顯微攝影技術(shù)全套課件

1、顯微攝影技術(shù)什么是顯微攝影？ 顯微攝影： 利用攝影裝置（傳統(tǒng)相機(jī)、數(shù)碼相機(jī)、專用CCD等）拍攝顯微鏡視野中所觀察到的物像。影像質(zhì)量取決于：樣本制作質(zhì)量；顯微鏡光學(xué)性能；攝影裝置性能；操作者技術(shù)水平。內(nèi) 容光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能與顯微攝影有關(guān)的基本光學(xué)概念 顯微攝影系統(tǒng)的基本構(gòu)成顯微攝影基本操作程序影響顯微成像質(zhì)量的因素光學(xué)顯微鏡種類及結(jié)構(gòu)特征按照其光路結(jié)構(gòu)、分辨模式：正置顯微鏡倒置顯微鏡體視鏡偏光鏡等；按照其照明光源性質(zhì)：可見光（明視場、弱視場）熒光（紫外、紅外）顯微鏡激光共聚焦顯微鏡光譜顯微鏡；按機(jī)械部件的控制方式：手動(dòng)電動(dòng)和全自動(dòng)顯微鏡。光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)

2、構(gòu)特征明視場（可見光）照明光源采用普通燈泡或鹵素?zé)?，主要用于常?guī)染色組織標(biāo)本的觀察：組織化學(xué)染色樣本免疫組織化學(xué)染色樣本；弱視場包括相差（又稱相忖）、霍夫曼、微分干涉和偏光等，照明光源與明視場通用，但在光路上插入不同的光學(xué)部件，降低背景光強(qiáng)度，增強(qiáng)被觀察物體的光反差，提高對透明樣本的觀察能力，主要用于活組織未染色樣本的觀察。光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征熒光顯微鏡：照明光源采用汞燈或高能氙燈，通過不同的濾光片組合獲得不同波段的激發(fā)/發(fā)射光，用于熒光染色標(biāo)本的觀察。由于冷光源技術(shù)（金屬鹵素?zé)簦┑拈_發(fā)及熒光蛋白技術(shù)的日臻成熟，已逐漸克服了強(qiáng)光源對組織的灼傷及活組織熒光顯色等技術(shù)瓶頸，使熒光顯微技術(shù)在活

3、組織樣本觀察中獲得了廣泛的應(yīng)用。 光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征激光共聚焦顯微鏡： 利用單色高能激光對觀測樣本進(jìn)行逐點(diǎn)、多焦面掃描，通過計(jì)算機(jī)處理合成高清晰圖像。光譜顯微鏡：采用多濾片組合或分光技術(shù)，獲得連續(xù)激發(fā)/發(fā)射光譜，用于熒光掃描、熒光萃滅、熒光能量轉(zhuǎn)移等細(xì)胞動(dòng)力學(xué)觀察內(nèi) 容光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能與顯微攝影有關(guān)的基本光學(xué)概念 顯微攝影系統(tǒng)的基本構(gòu)成顯微攝影基本操作程序影響顯微成像質(zhì)量的因素光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡成像原理影響成像的關(guān)鍵因素相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)透鏡及其性能透鏡（lens):透鏡是由透明物質(zhì)（如玻璃等）制成

4、的一種光學(xué)元件。透鏡是折射鏡，其折射面是兩個(gè)球面，或一個(gè)球面一個(gè)平面。它所成的像有實(shí)像也有虛像。透鏡一般可以分為兩大類：凸透鏡和凹透鏡。中央部分比邊緣部分厚的叫凸透鏡，有雙凸、平凸、凹凸三種；中央部分比邊緣部分薄的叫凹透鏡，有雙凹、平凹、凸凹三種。凸透鏡具有會聚光線的作用，所以也叫會聚透鏡。凹透鏡具有發(fā)散光線的作用，所以也叫發(fā)散透鏡。透鏡是組成顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的最基本的光學(xué)元件，物鏡、目鏡及聚光鏡等部件均由單個(gè)或多個(gè)透鏡組成。虛像/實(shí)像：光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實(shí)像。實(shí)像可在屏幕上顯現(xiàn)出來，而虛像不能。 焦點(diǎn)與焦平面：當(dāng)一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點(diǎn)，這個(gè)點(diǎn)稱“

5、焦點(diǎn)”；通過交點(diǎn)并垂直光軸的平面，稱“焦平面”。焦點(diǎn)有兩個(gè)，在物方空間的焦點(diǎn)，稱“物方焦點(diǎn)”，該處的焦平面，稱“物方焦平面”；反之，在像方空間的焦點(diǎn)，稱“像方焦點(diǎn)”，該處的焦平面，稱“像方焦平面”。光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡的成像原理影響成像的關(guān)鍵因素相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)顯微鏡的成像原理a.當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時(shí)，則在像方二倍焦距以內(nèi)、焦點(diǎn)以外形成縮小的倒立實(shí)像； b.當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時(shí)，則在像方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實(shí)像；c.當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點(diǎn)以外時(shí)，則在像方二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)像；d.當(dāng)物體位于透

6、鏡物方焦點(diǎn)上時(shí)，則像方不能成像； e.當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)以內(nèi)時(shí)，則像方也無像的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成放大的直立虛像。 顯微鏡的成像原理就是利用上述（c）和（e）的規(guī)律把物體放大的。當(dāng)物體處在物鏡前F-2F（F為物方焦距）之間，則在物鏡像方的二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)像。在顯微鏡的設(shè)計(jì)上，將此像落在目鏡的一倍焦距F1之內(nèi)，使物鏡所放大的第一次像（中間像），又被目鏡再一次放大，最終在目鏡的物方（中間像的同側(cè)）、人眼的明視距離（250mm）處形成放大的直立（相對中間像而言）虛像。因此，當(dāng)我們在鏡檢時(shí)，通過目鏡（不另加轉(zhuǎn)換棱鏡）看到的像于原物體的像，方向相反。光學(xué)顯微鏡主要光

7、學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡的成像原理影響成像的關(guān)鍵因素相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)影響成像的關(guān)鍵因素相差色差（Chromaticaberration）：色差是透鏡成像的一個(gè)嚴(yán)重缺陷，發(fā)生在以多色光為光源的情況下，單色光不產(chǎn)生色差。白光由紅橙黃綠青藍(lán)紫七種組成，各種光的波長不同，所以在通過透鏡時(shí)的折射率也不同，這樣物方一個(gè)點(diǎn)，在像方則可能形成一個(gè)色斑。色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置觀察，都帶有色斑或暈環(huán)，使像模糊不清。而放大率色差使像帶有彩色邊緣。球差(Sphericalaberration)：球差是軸上點(diǎn)的單色相差，是由于透鏡的球形表面造成的。球差造成的

8、結(jié)果是，一個(gè)點(diǎn)成像后，不再是個(gè)亮點(diǎn)，而是一個(gè)中間亮邊緣逐漸模糊的亮斑。從而影響成像質(zhì)量。 球差的矯正常利用透鏡組合來消除，由于凸、凹透鏡的球差是相反的，可選配不同材料的凸凹透鏡膠合起來給予消除。舊型號顯微鏡，物鏡的球差沒有完全矯正，應(yīng)與相應(yīng)的補(bǔ)償目鏡配合，才能達(dá)到糾正效果。一般新型顯微鏡的球差完全由物鏡消除。慧差(Coma) ：慧差屬軸外點(diǎn)的單色相差。軸外物點(diǎn)以大孔徑光束成像時(shí)，發(fā)出的光束通過透鏡后，不再相交一點(diǎn)，則一光點(diǎn)的像便會得到一逗點(diǎn)壯，型如慧星，故稱“慧差”。 像散（Astigmatism）：像散也是影響清晰度的軸外點(diǎn)單色相差。當(dāng)視場很大時(shí)，邊緣上的物點(diǎn)離光軸遠(yuǎn)，光束傾斜大，經(jīng)透鏡后則

9、引起像散。像散使原來的物點(diǎn)在成像后變成兩個(gè)分離并且相互垂直的短線，在理想像平面上綜合后，形成一個(gè)橢圓形的斑點(diǎn)。像散是通過復(fù)雜的透鏡組合來消除。場曲（Curvatureoffield）：場曲又稱“像場彎曲”。當(dāng)透鏡存在場曲時(shí)，整個(gè)光束的交點(diǎn)不與理想像點(diǎn)重合，雖然在每個(gè)特定點(diǎn)都能得到清晰的像點(diǎn)，但整個(gè)像平面則是一個(gè)曲面。這樣在鏡檢時(shí)不能同時(shí)看清整個(gè)相面，給觀察和照相造成困難。因此研究用顯微鏡的物鏡一般都是平場物鏡，這種物鏡已經(jīng)矯正了場曲?；儯―istortion）：前面所說各種相差除場曲外，都影響像的清晰度?；兪橇硪环N性質(zhì)的相差，光束的同心性不受到破壞。因此，不影響像的清晰度，但使像與原物體比

10、，在形狀上造成失真。光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡的成像原理影響成像的關(guān)鍵因素相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)主要光學(xué)部件及性能物鏡（objective）:物鏡是顯微鏡最主要的光學(xué)部件，顯微鏡的分辯力主要取決于物鏡的數(shù)值孔徑（鏡口率，numerical aperture,NA）。目前常見物鏡：消色差物鏡、復(fù)消色差物鏡、半復(fù)消色差物鏡、平場消色差物鏡。數(shù)值孔徑(NA)數(shù)值孔徑（numerical aperture,NA），是物鏡和聚光鏡的重要技術(shù)參數(shù)，是判斷光學(xué)元件性能的重要標(biāo)志。它是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率(Eta)和孔徑角(u (upsilon)半數(shù)的正弦

11、之乘積。用公式表示如下：NA=sinu/2。消色差物鏡（achromatic objective, Ach）。這是一種常見的物鏡，物鏡外殼上不列代表標(biāo)志。物鏡把光譜中紅藍(lán)光聚焦于一點(diǎn)，黃綠光聚焦于一點(diǎn)，最清晰范圍為510630納米。這種物鏡一般不適宜作攝影用，如加黃綠濾光鏡，可獲得較為清晰的照片。復(fù)消色差物鏡（apochromatic objective, Apo）。這種物鏡能把光鏡中紅、藍(lán)、黃光聚焦于一點(diǎn)，糾正了紅藍(lán)光的色差和黃綠光的球差，最佳清晰范圍為400720納米。這種物鏡適用于在任何色光下或加用各色濾色鏡進(jìn)行觀察攝影，適用于彩色攝影。但Apo物鏡殘留有像場彎曲，使平面物體形成類似球面

12、的彎曲影像，結(jié)果使視野中心和邊緣的影像不能同時(shí)聚焦，拍出的底片中心清晰，邊緣模糊或者相反。半復(fù)消色差物鏡（熒光石鏡，fluorite objective, Fl）。最佳清晰范圍430680納米，色差校正介于消色差物鏡與復(fù)消色差物鏡之間。平場消色差物鏡(plan achromatic objective, lp)。這種物鏡糾正了以上三種物鏡的缺陷，校正了像場彎曲，不存在視野中心與邊緣不能同時(shí)準(zhǔn)焦的現(xiàn)像。由于影像展開，在同樣倍數(shù)下，影像要比一般物鏡的影像大。平場消色差物鏡有多種類型，外殼上刻有plan.Apo。平場復(fù)消色差物鏡是最佳物鏡。物鏡標(biāo)識物鏡色差程度：Apo(復(fù)消色差物鏡) Fl(熒石物鏡

13、) plan 或pl(平場消色差物鏡)。放大倍數(shù)/數(shù)字孔徑：2.5，4（5），10/0.25，20，40/0.65，63，100/1.25。標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械筒長：160mm或170mm。蓋玻片厚：0.17mm，常以170mm/0.17mm表示，載玻片厚小于1.2mm。物鏡與被檢樣品的介質(zhì)：干燥系物鏡無標(biāo)志；油浸鏡標(biāo)有OIL、OEL、HL或IMM字樣；水浸鏡標(biāo)為W；甘油為Glyz。目鏡(eyepiece)目鏡是位于實(shí)像和肉眼間的放大鏡，將物像進(jìn)行第二次放大，并糾正物鏡造成的像差和色差。目鏡由兩片（組）透鏡組成，其中，場透鏡可使視野邊緣的成像光線向內(nèi)折射，進(jìn)入眼透鏡中，使物體的影像均勻明亮，眼透鏡決定放大

14、倍數(shù)和成像的優(yōu)劣。目鏡筒內(nèi)裝有以金屬光闌，物鏡放大后的 中間像就落在金屬光闌平面處。從目鏡中透出來的光線在目鏡外相交，這個(gè)相交點(diǎn)稱為眼點(diǎn)（eyepoint）。觀察時(shí)眼睛應(yīng)在眼點(diǎn)位置上，這樣才能接收從目鏡射出的全部光線，看到最大的視場，否則會造成圖像晃動(dòng)和不適的感覺，影響觀察效果。目鏡(eyepiece)由前述已知顯微鏡的分辨能力是由物鏡的數(shù)字孔徑所決定的，而目鏡只是起到放大作用。因此，對于物鏡不能分辯出的細(xì)微結(jié)構(gòu)，目鏡放得再大，也仍然不能辨認(rèn)。目鏡有標(biāo)準(zhǔn)型和廣視場型。按用途又分為觀察目鏡、照相目鏡和取景目鏡。照相目鏡專供顯微照相之用，它是一種負(fù)焦目鏡，眼點(diǎn)位于目鏡內(nèi)，因而不能用于觀察。它的特點(diǎn)

15、是視場平坦，可校正物鏡的殘留色差，使投射到感光片（或CCD）上的圖像四周與中心都盡可能在一個(gè)焦點(diǎn)平面上。照相目鏡用于顯微照相，其放大率不高，一般在2.56.7倍之間。照相目鏡外側(cè)或端面刻有“PHOTO”、“FK”、“NFK”字樣。目鏡與物鏡的組合物鏡放大倍數(shù)1040100物鏡數(shù)值孔徑0.250.651.25有效放大倍數(shù)125250325 650625 1250目鏡放大倍數(shù)12.5258 166 12.5 顯微鏡的有效放大率為所用物鏡數(shù)值孔徑的5001000倍。目鏡與物鏡組合前提是使放大倍數(shù)在有效放大率范圍內(nèi)。 在有效放大率前提下，要提高對物像細(xì)節(jié)的分辯能力和清晰度，必須使用高數(shù)值孔徑的物鏡和低

16、倍目鏡的組合。目鏡和物鏡的組合當(dāng)所選目鏡的放大倍數(shù)低于有效放大倍數(shù)時(shí)，會造成物鏡本來可以辨認(rèn)的細(xì)節(jié)因總的放大倍數(shù)太小而擠在一起，難以分辯。當(dāng)所選目鏡的放大倍數(shù)高于有效放大倍數(shù)時(shí)，所得放大倍數(shù)叫“空的放大”，影像細(xì)節(jié)的分辯能力沒有提高。在有效放大率前提下，要提高對物像細(xì)節(jié)的分辯能力和清晰度，必須使用高數(shù)值孔徑的物鏡和低倍目鏡的組合。目鏡和物鏡的組合例如數(shù)值孔徑為1.3的物鏡（標(biāo)記為100/1.3）與放大倍數(shù)為4的目鏡組合，總放大倍數(shù)為400，若入射光為綠色光（550納米），分辯力為270納米。數(shù)值孔徑為0.65的物鏡（標(biāo)記為40/0.65）與放大倍數(shù)為10的目鏡組合，總放大倍數(shù)為400，550納

17、米時(shí)分辯力為500納米。 兩種組合結(jié)果，顯然第一種能提高物像分辯力。不同照像目鏡/物鏡組合的效果照像目鏡的選擇：在物鏡的有效放大倍率內(nèi)，盡量優(yōu)選低倍照像目鏡。聚光器(condenser)聚光器的主要作用是使光線集中于標(biāo)本，配合物鏡提高物像的分辯力。聚光鏡：聚光鏡由一至數(shù)片透鏡組成。聚光鏡有聚光作用，它的數(shù)值孔徑在0.251.40不等，聚光鏡的數(shù)值孔徑受孔徑光闌控制?？讖焦怅@：孔徑光闌的開放與收縮，調(diào)節(jié)聚光鏡數(shù)值孔徑的大小，使圖像分辯力、反差和焦深處在最佳狀態(tài)。顯微鏡的功能主要取決于物鏡的性能，而物鏡的性能又取決于物鏡的數(shù)值孔徑，物鏡的數(shù)值孔徑與聚光鏡的數(shù)值孔徑相關(guān)，兩者孔徑相等時(shí)，物鏡分辨力最

18、高。但顯微攝影不同于一般攝影，其最大的區(qū)別是影像反差小、焦深淺，這兩點(diǎn)可隨孔徑光闌縮小而提高。孔徑光闌小于物鏡的數(shù)值孔徑時(shí)，物鏡的分辯力的亮度降低，但影像反差和焦點(diǎn)深度提高，使影像更加清晰。所以，在不過多降低分辯力前提下，要將孔徑光闌數(shù)值調(diào)到所用物鏡數(shù)值孔徑的6080。 物鏡有效數(shù)值孔徑(物鏡NA+聚光鏡NA)/2注 意若顯微攝影的照明光線過強(qiáng)，可以改變燈的亮度（降低電壓），用深色濾光片或增加濾光片的數(shù)目。千萬不要改變聚光器的位置或縮小光圈，否則會降低顯微鏡的分辯力。若被檢物為活體標(biāo)本或未染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)縮小孔徑光闌，加強(qiáng)明暗對比。但為了防止物鏡的分辯力的降低，必須加強(qiáng)照明光線的強(qiáng)度，但孔徑光闌

19、數(shù)值一般不能小于物鏡孔徑光闌數(shù)值的60。若聚光器外方?jīng)]有刻度時(shí)，可以在標(biāo)本調(diào)焦后，取下目鏡，眼睛離目鏡頭510厘米，左眼觀察鏡筒，邊看物鏡的后焦點(diǎn)平面，邊緩慢增大孔徑光闌，至物鏡后透鏡呈一明亮園時(shí)再將孔徑光闌適當(dāng)縮?。ü烙?jì)其為物鏡孔徑數(shù)值的2/3），然后放回目鏡。視場光闌 視場光闌位于鏡座之中，用以控制照明光束的直徑，它根據(jù)物鏡的倍率給予不同直徑的光束面積。視場光闌過小，視野亮度不足，影像不清晰；視場光闌過大，光束直徑超出孔徑光闌，造成光線的亂反射，也影響影像的清晰度。一般觀察時(shí)，應(yīng)先用聚光器上的調(diào)中螺旋把視場光闌調(diào)到視場中心位置，然后讓視場光闌多邊形光闌處于視場的外切位。顯微攝影時(shí)，視場光闌

20、收縮至取景框邊緣的外方（但不能接觸取景框），此位可使圖像反差得到改善。如果視場光闌收縮得過于接近取景框時(shí)，則圖像的四角將被切去。因?yàn)閷?shí)際拍攝的視場范圍要比取景框略大一些。視場光闌的配合使用根據(jù)不同倍率物鏡給予不同直徑的光束；避免散射光，增加圖像反差；適度：視場光闌像恰在取景框的外緣。過于接近或超過則會將圖像的四角切掉。視場光闌配合使用光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能透鏡及其性能顯微鏡的成像原理影響成像的關(guān)鍵因素相差主要光學(xué)部件及性能光學(xué)顯微鏡相關(guān)參數(shù)分辨率：顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個(gè)物點(diǎn)的最小間距，又稱“鑒別率”。其計(jì)算公式是=/NA 式中(sigma )為最小分辨距離；為射光線的

21、波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑。可見物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個(gè)因素決定。放大率和有效放大：物像經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率是物鏡放大率和目鏡放大率的乘積,顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。焦深：焦深為焦點(diǎn)深度的簡稱，即在使用顯微鏡時(shí)，當(dāng)焦點(diǎn)對準(zhǔn)某一物體時(shí)，不僅位于該點(diǎn)平面上的各點(diǎn)都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個(gè)清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層。視場直徑：所看到的明亮的圓形范圍叫視場，它的大小是由目鏡里的視場光闌決定的。視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視

22、場內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。覆蓋差：由于蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差.國際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計(jì)算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。工作距離(WD)：工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。內(nèi) 容光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能與顯微攝影有關(guān)的基本光學(xué)概念 顯微攝影系統(tǒng)的基本構(gòu)成顯微攝影基本操作程序影響顯微成像質(zhì)量的因素折射和折射率折射：光

23、線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點(diǎn)之間以直線傳播。當(dāng)光從一種介質(zhì)斜射入另一種介質(zhì)時(shí)，傳播方向發(fā)生變化，這種現(xiàn)像叫光的折射，這是由于光線在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。折射光線與發(fā)線之間的夾角稱折射角，同理入射光線與法線之間的夾角稱入射角。光的折射規(guī)律：光從空氣斜射入水或其他介質(zhì)中時(shí)，折射光線與入射光線、法線在同一平面上，折射光線和入射光線分居法線兩側(cè)；折射角小于入射角；入射角增大時(shí)，折射角也隨著增大；當(dāng)光線垂直射向介質(zhì)表面時(shí)，傳播方向不變，在折射中光路可逆。折射和折射率折射率：是表示同一光線在兩種（各向同性）介質(zhì)中光速比值的物理量。絕對折射率 光從真空射入介質(zhì)發(fā)生折射時(shí)，入射角i與折射角r的正弦之

24、比n叫做介質(zhì)的“絕對折射率”，簡稱“折射率”。它表示光在介質(zhì)中傳播時(shí)，介質(zhì)對光的一種特征。 相對折射率 光從介質(zhì)1射入介質(zhì)2發(fā)生折射時(shí)，入射角1與折射角2的正弦之比n21叫做介質(zhì)2相對介質(zhì)1的折射率，即“相對折射率”。因此，“絕對折射率”可以看作介質(zhì)相對真空的折射率。色溫與白平衡黑體（black body）：黑體是一種可將落在其上的所有熱量吸收，而無損的轉(zhuǎn)化成為“光”向外輻射的理想物質(zhì)，輻射光的顏色成分與該黑體所受熱量值（溫度）相對應(yīng)。色溫（colour temperature）：色溫是表示光顏色視覺印像的物理量，是量度和計(jì)算光線顏色成分的尺度。光源發(fā)射的光的顏色與黑體在某一溫度下輻射光色相同

25、的光時(shí)，黑體的溫度即為該光源的色溫。色溫用開氏溫標(biāo)表示（Kelvin temperature scale. K）, K=+273.15。光源色溫不同，光色亦不同。色溫與白平衡白平衡（White Balance）：物體顏色會因投射光線顏色產(chǎn)生改變，在不同光線條件下拍攝出的圖像會有不同的色溫。白平衡就是在特定光線條件下，按視野中圖像特質(zhì)，找出白色區(qū)域，默認(rèn)為“白色”，并調(diào)整整個(gè)圖像紅綠藍(lán)三色的強(qiáng)度，以修正照射光線所造成的誤差，進(jìn)而解決色彩還原和色調(diào)處理等一系列問題，使圖像的色調(diào)恢復(fù)到原色狀態(tài)。開氏溫標(biāo)示意圖越低的數(shù)值表示越“紅”，越高的數(shù)值表示越“藍(lán)”。紅和藍(lán)并不是光線本身顏色，只是表明光譜中的紅

26、或藍(lán)成分較多。不同光源環(huán)境的色溫表內(nèi) 容光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能與顯微攝影有關(guān)的基本光學(xué)概念 顯微攝影系統(tǒng)的基本構(gòu)成顯微攝影基本操作程序影響顯微成像質(zhì)量的因素傳統(tǒng)光學(xué)顯微攝影系統(tǒng)數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)系統(tǒng)配置：萬能研究級顯微鏡專用攝影頭定制高清晰度專用圖像采集卡進(jìn)口原裝攝影頭專用標(biāo)準(zhǔn)C接口高性能商用計(jì)算機(jī)專用圖像分析軟件顯微圖像分析系統(tǒng)顯微熒光圖像分析系統(tǒng)成像質(zhì)量要求BF：追求分辨率、色彩還原FL: 追求敏感度定量分析：圖像可比性環(huán)境要求無塵、無振動(dòng)；避免強(qiáng)光照射-影響對焦準(zhǔn)確性；房間照度不能過強(qiáng)，散射光、照明的眩光透過物鏡、聚光鏡等會反射到光路中，干擾正常成像；無

27、腐蝕性氣、物；防潮、防霉。軟件基本功能要求可充分利用WINDOWS系統(tǒng)資源，全面支持多種操作系統(tǒng)；可與顯微鏡聯(lián)動(dòng)或控制顯微鏡的相關(guān)功能；具有程序設(shè)計(jì)手段，可進(jìn)行分析過程的全自動(dòng)設(shè)置；悔步、重復(fù)功能，方便尋找最佳處理路徑；在線幫助；圖像輸入：支持視窗平臺，支持模擬CCD、數(shù)字CCD、數(shù)字冷CCD、數(shù)碼相機(jī)、掃描儀等圖像攝入設(shè)備；支持多種圖像采集卡；支持JPEG、TIFF、BMP、GIF、PCX、DIB、EPS、WMF、TGA、WPG和部分非標(biāo)準(zhǔn)圖像格式；支持24/48位真彩色圖像采集；符合GB15445、美國ASTM112及ISO9276標(biāo)準(zhǔn)。特征范圍選?。?具有多種圖像特征的選取工具（矩形框、

28、圓形框和自畫任意框等），不限制多層彩色分割，圖像數(shù)學(xué)運(yùn)算。專業(yè)圖像處理與分析功能： 包括色度調(diào)整，圖像變形，數(shù)字形態(tài)學(xué)處理，圖像增強(qiáng)，圖像匹配，紋理分析，特征識別等。 具有顆粒自動(dòng)識別、粘連顆粒自動(dòng)切分功能，以利復(fù)雜圖像的準(zhǔn)確分析。圖像參數(shù)測量圖像定量分析提供點(diǎn)、線、面積和角度測量四大類；提供多種的測量參數(shù)，如面積、周長、長軸、短軸、形態(tài)因子、異型指數(shù)、圓形度、平均灰度、平均光密度、積分光密度、絕對光密度、光密方差度、核漿比等。分析數(shù)據(jù)的可視化處理使分析結(jié)果與圖像之間構(gòu)成直接映射關(guān)系，便于觀察分析。數(shù)值統(tǒng)計(jì)： 自動(dòng)對目標(biāo)圖像進(jìn)行分割、計(jì)算、統(tǒng)計(jì)、歸類等操作，并可自動(dòng)編號，逐個(gè)顯示被跟蹤目標(biāo)的全

29、部參數(shù)；用戶可自行設(shè)置測量參數(shù)或編輯用戶所需測量參數(shù)，并可進(jìn)行分類。白平衡： 軟件支持將不同時(shí)間、不同亮度、不同拍攝曝光設(shè)置下圖片進(jìn)行背景修正，以更科學(xué)的計(jì)算光密度相關(guān)的參數(shù)。免疫組化分析： 支持對免疫組化圖片進(jìn)行面積含量、數(shù)目含量以及和光密度有關(guān)的各類參數(shù)。圖像定標(biāo)和校正： 可定標(biāo)圖像到任何測量單位，并以實(shí)際尺寸參數(shù)對目標(biāo)進(jìn)行分析計(jì)算或打印相應(yīng)定倍圖片。圖像輸出： 照片質(zhì)量輸出圖像，輸出圖像的大小和位置可任意調(diào)整，并能按嚴(yán)格的標(biāo)尺輸出圖像。熒光圖片合成與濾色： 將不同波段下的熒光圖片合成一張圖片或?qū)⒑铣蓤D片濾色成不同波段的多張圖片。景深擴(kuò)展： 對同一視野下不同焦距下拍攝的多張圖片進(jìn)行景深擴(kuò)展

30、，處理成一張各區(qū)域都清晰的圖片。大圖拼接： 對多視野下拍攝的圖片進(jìn)行拼接，從而將一個(gè)視野下不能完全顯示的目標(biāo)處理成一張能夠包含目標(biāo)各個(gè)部分的完整的圖片。結(jié)果輸出和打?。?所有分析測量數(shù)據(jù)均可動(dòng)態(tài)連接到WORD、EXCEL以及SPSS等軟件作進(jìn)一步處理；可直接把分析圖表導(dǎo)入到WORD或剪貼板中進(jìn)行處理。軟件安裝先安裝常用軟件程序，并運(yùn)行檢測整個(gè)電腦系統(tǒng)至系統(tǒng)正常穩(wěn)定安裝圖像采集卡、數(shù)據(jù)線連接電腦、顯微鏡和CCD按軟件安裝指導(dǎo)程序一步一步進(jìn)行軟件的安裝（必要時(shí)啟動(dòng)顯微鏡）用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)尺對顯微鏡各物鏡圖像進(jìn)行標(biāo)定內(nèi) 容光學(xué)顯微鏡的種類及結(jié)構(gòu)特征光學(xué)顯微鏡主要光學(xué)部件及性能與顯微攝影有關(guān)的基本光學(xué)概念 顯微攝影系統(tǒng)的基本構(gòu)成顯微攝影基本操作程序影響顯微成像質(zhì)量的因素顯微攝影基本操作程序選定條件、清理光