氣質(zhì)聯(lián)用法測定市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量

1、氣質(zhì)聯(lián)用法測定市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量概述氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate , EC）是一種具有基因致 癌的多位點致癌物質(zhì)，在 2007年 2月被國際癌研究機構(gòu)將其從 2B類（“可能令人類患癌的物質(zhì)”）升級為2A類（“能令人類患癌的物質(zhì)”）致癌物質(zhì) 1 ， 2 ，但是在它被定義為可能致癌 物質(zhì)以前， 它曾經(jīng)在醫(yī)學上作為抗腫瘤藥物和麻醉劑使用過 3 。 它是發(fā)酵食品（如醬油、腐乳、奶酪）和酒精飲品在發(fā)酵過程中 的中間產(chǎn)物 4 。醬油是我國各大菜系中一種傳統(tǒng)的調(diào)味品， 它是用豆、 麥或 者麩皮釀造的液體調(diào)味品， 因為這種釀造技術(shù)屬于發(fā)酵工程， 在 發(fā)酵過程中容易發(fā)生各種復(fù)雜的化學反

2、應(yīng)，生成如氨基甲酸乙 酯、氯丙醇、酚醛類等物質(zhì)。其中氨基甲酸乙酯這一物質(zhì)作為一 種 2A 類致癌物質(zhì)，它具有生物遺傳毒性，在進入人體后會對免 疫系統(tǒng)造成不可逆的損傷，它在人體內(nèi)被細胞色素 P450氧化后， 氧化產(chǎn)物能夠誘導Cy 2+調(diào)控的DNA發(fā)生損傷，從而導致癌變 5 。所以越來越多的國家認識到這種物質(zhì)的危害性，國際上現(xiàn) 行的氨基甲酸乙酯的檢測方法是氣質(zhì)聯(lián)用檢測法 6 ，我目前對 醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定及檢測方法尚無標準， 本研究以 固相萃取結(jié)合GC/MS建立一種使用外標法來測定市售醬油中氨 基甲酸乙酯的含量的方法， 為貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定作一定參考。試驗材料、試劑

3、及儀器 正己烷使用液：（色譜純）天津市化學試劑廠二氯甲烷使用液：（分析純）成都金山化學試劑XX公司甲醇使用液；（分析純）純度99.5%，天津市富宇精細化 工XX公司。丙酮使用液；（分析純）天津市康科德科技XX公司氨基甲酸乙酯標準品；1號醬油；味莼園牌黃豆醬油，貴陽味莼園食品XX公司2號醬油；味莼園牌特鮮醬油，貴陽味莼園食品XX公司3號醬油；味莼園牌衛(wèi)生醬油，貴陽味莼園食品XX公司4號醬油；味莼園牌鮮醬油，貴陽味莼園食品XX公司5 號醬油；黃豆醬油，貴陽市白云區(qū)醬菜廠氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用儀；安捷倫公司 7890A/5975C 型 GC/MS 實驗室專用超純水機；四川沃特爾科技發(fā)展XX公司固相萃

4、取儀； 12位方缸固相萃取裝置，月旭材料科技（上海）XX公司實驗條件儀器條件進樣口溫度230C,初始柱溫100C保持3min,階升20C至 180C，后運行230C保持2min，分流模式，分流比1: 10，溶 劑延遲2min,全掃描模式。固相萃取條件醬油中成分復(fù)雜， 基質(zhì)種類繁多， 極容易對檢測結(jié)果造成干 擾，所以在進行儀器分析方法檢測含量之前對醬油進行預(yù)處理， 盡可能的進行分離純化，將其中所含的EC提取出來7。由于氨 基甲酸乙酯屬于極性易溶于水的物質(zhì) 7 ，為保證醬油中樣品檢 測的回收率，經(jīng)過實驗證明 EC需停留在萃取柱中的萃取時間在 30min，選擇添加丙酮-二氯甲烷（V/V）洗滌液來進行

5、洗脫，而 且體積比為1:9的丙酮-二氯甲烷洗脫液過 C18萃取小柱時，回 收效果最好。氨基甲酸乙酯氣質(zhì)聯(lián)用的定性離子的確定建立一個氨基甲酸乙酯檢測方法，進樣口溫度230C，選擇分流模式，分流比1:10;柱溫：初始100C,保持3min,后20C/min 上升至180C，后運行230C,保持2min,輔助加熱器230C； MS條件：溶劑延遲2min，全掃描模式，全掃描參數(shù)開始 30結(jié) 束 450。以濃度為10卩g/mL的EC標準溶夜進樣一次，檢測得到一個 峰型較好的峰圖,對質(zhì)譜圖進行 Nist 譜庫檢索,譜庫檢索為氨 基甲酸乙酯這一物質(zhì),并確定保留時間為 5.75min ,確定氨基甲 酸乙酯的定

6、性離子為 44、62、89,總離子流圖如圖 1。試驗過程標準曲線的繪制EC 標準溶液的配置用分析天平精密稱定100mg在120C干燥至恒重的EC標準 樣品，用甲醇定容至100ml得到濃度為1mg/mL的母液（冰箱里 3C存放）；準確吸取 1000卩L母液于100mL的容量瓶中用甲醇 定容至刻度，所得溶液即濃度為 10卩g/mL的標準溶液。4.1.2梯度濃度的EC標液的配置準確量取 100 卩 L、1000 卩 L、2000 卩 L、5000 卩 L、10000 卩 L 濃度為10卩g/mL的EC標準溶液置于10mL的容量瓶中用甲醇定 容至刻度，即為 0.1 卩 g/mL、1.0 卩 g/mL、

7、2.0 卩 g/mL、5.0 卩 g/mL、 10.0卩g/mL的EC標準溶液。標準曲線的制作： 按照 3.3 的方法分別進樣 5個不同 濃度的EC標液，然后以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標建立標 準曲線。4.2 樣品處理稱取1號市售醬油5mL于干燥潔凈的燒杯中，對固相萃取柱 作如下處理，將固相萃取柱裝上樣，依次用2mL甲醇和正己烷活 化萃取小柱，接著再用4mL純化水平衡萃取小柱。將燒杯中的醬 油倒入萃取小柱中抽真空， 讓醬油停留在萃取小柱中保持 30min， 然后將萃取小柱上的醬油緩慢抽到廢液管中， 再用正己烷淋洗以 洗去雜質(zhì)，最后用 1：9 丙酮-二氯甲烷洗脫液以自然流速洗脫， 洗脫液置于4

8、5C恒溫水浴鍋中濃縮至 0.3mL左右，轉(zhuǎn)移至進樣 瓶中并用甲醇加至1mL對2到5號醬油同操作。4.3醬油中氨基甲酸乙酯含量的測定將 4.4 中的 1 至 6 號醬油處理液用標簽紙做好相應(yīng)標記， 按 順序放入GC/MS自動進樣器的旋轉(zhuǎn)盤上。調(diào)用方法，并且改變 MS掃描模式為離子掃描模式，離子掃描參數(shù)44、62、89。分別進樣 1至 5號進樣瓶， 檢測五個樣品中的氨基甲酸乙酯含量， 每 個樣品瓶分別進樣 6 次。加標回收率試驗取2號醬油樣品（含量約 0.43卩g/mL） ImL,分別添加0.5卩g/mL和0.75卩g/mL和1.0卩g/mL的EC標準溶液各1mL 每個濃度的標準溶液都添加三份，

9、共九份， 按照 3.3 項下的檢測 方法進行檢測，檢測出加標后的測定值。加標回收率公式： 加標回收率 =（加標試樣測定值 - 試樣測定 值）/加標量x 100%精密度實驗取 5 號醬油處理液， 連續(xù)六次測定數(shù)據(jù)， 計算相對標準偏差。線性范圍取濃度為10卩g/mL的EC標準溶夜，GC/MS進樣1卩L,選擇 離子掃描模式檢測，以 62 離子作為定量離子峰，以氨基甲酸乙 酯濃度為橫坐標， 62 離子強度為縱坐標做標準曲線 8 ，在安捷 倫工作站里建立曲線校正方法，得出它的線性條件和線性范圍。檢測限的測定取濃度為2卩g/mL的氨基甲酸乙酯標準液，GC/MS進樣1卩L, 對其進行性能報告分析，然后根據(jù)信

10、噪比公式D=3S/N,由此推 算出學院GC/MS儀器用這種方法檢測氨基甲酸乙酯的檢測限。結(jié)果分析由實驗結(jié)果可知氨基甲酸乙酯標準溶液在 1-10卩g/mL濃度 范圍之間線性關(guān)系良好，實驗所得線性方程為 Y=2.906X-7.925 ( r2=0.9938 )。由性能報告峰譜圖89,所以其檢測限應(yīng)該為0.014卩g/mL, 按照信噪比S/N為10得出定量限為0.048卩g/mL?；厥章蕦嶒灥慕Y(jié)果分析平均回收率為97.78%, RSD為2.59%,表明該方法準確度較 高,可以準確地檢測出醬油中的氨基甲酸乙酯的含量。精密度實驗結(jié)果分析5號醬油的相對標準偏差 RSD(n=6)為6.5%,表明該儀器 精密

11、度良好。市售醬油中的氨基甲酸乙酯含量確定貴州地區(qū) 5種市售醬油結(jié)果見表 1,表明 1 至 4號醬油中氨 基甲酸乙酯濃度較 5號醬油中的多。結(jié)束語經(jīng)過固相萃取和液液萃取的結(jié)果分析, 該方法用到固相萃取 對醬油進行凈化和提純是因為EC這一物質(zhì)在C18萃取柱中溶解度比在液體中的溶解度高,固相萃取法能有效分離提取醬油中 EC經(jīng)過GC/MS儀器檢測后，利用系統(tǒng)自帶的質(zhì)譜可以輕易的發(fā) 現(xiàn)EC這一物質(zhì)，雖然學院的氣質(zhì)聯(lián)用儀在這個實驗中檢驗的質(zhì) 譜和標準譜庫中的EC質(zhì)樸圖并不完全一樣，但是這是由于EC的 物質(zhì)結(jié)構(gòu)和我們所用的質(zhì)譜檢測器的檢測原理不同而造成的 9 ，這并不影響實驗結(jié)果。GC/MS僉測法的相對標準偏差為 6.5% (n=6)，這種方法的 檢測限為0.014卩g/mL,線性范圍為1-100卩g/mL，加標回收率