、燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍(lán)。免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵問題：.組織處理恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在組織細(xì)胞材料準(zhǔn)備的過程中，不僅要求保持組織細(xì)胞形態(tài)完整，更要保持組織細(xì)胞的抗原性不受損或彌漫，防止組織自溶。如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失，即使用很靈敏的檢測(cè)抗體和高超的技術(shù)，也很難檢出所需的抗原，反而往往由于組織的壞死或制片時(shí)的刀痕擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。：）組織及時(shí)取材和固定組織標(biāo)本及時(shí)的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應(yīng)盡快的進(jìn)行取材，最好內(nèi)，取材時(shí)所用的刀應(yīng)銳利，要一

13、刀下去切開組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓，組織塊大小要適中，一般在xx,切記取材時(shí)組織塊寧可面積大，千萬(wàn)不能厚的原則，也就是說組織塊的面積可以大到X，但組織塊的厚度千萬(wàn)不能超過，否則將不利于組織的均勻固定。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時(shí)間內(nèi)迅速凝固。從而完好的保存抗原和組織細(xì)胞形態(tài)。對(duì)于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但除非是專項(xiàng)科研項(xiàng)目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點(diǎn)，因?yàn)椴±淼脑\斷和鑒別診斷都是在常規(guī)病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進(jìn)行免疫組化的染色，而染色的常規(guī)組織處理是采用：0的%中性緩沖福爾馬林或）%緩沖多聚甲醛）倍于組織體積進(jìn)行組織固定，利

14、用其滲透性強(qiáng)，對(duì)組織的作用均勻進(jìn)行固定，但組織固定時(shí)間最好在內(nèi)，一般固定時(shí)間不應(yīng)超過小時(shí)。隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)組織抗原的檢出強(qiáng)度將逐漸降低。2）組織脫水、透明、浸蠟組織經(jīng)固定后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原則是脫水透明要充分但不能過，浸蠟時(shí)間要夠，溫度不能高，否則造成組織的硬脆使組織切片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對(duì)免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無(wú)水酒精脫水和二甲苯透明的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，正常大小的組織無(wú)水酒精脫水h次，二甲苯透明h次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度不要超過C。切片組織得到很好處理后在進(jìn)行切片之前還應(yīng)對(duì)玻璃片進(jìn)行處理，由于我們

15、檢測(cè)抗原是多種多樣的，因染色操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，有些抗原是要進(jìn)行各種抗原修復(fù)處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，要求在貼片前對(duì)載玻片作適當(dāng)處理，必須在清洗干凈的玻片上進(jìn)行粘合劑的處理以防脫片。多聚左旋賴氨酸一般采用分子量300左0右0的0.5多%聚賴氨酸最好，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在0溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以用于多種組織化學(xué)、免疫組化及分子學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用，粘貼效果最好，但價(jià)格稍貴。2）明膠硫酸鉻鉀法將明膠加熱溶于蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入硫酸鉻鉀攪勻充分

16、溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中i取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價(jià)格便宜、方法簡(jiǎn)單，任何實(shí)驗(yàn)都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意,如果液體變藍(lán)或粘稠狀停用。氨丙基乙氧基甲硅烷此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入丙酮稀釋的中，浸泡，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的晾干即可。用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無(wú)皺摺、無(wú)刀痕，如有上述問題的切片在進(jìn)行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，切片厚度一般為Mm切好的切片在0溫箱中過夜，注意烤片的溫度不宜過高，否則易使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標(biāo)記定位彌漫現(xiàn)象。免疫組化染色免疫組

17、化染色試劑盒采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原。免疫組化染色步驟：石蠟切片脫蠟和水化后，用沖洗三次，每次分鐘3。根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。每張切片加滴或過氧化酶阻斷溶液試劑，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育分鐘。沖洗X。甩去液，每張切片加滴或的非免疫性動(dòng)物血清試劑，室溫下孵育分鐘。甩去血清，每張切片加滴或的第一抗體用戶自選，室溫下孵育分鐘或。c過夜，建議參閱每種抗體的說明書。沖洗x5。甩去液，每張切片加滴或生物素標(biāo)記的第二抗體（試劑），室溫下孵育分鐘。沖洗X。甩去液，每張切片加滴或鏈霉菌抗生物素過氧

18、化物酶溶液試劑，室溫下孵育分鐘。沖洗X。甩去液，每張切片加滴或新鮮配制的或溶液，顯微鏡下觀察分鐘，陽(yáng)性顯色為棕色或紅色。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，分化，氨水或沖洗返藍(lán)。如果用顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固；如果用顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。蠟免疫組化染色注意事項(xiàng)蠟蠟蠟免疫組化染色方法已不是什么很難的問題，操作步驟簡(jiǎn)單也易掌握，但要染好免疫組化，其中方法的技巧將是每位操作者在實(shí)際工作中不斷摸索和探討的事，但最基本的應(yīng)從以下方面加以注意：蠟（1）去除內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素蠟一般我們進(jìn)行免疫組化標(biāo)記的都是一些生物體組織，其中自身含有一定量的內(nèi)源酶和內(nèi)源

19、性生物素，而免疫組化各種染色大部分是用過氧化物酶來標(biāo)記抗體的，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，而組織中的內(nèi)源性酶同樣也能催化底物，使其顯色，這就影響免疫組化的特異性，所以在標(biāo)記抗體的過氧化酶進(jìn)人組織切片之前就應(yīng)設(shè)法將組織內(nèi)的內(nèi)源性各種酶滅活，以保證免疫組化染色在特異性情況下進(jìn)行。蠟1，去蠟除內(nèi)源酶蠟常用的去除內(nèi)源性酶的方法是3%過氧化氫水溶液。但在含有豐富血細(xì)胞的標(biāo)本中，由于其中含有大量的具有活性的過氧化物酶，能與過氧化氫反應(yīng)，出現(xiàn)氣泡現(xiàn)象，易對(duì)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生一些不良影響，但用3%過氧化氫的方法，能夠去除大部分內(nèi)源性酶，即使有些血細(xì)胞在顯色后也出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)，但由于其形態(tài)結(jié)構(gòu)與組織細(xì)

20、胞不同，也易鑒別，而且此方法比較通用易操作，但應(yīng)注意過氧化氫的濃度不能過高，一般為一時(shí)間不宜過長(zhǎng)，最好室溫。去除內(nèi)源性生物素在正常組織細(xì)胞中也含有生物素，特別是肝、脾、腎、腦，皮膚等組織中，在應(yīng)用親和素試劑的染色中，內(nèi)源性生物素易結(jié)合卵白素，形成卵白素一生物素復(fù)合物，導(dǎo)致假陽(yáng)性，所以在采用生物素方法染色前也可以將組織切片進(jìn)行0.0卵1白%素溶液室溫處理，使其結(jié)合位點(diǎn)飽和，以消除內(nèi)源性生物素的活性。3）滅活堿性磷酸酶最常用的方法是將左旋咪挫以每毫升加加入底物液中并保持值為，能除去大部分內(nèi)源性堿性磷酸酶，對(duì)于仍能干擾染色的酸性磷酸酶可用酒石酸抑制。（2）抑制非特異性背景著色非特異性著色最常見的情況

21、是抗體吸附到組織切片中高度荷電的膠原和結(jié)締組織成分上，而出現(xiàn)背景著色，為了防止這種現(xiàn)象，最好用特異性抗體來源的同種動(dòng)物滅活的非免疫血清在特異性抗體之前進(jìn)行處理，以封閉荷電點(diǎn)，不讓一抗與之結(jié)合，但這種方法一般實(shí)驗(yàn)室很難實(shí)現(xiàn)，一般常見實(shí)用的血清是羊血清或牛血清白蛋白在室溫下作用即可，但應(yīng)注意此種結(jié)合是不牢固結(jié)合，所以最好不要沖洗，傾去余液直接加一抗，對(duì)于多克隆抗體來講，易產(chǎn)生背景著色，在稀釋特異性抗體時(shí)可采用含非免疫血清的的液。（）緩沖液免疫組化染色標(biāo)記是對(duì)生物體組織抗原進(jìn)行標(biāo)記，抗原抗體最適合的值為，最常用的是磷酸緩沖液簡(jiǎn)易配法：蒸餾水中分別加入、。但如果是采用堿性磷酸酶作為標(biāo)記物底物的方法時(shí)可

22、以用緩沖液比較好。C）抗原修復(fù)經(jīng)甲醛固定的部分組織細(xì)胞，可使免疫組化標(biāo)記敏感性明顯降低，這是因?yàn)榧兹┕潭ㄟ^程中形成醛鍵或保存的甲醛會(huì)形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時(shí)，有些抗原需先進(jìn)行修復(fù)或暴露。抗原修復(fù)方法可分為化學(xué)方法和物理方法。化學(xué)方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制濃度與消化時(shí)間要適度。常用的物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。在選用這三種加熱法時(shí)，浸泡切片的緩沖液的離子強(qiáng)度和值、加熱的溫度和時(shí)間均影響著抗原修復(fù)效果。目前最常用的修復(fù)方法有如下凡種：1胰蛋白酶主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的修復(fù)。一般使用濃度為，7作用。配法：胰蛋白酶加入到無(wú)水水溶液中溶解后即可。）胃蛋

23、白酶主要用于細(xì)胞間質(zhì)或基底膜抗原的修復(fù)。一般濃度為，7作用。配法：胃蛋白酶溶于水溶液中。）熱引導(dǎo)的抗原決定簇修復(fù)，對(duì)大多數(shù)的抗體有益，尤其是對(duì)核抗原的修復(fù)作用更加明顯，最常用的抗原修復(fù)液是的枸櫞酸緩沖液和的緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實(shí)現(xiàn)的。抗原修復(fù)液的值非常重要，有效的抗原修復(fù)值要比修復(fù)液的化學(xué)成分更重要，同樣的修復(fù)液隨著值的升高染色的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，但最佳值范圍為，對(duì)于大多數(shù)抗原這個(gè)范圍的值都能進(jìn)行有效的修復(fù)，有些抗體如-則在值和更為有效。作為通用修復(fù)液堿性值的修復(fù)液要比酸性的有效，而對(duì)固定很長(zhǎng)時(shí)間舊的存檔組織，酸性值的修復(fù)液則優(yōu)于堿性的修復(fù)液，所以兩種抗原修復(fù)液可作為相互替補(bǔ)

24、的進(jìn)行抗原修復(fù)。在進(jìn)行過程中應(yīng)防止切片的干燥，加熱時(shí)必須達(dá)到規(guī)定的溫度，保溫時(shí)間要足夠，對(duì)于一些不要抗原修復(fù)的抗體最好不要采用處理，否則對(duì)染色無(wú)益，但有些抗體則需要利用多種修復(fù)聯(lián)合應(yīng)用。方法有：水浴加熱法將脫蠟人水后的切片放人盛有修復(fù)的容器中，放人加熱煮沸水中，當(dāng)修復(fù)液溫度達(dá)到5左右時(shí)計(jì)時(shí)，自然冷卻，洗X次。微波加熱法將切片放入修復(fù)液中微波加熱使溫度在6左右，計(jì)時(shí)，在微波爐中停留，室溫自然冷卻，洗X次。3于高壓加熱法:將修復(fù)液在高壓鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中（要使修復(fù)液淹沒切片于開始噴氣時(shí)蓋上壓力閥。計(jì)時(shí),冷水沖至室溫取出切片，洗X次。（5顯色免疫組化染色的顯色是最后的關(guān)鍵問題，一般

25、辣根過氧化物酶的檢測(cè)系統(tǒng)選用或顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色。但要得到最佳的顯色效果，必須在鏡下嚴(yán)格控制，以檢出物達(dá)到最強(qiáng)顯色而背景無(wú)色為最終點(diǎn)，尤其顯色時(shí)間短著色淺，時(shí)間長(zhǎng)背景又深，都將影響結(jié)果判斷，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)在配制完后最長(zhǎng)宜放置以內(nèi)，過時(shí)不能使用，加到組織切片時(shí)作用時(shí)間最長(zhǎng)不宜超過最好在內(nèi)，否則不管有無(wú)陽(yáng)性都應(yīng)終止反應(yīng)。對(duì)一些含有內(nèi)源性酶較高的組織用顯色時(shí)極易出現(xiàn)背景色更應(yīng)盡早在鏡下控制，以達(dá)到最佳的分辨效果（棕色）。顯色系統(tǒng)（紅色）的弊端是易溶于有機(jī)溶劑，所以封片時(shí)應(yīng)以水性封片劑為主，同時(shí)染色的切片也不能久存。如果是堿性磷酸酶最好選用作為顯色系統(tǒng)（結(jié)果染為藍(lán)黑色）。（）結(jié)果判斷免疫組化的結(jié)果判斷有兩種方

26、法：一是對(duì)以檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)來定性在如核抗原的標(biāo)記，判斷方法是以一個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞的百分比，再取10個(gè)相同視野算取平均指數(shù)。另一種方法以染色陽(yáng)性強(qiáng)度和陽(yáng)性檢出率相結(jié)合而定，一般陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在02為5陰性，25為5十0，50為7十5十，75以上為十十十。此種判定方法容易出現(xiàn)人為誤差現(xiàn)象。有條件的實(shí)驗(yàn)室最好能用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)定量分析更為準(zhǔn)確。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結(jié)果判斷更標(biāo)準(zhǔn)，但各單位采取的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，所以判斷標(biāo)準(zhǔn)化問題還有待長(zhǎng)期實(shí)踐中病理學(xué)術(shù)界商討判定標(biāo)準(zhǔn)。中常見的抗原表達(dá)模式有以下幾種：1細(xì)胞漿內(nèi)彌漫性分布，多數(shù)胞漿型抗體的反應(yīng)如此，如細(xì)胞角蛋白，和波

27、形蛋白等；2細(xì)胞核周的胞漿內(nèi)分布，其判別要點(diǎn)是細(xì)胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如多克隆抗體的染色；3胞漿內(nèi)局限性點(diǎn)狀陽(yáng)性，如抗體的染色；4細(xì)胞膜線性陽(yáng)性，大多數(shù)淋巴細(xì)胞標(biāo)記的染色如此，如、；）細(xì)胞核陽(yáng)性，如及雌、孕激素受體蛋白、等。一種抗體可同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞漿和細(xì)胞膜的陽(yáng)性表達(dá)，如可呈膜性和胞漿內(nèi)彌漫性陽(yáng)性反應(yīng)；抗體可同時(shí)呈膜性和胞漿內(nèi)點(diǎn)狀陽(yáng)性反應(yīng)等。（）對(duì)照片的設(shè)置免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對(duì)照，沒有對(duì)照的免疫組化結(jié)果是毫無(wú)意義的。對(duì)照包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和自身對(duì)照。在實(shí)踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對(duì)照，而用含抗原的正常組織作陽(yáng)性對(duì)照，這種自我對(duì)照具有節(jié)約的意義。觀察染色結(jié)果

28、時(shí)，先觀察對(duì)照組織的結(jié)果，如陽(yáng)性對(duì)照組織中陽(yáng)性細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性，陰性對(duì)照細(xì)胞呈陰性，內(nèi)源酶陰性，背景無(wú)非特異性染色時(shí)，表明本次實(shí)驗(yàn)的全部試劑和全過程技術(shù)操作準(zhǔn)確無(wú)誤，待檢組織中的陽(yáng)性細(xì)胞也就是可信的正確結(jié)果。免疫組化染色中對(duì)照片的設(shè)置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測(cè)每一個(gè)抗體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，常設(shè)的對(duì)照如下，一般實(shí)驗(yàn)最常用的只選第二種方法。）空白對(duì)照陰性對(duì)照第一抗體由或非免疫血清取代。）陽(yáng)性對(duì)照用已知含有要檢測(cè)抗原的切片作陽(yáng)性對(duì)照。）回收實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照已知抗原與相應(yīng)的第一抗體混合，發(fā)生結(jié)合沉淀，再用此沉淀抗體復(fù)合物進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性。）替代對(duì)照用于第一抗體同種動(dòng)物的血清

29、或無(wú)關(guān)抗體代替第一抗體結(jié)果為陰性。）自身對(duì)照在同一切片上，應(yīng)將不同組織成分中的陽(yáng)性或陰性結(jié)果與檢測(cè)的目的物對(duì)照比較。如、在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽(yáng)性，可以間質(zhì)細(xì)胞，對(duì)照以血管壁及肌束為對(duì)照，蛋白以小神經(jīng)末梢為對(duì)照等，如果應(yīng)為陽(yáng)性的組織是陽(yáng)性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問題或免疫試劑質(zhì)量有問題。免疫組化染色一石蠟切片免疫組化染色實(shí)驗(yàn)步驟：石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應(yīng)置0小時(shí)）。（）二甲苯I、各分鐘。（）梯度酒精：，分鐘T,分鐘T,分鐘T,分鐘。（）蒸餾水洗：分鐘，次（置于搖床）。2過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶：，室溫分鐘（避光）。3蒸餾水洗：5分鐘,2次（置于搖床）。4抗原修復(fù)：根據(jù)待檢測(cè)的抗原,選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。附：抗原修?fù)液（枸椽酸鈉緩沖液）的配制（）儲(chǔ)備液的配制：液：枸椽酸三鈉蒸餾水液：枸椽酸蒸餾水（）工作液的配制：液蒸餾水抗原修復(fù)的方法：（）高壓鍋處理技術(shù)：枸椽酸鈉緩沖液（，）淹沒切片蓋上鍋蓋，高壓鍋內(nèi)煮沸上汽分鐘后緩慢冷卻（可用自來