色譜超臨界流體色譜法課件

1、超臨界流體色譜法 Supercrical Fluid Chromatography （SFC）第1頁(yè)，共22頁(yè)。超臨界流體的定義： 純凈物質(zhì)根據(jù)溫度和壓力的不同，呈現(xiàn)出液體、氣體、固體等狀態(tài)變化，如果提高溫度和壓力，來(lái)觀察狀態(tài)的變化發(fā)現(xiàn)，如果達(dá)到特定的溫度、壓力，會(huì)出現(xiàn)液體與氣體界面消失的現(xiàn)象,該點(diǎn)被稱為臨界點(diǎn)。在臨界點(diǎn)附近，會(huì)出現(xiàn)流體的密度、粘度、溶解度、熱容量、介電常數(shù)等所有流體的物性發(fā)生急劇變化的現(xiàn)象。當(dāng)物質(zhì)所處的溫度高于臨界溫度，壓力大于臨界壓力時(shí)，該物質(zhì)處于超臨界狀態(tài)。 溫度及壓力均處于臨界點(diǎn)以上的液體叫超臨界流體(supercritical fluid，簡(jiǎn)稱SCF)。 例如:當(dāng)水的

2、溫度和壓強(qiáng)升高到臨界點(diǎn)(t=374.3 ，p=22.05 MPa)以上時(shí)，就處于一種既不同于氣態(tài)，也不同于液態(tài)和固態(tài)的新的流體態(tài)超臨界態(tài)，該狀態(tài)的水即稱之為超臨界水。第2頁(yè)，共22頁(yè)。超臨界流體色譜法 超臨界流體色譜(supercrical fluid chromatography,SFC)是以超臨界流體作為流動(dòng)相的色譜方法，是20世紀(jì)80年代以來(lái)發(fā)展迅速的一個(gè)色譜分支，所謂超臨界流體，是指在高于臨界壓力和臨界溫度時(shí)的一種物質(zhì)狀態(tài)。它既不是氣體，也不是液體，但它兼有氣體的低粘度、液體的高密度以及介于氣、液之間較高的擴(kuò)散系數(shù)等特性。從理論上說(shuō)SFC既可以分析GC法難以處理的高沸點(diǎn)、不揮發(fā)性樣品，

3、又有比HPLC法更高的柱效和更短的分離時(shí)間，且可使用二者常用的檢測(cè)器，也可與MS、FT-IR光譜儀等在線聯(lián)接，因而可以方便地進(jìn)行定性、定量分析。在中藥藥物分析領(lǐng)域已有愈來(lái)愈多的應(yīng)用。第3頁(yè)，共22頁(yè)。一、超臨界流體色譜的特點(diǎn)與原理principle and character of supercritical fluid chromatography1超臨界流體的特性。對(duì)于某些純物質(zhì)來(lái)說(shuō)，具有三相點(diǎn)和臨界點(diǎn)，如圖所示，從圖中可以看出，物質(zhì)在三相點(diǎn)，氣、液、固三態(tài)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)處于臨界溫度和臨界壓力以上時(shí)，則不論施加多大壓力，氣體也不會(huì)液化，此時(shí)即非氣體，也非液體，而是以超臨界流體形式存在。第

4、4頁(yè)，共22頁(yè)。 超臨界流體對(duì)于分離具有極其有用的物理性質(zhì)，這些性質(zhì)恰好介于氣體和液體之間。下表對(duì)氣體、液體、和超臨界流體的有關(guān)物理性質(zhì)進(jìn)行了比較。 表 氣體、液體、超臨界流體物理性質(zhì)的比較流動(dòng)相密度（g/ml）擴(kuò)散系數(shù)（cm2/s）粘度（g/cm.s）氣體超臨界流體液體約10-30.2-0.90.8-1.01-10-210-3-10-410-510-410-4-10-310-2第5頁(yè)，共22頁(yè)。2.原理 SFC的流動(dòng)相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細(xì)管柱SFC； 分離機(jī)理：

5、吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同而被分離； 通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的壓力（調(diào)節(jié)流動(dòng)相的密度），調(diào)整組分保留值；第6頁(yè)，共22頁(yè)。壓力效應(yīng)： SFC的柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），對(duì)分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大，產(chǎn)生壓力效應(yīng)）； 超臨界流體的密度受壓力的影響在臨界壓力處最大，超過(guò)該點(diǎn)，影響小，超過(guò)臨界壓力20%，柱壓降對(duì)分離的影響??； 壓力效應(yīng)：在SFC中，壓力變化對(duì)容量因子產(chǎn)生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度的增加，能提高溶劑效率，淋洗時(shí)間縮短。 CO2流動(dòng)相，當(dāng)壓力改變：7.09.0106 Pa，則： C16H34的保留時(shí)間 25min 5min。第7頁(yè)，共22頁(yè)

6、。程序升壓第8頁(yè)，共22頁(yè)。HPLC與SFC比較第9頁(yè)，共22頁(yè)。與GC法和HPLC法比較,因超臨界流體的粘度接近于氣相色譜的流動(dòng)相,對(duì)溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力小，可以使用更高的流速洗脫，因此SFC的分離速度快于HPLC而與GC相當(dāng)；超臨界流體的擴(kuò)散率介于GC和LC之間，因而峰展寬小于在氣體中。 SFC中的流動(dòng)相不是惰性的傳輸介質(zhì)，這不同于GC而與LC一樣，溶質(zhì)與流動(dòng)相間有相互作用，利用此點(diǎn)可調(diào)控選擇因子在一定壓力下，超臨界流體溶解的分子的分壓比在氣體中高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，這就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大分子、熱不穩(wěn)定性化合物、 高聚物等的有效分離。第10頁(yè)，共22頁(yè)。二、超臨界流體色譜儀的結(jié)構(gòu)與流程instrument s

7、tructure and the general process of SFC1.結(jié)構(gòu)流程 第11頁(yè)，共22頁(yè)。2.主要部件（1）SFC的高壓泵 無(wú)脈沖的注射泵；通過(guò)電子壓力傳感器和流量檢測(cè)器，計(jì)算機(jī)控制流動(dòng)相的密度和流量； （2）SFC的色譜柱和固定相 可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細(xì)管柱； SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細(xì)管壁）上的高聚物；專用的毛細(xì)管柱SFC；第12頁(yè)，共22頁(yè)。色譜柱填充柱填充柱與HPLC柱相似，基于分配平衡實(shí)現(xiàn)分離，柱長(zhǎng)可達(dá)25cm，分離柱內(nèi)徑0.5-4.6mm。使用粒徑為3-10m的填料填充。如硅膠、-NH2、-CN及C18、C8等化學(xué)鍵合相均可用

8、于SFC。其中以極性填料的分離效果更好。SFC在手性化合物的分離上效果優(yōu)于HPLC。在實(shí)際操作中，往往會(huì)因壓力變化而產(chǎn)生較大的柱壓降，使柱入、出口處的保留時(shí)間有很大差異，所以一般采用高于超臨界壓力20%左右的壓力以減小影響。在填料的選擇上也要注意與所分析的樣品相適應(yīng)，如分析極性或堿性化合物時(shí)，填料覆蓋度小，會(huì)產(chǎn)生不對(duì)稱峰。若使用“封端”填料則會(huì)得到改善。第13頁(yè)，共22頁(yè)。填充柱在重現(xiàn)性、載樣量等方面要優(yōu)于毛細(xì)管柱，操作簡(jiǎn)便，也有用微填充柱的，將3-10m的填料填充到內(nèi)徑幾個(gè)毫米或更小的毛細(xì)管柱中。毛細(xì)管柱較長(zhǎng)用的填充毛細(xì)管柱內(nèi)徑0.5mm，柱長(zhǎng)為10-30m；開管毛細(xì)管柱主要是內(nèi)徑為50-1

9、00m化學(xué)交連的各種硅氧烷柱或其它類型的交連柱。SFC色譜柱必須借助柱箱以實(shí)現(xiàn)精確的溫度控制，范圍可以從室溫至450C，同時(shí)配低溫控制系統(tǒng)，可在-50以下工作。第14頁(yè)，共22頁(yè)。主要部件（3）流動(dòng)相 SFC的流動(dòng)相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 CO2應(yīng)用最廣泛；無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒、易得、對(duì)各類有機(jī)物溶解性好，在紫外光區(qū)無(wú)吸收；缺點(diǎn)：極性太弱；加少量甲醇等改性；（4）檢測(cè)器 可采用液相色譜檢測(cè)器，也可采用氣相色譜的FID檢測(cè)器第15頁(yè)，共22頁(yè)。使用氣相色譜檢測(cè)器，以FID為多用，應(yīng)用時(shí)可將色譜柱的流出物分流，部分流出物通過(guò)限流器變?yōu)闅鈶B(tài)進(jìn)入檢測(cè)器，若用FID檢測(cè)時(shí)，流動(dòng)相中不能加入改進(jìn)

10、劑，否則改進(jìn)劑本身將給出信號(hào)干擾測(cè)定，F(xiàn)ID對(duì)小分子量化合物可得到很好的結(jié)果，對(duì)分子量大的化合物常得不到單峰，而是一簇峰。如把檢測(cè)器加熱可使分子量大于2000的化合物獲得滿意的分離。在SFC中也可以使用氮磷檢測(cè)器（NPD）、火焰光度檢測(cè)器（FPD）等。第16頁(yè)，共22頁(yè)。使用液相色譜檢測(cè)器。在進(jìn)入檢測(cè)器之前應(yīng)將超臨界狀態(tài)轉(zhuǎn)為液態(tài)，可增加檢測(cè)的靈敏度，使譜帶變窄，而且可以在室溫下操作，UVD是用改性劑流動(dòng)相的填充柱SFC的最常用的檢測(cè)方法。要求檢測(cè)器必須耐高壓。如使用毛細(xì)管柱，UVD的流通池可由一段熔融石英毛細(xì)管構(gòu)成，內(nèi)容積在200nl左右，這樣不會(huì)影響柱效；熒光檢測(cè)器（FD）也可以如此應(yīng)用。對(duì)

11、于填充柱，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器也是一種常用的通用檢測(cè)器。第17頁(yè)，共22頁(yè)。三、超臨界流體色譜的流動(dòng)相和改性劑（一）流動(dòng)相SFC的流動(dòng)相為超臨界流體。超臨界流體的主要特點(diǎn)是在不同壓力下對(duì)各種樣品有不同的溶解能力。其溶解度隨超臨界流體密度的增加而增加。當(dāng)兩組分的溶解度常數(shù)越接近時(shí)，其互溶性就越好。有人研究認(rèn)為，幾種常用的超臨界流體的溶解能力在相同的壓力條件下順序是乙烷二氧化碳氧化亞氮三氟甲烷，在相同條件下其分離能力是：二氧化碳氧化亞氮三氟甲烷乙烷。對(duì)于SFC流動(dòng)相的選擇應(yīng)綜合考慮。除溶解性能外，還要與檢測(cè)器相適應(yīng)，CO2是最常用的流動(dòng)相。其臨界溫度低、壓力適中，容易操作，相對(duì)便宜，無(wú)毒無(wú)嗅，安全性好

12、，且在190nm以上無(wú)紫外吸收。第18頁(yè)，共22頁(yè)。（二）改性劑在SFC中，弱極性或非極性超臨界流體流動(dòng)相如CO2，對(duì)于一些極性化合物的溶解能力較差。為了加強(qiáng)其對(duì)極性溶質(zhì)的溶解和洗脫能力，常常向其中加入一定比例的極性溶劑稱為改性劑，加入的量一般為1%-5%，以甲醇最常用，其次是其他脂肪醇，表中列出了部分適于二氧化碳的改性劑及應(yīng)用特性。 表 常用CO2改性劑CO2改性劑檢測(cè)方法CO2改性劑檢測(cè)方法甲醇UVD MS FIDC（用量應(yīng)少于1%）脂肪二甲基亞砜乙二氧甲烷UVUV UV MSUV MS脂肪醇UV MS甲醇UV MS FID四氫呋喃UV MS 二氧化碳UV MS FID2- 基乙醇UV 水UV MS FID在分離酸性或堿性化合物時(shí)，也可以向CO2流動(dòng)相中加入酸或堿，使其峰形變銳。第19頁(yè)，共22頁(yè)。1.聚苯醚低聚物的分析色譜柱：10m 63m i.d. 毛細(xì)管柱，固定相：鍵合二甲基聚硅氧烷；流動(dòng)相：CO2 ；柱溫：120