遺傳學(xué)綜合性試驗(yàn)報(bào)告

1、YUNNAN NORMAL U NIVERSITY本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告誘變物質(zhì)的微核實(shí)驗(yàn)學(xué)號(hào)： 134120022 姓名： 李堯?qū)W院：生命科學(xué)學(xué)院專(zhuān)業(yè)、班級(jí) 13生科A班實(shí)驗(yàn)課程名稱(chēng)：遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教師及職稱(chēng)： 曹能開(kāi)課學(xué)期： 2014 至 2015 學(xué)年 下 學(xué)期填報(bào)時(shí)間：2015 年 5 ，月 25 日云南師范大學(xué)教務(wù)處編印實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)9實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)誘變物質(zhì)的微核實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)間2015-5-13 至U2015-5-20實(shí)驗(yàn)室睿智3- 224實(shí)驗(yàn)室1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解微核發(fā)生的機(jī)制；2、掌握微核實(shí)驗(yàn)的一般程序和實(shí)踐意義；3、掌握對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行藥物處理的一般程序；4、掌握進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一般

2、程序和規(guī)則，并鍛煉實(shí)踐能力。2.實(shí)驗(yàn)原埋微核(Micronucleus):染色單體或染色體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片，或因 紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期，仍然遺留在細(xì)胞質(zhì)中。 末期之后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)， 因比主核小，故稱(chēng)為微核。凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián) 結(jié)損傷的化學(xué)物，都可用微核試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)。各種類(lèi)型的骨髓細(xì)胞都可形成 微核，但有核細(xì)胞的胞質(zhì)少，微核與正常核葉及核的突起難以鑒別。嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個(gè) 階段，此時(shí)紅細(xì)胞的主核已排出，因胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體，姬姆薩染色呈灰 藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞的核糖體已消失，被染

3、成淡桔紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì) 胞數(shù)量充足，微核容易辨認(rèn)，而且微核自發(fā)率低，因此，骨髓中嗜多染紅 細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群。-2 -.儀器和器械生物顯微鏡、解剖剪、鐐子、注射器、載玻片、蓋玻片、塑料吸瓶、吸水紙等。試劑及配制：(1)小牛血清(滅活)將濾菌的小牛血清置于 56c恒溫水浴保溫30min滅活。滅活的 小牛血清通常保存于冰箱冷凍室里。姬姆薩(Giemsa)染液成分：Giemsa染料 3.8cj甲醇 375mL、甘油125mL。配制：將染料和少量甲醇于乳缽里仔細(xì)研磨，再加入甲醇至 375mL 和甘油，混合均勻，放置 37c恒溫箱中保溫48h。保溫期間，振搖數(shù)次， 促使染料的充分溶解，取

4、出過(guò)濾，兩周后用。0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)成分：磷酸氫二鈉(Na2HPO4 12H2O) 71.64g/L磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2PO4)31.21g/L分別加蒸儲(chǔ)水1000mL配成A、B液；取A液51ml,B液49ml混合，再加入100ml蒸儲(chǔ)水混勻，即為pH6.8的0.1mol/L磷酸緩沖液。Giemsa應(yīng)用液取2ml Giemsa染液與40ml 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液混合而成。臨用現(xiàn) 配。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠是微核試驗(yàn)的常規(guī)動(dòng)物。體重為 25g 35g也可選用成年大鼠， 體重為150g 200g劑量分組：一般取受試物一般至少設(shè)3個(gè)劑量。每個(gè)劑量組5只動(dòng)物。另外，

5、還 應(yīng)設(shè)溶劑對(duì)照和陽(yáng)性物對(duì)照組。常用環(huán)磷酰胺作為陽(yáng)性物對(duì)照，劑量可為 40mg/kg 體重。.實(shí)驗(yàn)步驟劑量分組：每種受試動(dòng)物一般至少設(shè) 3個(gè)計(jì)量（見(jiàn)下表）。每個(gè)計(jì)量 5-10只動(dòng) 物。另外，還映射溶劑對(duì)照（陰性對(duì)照）和（陽(yáng)性對(duì)照）。常用環(huán)磷酰胺 做陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為蒸儲(chǔ)水。受試物：對(duì)苯二酚，秋水仙素，氯化汞。受試物劑量組 別各受試小鼠1000個(gè)受檢細(xì)胞中含微核細(xì)胞數(shù)12 34567g910111213對(duì)苯二酚1201802403秋水仙素31L523_氯化汞31 _1213陰性對(duì)照蒸鋪水陽(yáng)性對(duì)照環(huán)罐酰胺 (40mkg)染毒途徑和方式染毒途徑視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，常用腹腔注射?4小時(shí)取材。試驗(yàn)方法(

6、1)骨髓的制取用斷頸法處死小鼠。用剪刀剪開(kāi)腿部的皮膚，用鐐子夾住 小鼠的股骨，剪去股骨周?chē)募∪?，將小鼠的兩股骨取出，擦凈股骨上?肌肉。去股骨的魏面，將吸有 0.85% Nacl生理等滲液小注射器的針頭插 入，反復(fù)幾次吹出骨髓細(xì)胞。反復(fù)吹打使其混合均勻，制成細(xì)胞懸液。 將細(xì)胞懸液在1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄除上清液。 涂片在離心管中加入少量的小牛血清(約0.3ml)混勻后，按血常規(guī)涂片法涂片, 長(zhǎng)度約2cm3cm馀片時(shí)一次涂成)。在空氣中晾干。固定將干燥的涂片放入甲醇液中固定 5min。即使當(dāng)日不染色，也應(yīng)固定 后保存。染色將固定過(guò)的涂片放入 Giemsa應(yīng)用液中，染色20min30min

7、,然后 立即用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗。封片用濾紙及時(shí)擦干染片背面的水滴，再用雙層濾紙輕輕按壓染片，以 吸附染片上殘留的水分，再在空氣中晃動(dòng)數(shù)次，以促其盡快晾干，然后放 入二甲苯中透明5min,取出滴上適量光學(xué)樹(shù)脂膠，蓋上蓋玻片，寫(xiě)好標(biāo) 簽。觀察與計(jì)數(shù)先用低倍鏡，后用高倍鏡粗略檢查，選擇細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞無(wú) 損，著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，再在油浸鏡下計(jì)數(shù)。雖然不計(jì)數(shù)含微核的有核細(xì)胞， 但需用有核細(xì)胞形態(tài)染色完好做好判斷制片優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。選擇細(xì)胞完整、分散均勻，著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，在油鏡下觀察。以有 核細(xì)胞形態(tài)完好作為判斷制片優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn) 。本法系觀察嗜多染紅細(xì)胞的微核。用Giemsa染色法，嗜多染紅細(xì)胞

8、 呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞呈粉紅色。典型的微核多為單個(gè)的、圓形、邊緣光 滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色，直徑通常為紅細(xì)胞的1/201/5。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。數(shù)據(jù)處理：利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS的單因素方差分析或t檢驗(yàn)等方法，進(jìn)行數(shù)據(jù) 處理，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理：組別劑量動(dòng)物數(shù)受檢細(xì)胞數(shù)含微核細(xì)胞數(shù)微核率P值（g/kg體重）（只）（個(gè)）（個(gè)）件）受120對(duì)苯二 酚8040溶劑對(duì)照（蒸豳水）陽(yáng)性物對(duì)照環(huán)磷酰 胺（mg/kg體重）50兩人一只100032320.0322）利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS做單因素方差分析或T檢驗(yàn)等

9、方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果：受試物劑 量 mg/Kg組 別各受試小鼠1000個(gè)受檢細(xì)胞中含微核細(xì)胞數(shù)123456789101112131415對(duì)苯 二酚1201383335373435363034393140323633802283130322928332726293230272928403202521232826242219282225212327秋水 仙素313633323435313137313835303936351.5229252326242725243026282325272913242123201925221918252224202321氯化 汞31222520262123

10、2218272423221726202216222119201817152315212022171613131715161415171317151614121813陰性 對(duì)照 蒸播 水321435392435871陽(yáng)性 對(duì)照 環(huán)磷 酰胺40m g/kg 體 重384445403641433935433944394542.對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論：由于這次試驗(yàn)涉及到兩個(gè)變量，只能用方差分析，應(yīng)用最顯著差數(shù)（LSD法）和Duncan法分別對(duì)三種受試物：（對(duì)二苯酚，秋水仙素，氯化汞）的三種不同濃度進(jìn)行檢驗(yàn)。其結(jié)果如下：對(duì)二苯酚：ANOVA微核數(shù)Sum ofSquaresdfMean Squ

11、areFSig.Between Gr ups26732.836213366.4182068.325.000Within Groups8485.17913136.462Total35218.0151315 假設(shè)：Ho:對(duì)二苯酚的三種濃度對(duì)老鼠細(xì)胞微核數(shù)影響顯著。H1 :對(duì)二苯酚的三中濃度對(duì)老鼠細(xì)胞為核數(shù)影響不顯著.(2)確定顯著水平0c=0.05,(3)數(shù)據(jù)處理從表中可看出P3,12 且 P3.12 且 P0.05即，接受原假設(shè)。但是看不出那一種結(jié)果較明顯。對(duì)上述實(shí)驗(yàn)做多重比較-11 -如下：Post Hoc TestsMultiple ComparisonsDependent Variable

12、:微核數(shù)(I)劑量(J)劑量MeanDifference (I-J)Std. ErrorSig.95% Confidence IntervalLower BoundUpper BoundLSD3ml2ml3.6000(*).92238.0001.73865.46141ml7.4000(*).92238.0005.53869.26142ml3ml-3.6000(*).92238.000-5.4614-1.73861ml3.8000(*).92238.0001.93865.66141ml3ml-7.4000(*).92238.000-9.2614-5.53862ml-3.8000(*).92238

13、.000-5.6614-1.9386* The mean difference is significant at the .05 level.Homogeneous Subsets微核數(shù)劑量NSubset for alpha = .05123Duncan1ml1515.0000(a)2ml1518.80003ml1522.4000Sig.1.0001.0001.000Means for groups in homogeneous subsets are displayed.a Uses Harmonic Mean Sample Size = 15.000.氯化汞的三種濃度對(duì)微核數(shù)的影響明顯，但是看不出哪一種濃度的影響最明顯。ANOVA微核數(shù)Sum ofSquaresdfMean SquareFSig.Between Groups10193.633110193.6331275.723.000Within Groups223.733287.990Total10417.36729-12 -.實(shí)驗(yàn)總結(jié)三種受試物分別對(duì)老鼠細(xì)胞產(chǎn)生微