Western-blot的原理、操作及注意事項(xiàng)(經(jīng)過(guò)真實(shí)的實(shí)驗(yàn))

1、-可編輯修改-Westernblot的原理、操作及注意事項(xiàng)（經(jīng)過(guò)真實(shí)的實(shí)驗(yàn)）原理：通過(guò)電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過(guò)特異性試劑（抗體）作為探針，對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測(cè)到低至15ng（最低可到10-100pg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的選擇和制備A:樣品的制備組織：組織的處理方法組織洗滌后加入3倍體積預(yù)冷的PBS,0C研磨加入5xSTOPbuffer,180W,6mins,0C超聲波破碎，5000rpm,5mins離心，取上清。加入p-ME（9.5ml加入0.5ml），溴酚藍(lán)（9.5ml加

2、入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20C保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。細(xì)胞：細(xì)胞的處理方法：離心收集細(xì)胞或者直接往細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入5xSTOPbuffer,收集，180W,6mins,0C超聲波破碎，5000rpm,5mins離心，取上清。加入p-ME（9.5ml加入0.5ml），溴酚藍(lán)（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20C保存，用時(shí)取出，直接溶解上樣。分泌蛋白的提?。ㄌ乩褐苯邮占置谝?，加入P-ME、溴酚藍(lán)制樣。B:蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因雙縮脲法：雙縮脲法是第一個(gè)用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法。在需要快速，但不很準(zhǔn)確的測(cè)定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，

3、這對(duì)蛋白質(zhì)提純的早期階段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，此物在540nm波長(zhǎng)處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L10g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測(cè)定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如Tris、Good緩沖液等?？捎贸恋矸ǔジ蓴_物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的1mNaOH溶解沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。Lowry法：此法是雙縮脲法的進(jìn)一步發(fā)展。他的第一步就是雙縮脲反應(yīng)，即Cu+與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物，然后這個(gè)絡(luò)合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑），結(jié)果得到深藍(lán)色物。此法比雙縮脲

4、法靈敏得多，適合于測(cè)定20mg/L400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液。其干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質(zhì)的存在會(huì)使結(jié)果嚴(yán)重偏差。另外要注意的是，加入福林試劑時(shí)要特別小心，試劑只在酸性pH環(huán)境中才穩(wěn)定，上述提到的還原反應(yīng)只有在pH10時(shí)才發(fā)生，因此，福林試劑加入到堿性的Cu2+-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立刻攪拌，以使磷鉬酸磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2+-蛋白質(zhì)絡(luò)合物所還原。紫外吸收法：大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，因此，利用這個(gè)特異性吸收，可以計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。如果沒有干擾物質(zhì)的存在，在2

5、80nm處的吸收可用于測(cè)定0.1-0.5mg/ml含量的蛋白質(zhì)溶液。部分純化的蛋白質(zhì)常含有核酸，核酸在260nm波長(zhǎng)處有最大吸收。有核酸時(shí)，所測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度必須作適當(dāng)校正，一般按下述公式粗略計(jì)算：蛋a慣濃度-1.55Ahni0.76山280260ImAA是蛋白質(zhì)溶液在280nm波長(zhǎng)處（光程1厘米）測(cè)得的光密度值。是蛋白質(zhì)溶液在260nm小波長(zhǎng)處（光程1厘米）處所測(cè)得的光密度值。此方程是從烯醇酶（在酵母核酸存在時(shí)）得出來(lái)的。因此，對(duì)其他蛋白質(zhì)和其他核酸不一定適用。由于各種蛋白質(zhì)所含芳香族氨基酸的量不同，因此，濃度為0.1%的各0L%種蛋白質(zhì)在280nm處的消光系數(shù)（）在0.52.5之間變化。所

6、有的蛋白質(zhì)在230nm以下都有強(qiáng)吸收。例如牛血清白蛋白的a0.1%在225nm和215nm處分別為5.0和11.7,而在280nm處測(cè)為0.5&在230nm以下的強(qiáng)吸收是由于肽鍵的存在，因此，此值對(duì)所有的蛋白質(zhì)都是一樣的。從215nm和225nm處的光密度之差可用于測(cè)定濃度為10ul/ml100ul/ml的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度可以近似地由下式得到：光密度之差求得，這一公式是減去溶液中非蛋白質(zhì)成分產(chǎn)生的誤差。但是，蛋白質(zhì)之間的分子量差異比較大，因此，在比較幾種蛋白質(zhì)含量時(shí)，必須作適當(dāng)?shù)男ＵＳ捎诘鞍踪|(zhì)的吸收峰常因dH改變而變化，所以在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，必須與樣品條件一致。Bradford比色法：Br

7、adford比色法比Lowry法測(cè)定蛋白濃度更簡(jiǎn)單迅速。用脫氧膽酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污劑、2-巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、Tris和一些堿性緩沖系統(tǒng)的干擾。分別在兩組微量離心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5,10,15和20山），以0.15mmol/lNaCl補(bǔ)足至100山，同時(shí)以兩管100山的0.15mmol/lNaCl作空白對(duì)照。每管各加入1ml考馬斯亮藍(lán)染料溶液，振蕩混勻，室溫放置2分鐘。用1cm光徑的微量比色杯測(cè)A595，取A595吸光值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度作圖，畫標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)量待測(cè)樣品的A595。從BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定待測(cè)樣品的濃度。測(cè)定10-100旳的蛋白質(zhì)，要在較

8、大試管中將染料溶液體積增大5倍進(jìn)行。樣品濃度過(guò)高，可稀釋后進(jìn)行，或在10-100旳另作一標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。5電泳估算法（我們選擇此法）：樣品倍比稀釋，SDS電泳，同時(shí)做定量marker對(duì)照，可以估算樣品大概濃度。以提取癌組織總蛋白為例：取等量胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織，用dH2O漂洗510次，再用預(yù)冷的1xPBS洗滌3次，目的是去除樣本中的血液。每2克組織加入3ml1xPBS勻漿，保持在4C條件進(jìn)行。加入5xSTOPBuffer緩沖液1ml，混勻，4C下超聲碎化。再加入0.5mlp-ME,0.5ml溴酚藍(lán)，煮沸10mins,至此，制樣過(guò)程完成；SDS電泳，以BAS作為對(duì)照估計(jì)樣品蛋白濃

9、度。二SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS）A:實(shí)際操作做膠前的準(zhǔn)備1）檢查是否有足夠的、干凈的spacer、comb和架子。2）檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。3）按將要檢測(cè)的抗體對(duì)應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計(jì)算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。制膠，電泳1）裝好架子。2）按照下面配方配制分離膠。（單位：ml,Total:8ml）7.5%10%15%2xSep.buffer44430%Gel.sol2.02.74ddH2O1.91.20TEMED8ul8ul8ul10%APS80ul80ul80ul在膠上面加入一層蒸餾水，促進(jìn)膠更好的凝集。3）待分離膠凝集后，配制濃縮膠。

10、（單位：ml，Total:3.5ml）3%2xStacking.buffer1.730%Gel.sol0.35ddH2O1.4TEMED5ul10%APS50ul倒好后插入預(yù)先準(zhǔn)備好的梳子。4）待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用60-80V電壓，當(dāng)樣品至分離膠時(shí)，用100-120V電壓。一般電泳時(shí)間在1.5小時(shí)左右。B：注意事項(xiàng)及常遇到的問(wèn)題1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。2）上樣蛋白量不應(yīng)超過(guò)30ug/mm2（載荷面即：如果你的膠槽是5mmx1mm，則載荷面為：1mmx5mm=5mm2）。3）gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集最好，過(guò)快表示TEMED、APS用

11、量過(guò)多，此時(shí)膠太硬易龜裂，而且電泳時(shí)容易燒膠。太慢則說(shuō)明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實(shí)際不純或?qū)嵭А?）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。5）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。-條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。拖尾：樣品溶解不好。紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量過(guò)多。三、轉(zhuǎn)移在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVD

12、F等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ（0.2umforMW20kDa）。A半干法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過(guò)濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因?yàn)殡娏髦苯幼饔迷谀つz上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時(shí)間短，效率高。實(shí)驗(yàn)條件的選擇電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間，具體可以根據(jù)實(shí)際適當(dāng)調(diào)整。目的蛋白分子大小（kDa）膠濃度轉(zhuǎn)移時(shí)間（h）801408%1.5-2.02

13、580101.515-40120.7520150.5實(shí)驗(yàn)操作（1）濾紙和膜的準(zhǔn)備（在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開始準(zhǔn)備工作）。檢查是否有足夠的transferbuffer，沒有立即配制。檢查是否有合適大小的濾紙和膜。將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入transferbuffer中。將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transferbuffer中。（2）轉(zhuǎn)移在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transferbuffer到膜上，保持膜的濕潤(rùn)。將膠剝出，去掉stackgel，小心的移至I膜上。剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。將一張靠膠濾

14、紙覆蓋在膠上。倒上些transferbuffer，再鋪兩張靠膠濾紙。裝好電轉(zhuǎn)移儀，根據(jù)需要選定所需的電流和時(shí)間。轉(zhuǎn)移過(guò)程中要隨時(shí)觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時(shí)調(diào)整。F4lErPapar/SDS詢TrarrgfefMerrfcite-Finfpjpm：AiKXfe帥即11JnIlwPiperAflodeEd姑11靠膠濾紙膠膜靠膜濾紙F(tuán)ig.lrSrni-Jryfranihr4i-&ckMamhiy注意事項(xiàng)及常遇到的問(wèn)題1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙=膜=膠。2）濾紙、膠、膜之間千萬(wàn)不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。3）因?yàn)槟さ氖杷裕け仨毷紫仍诩状贾型耆?。而且在以后的操作中，膜也必須隨時(shí)

15、保持濕潤(rùn)（干膜法除外）。4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過(guò)的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。5）轉(zhuǎn)移時(shí)間一般為1.5小時(shí)，（1mA-2mA/cm2,10%gel），可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流大小。B濕法我們基本上不用此方法，這里暫不做介紹C轉(zhuǎn)移后效果的鑒定1染膠用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來(lái)反映轉(zhuǎn)移的效果。2染膜有兩類染液選擇/可逆的和不可逆的?？赡娴挠衟onceau-sred、FastgreenFCCPTS等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析用。但是不可逆的染料，如

16、考馬斯亮蘭、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就不能用于進(jìn)一步的分析。四、封閉（block）封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。常用的封閉液有bovineserumalbumin（BSA），non-fatmilk，casein，gelatin，tween-20等，我們一般用non-fatmilk。在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好5%的Milk（TBST溶解）。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將膜放入milk中block（一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜），并清洗整理好用過(guò)的濾紙，以便下次使用。Block4C0/N，或RT1小時(shí)。五、孵育一抗先將需要檢測(cè)的抗體準(zhǔn)備好

17、，并決定好它們的稀釋度。配好5%的Milk（TBST溶解），按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀釋，最好采用梯度稀釋。將稀釋好的抗體和膜一起孵育。一般采用RT1小時(shí)，可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短時(shí)間。注意：為了便于后面分析結(jié)果，我們一般會(huì)選用已確定分子量大小而且純度高的抗體作為marker與一抗同時(shí)孵育。六、洗滌用TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。然后5mins*5。洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺。七、孵育二抗孵育RT1小時(shí)。一般采用HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例為1:5000。二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。

18、注意二抗的選擇有多種，要根據(jù)一抗來(lái)選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根據(jù)后面的顯色條件來(lái)選擇HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶鏈的二抗或者標(biāo)志其他探針（如核素等）的。八、洗滌用TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。然后5mins*5。洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。九、顯色（HRP酶）1增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）Ecl顯色原理：氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾（luminol,51-氨基-2,3-二氫-1,4-酞嗪二酮）的分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)反應(yīng)式如下：魯米諾在免疫測(cè)定中既可用作標(biāo)記物

19、，也可用作過(guò)氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過(guò)氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來(lái)。試驗(yàn)步驟：）將兩種顯色底物1:1等體積混合（一般各1ml/membrane）將混合物覆蓋在膜表面，1-2分鐘，搖晃使均勻。3）用保鮮膜把膜包起來(lái)，放入夾板中。）在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光1min。5）顯影、定影。6）根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間和曝光區(qū)域，得到最佳結(jié)果。注意：熒光在一段時(shí)間后會(huì)越來(lái)越弱。2.DAB顯色DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）和HRP反應(yīng)產(chǎn)生棕色的不溶終產(chǎn)物。這種棕色沉淀不溶于酒精和其它有機(jī)溶劑，對(duì)于必需使用傳統(tǒng)復(fù)染和封固介質(zhì)的免疫組化染色應(yīng)用特別理

20、想。對(duì)于AP標(biāo)記的二抗我們選用BCIPandNBT顯色，它們?cè)趬A性磷酸酶（AP）作用下反應(yīng)可生成一種不溶性黑紫色沉淀的強(qiáng)信號(hào)。十、分析結(jié)果及其判斷常見問(wèn)題原因分析及處理方法：見附錄一、二。附錄一：TroubleshootingBlottingProblems(P43-48)附錄二：WesternBlottingTroubleshootingLogicTree(P390-394)附錄三：試驗(yàn)中所用到的試劑和緩沖溶液5xStopSolution(Samplebuffer)pH6.7:Stock:touse:20%Glycerol100mltake9.5mlstock10%SDS50gor250ml20%SDSaddBME0.5ml250mMTris15.14gbromphenolblueortotal475.00mlpyronine4totasteGelsolution(30%w/vacrylamidemix):0.8bis-acryla