新的腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良基因突變1例的鑒定

1、新的腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良基因突變1例的斷定蘭風華楊渤生盧愛薇黃梁滸朱忠勇【關鍵詞】腎上腺白質(zhì)營養(yǎng)不良IdentifiatinfanvelutatinintheALDgenefahinesepatientithadrenleukdystrphy【摘要】目的：對1例腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良ALD患者及其家系成員的ALD基因的突變范例舉行斷定.要領：以外周血RNA為模板，接納長鏈RTPR技能，分4個片斷擴增ALD基因RNA的編碼序列，對4個PR產(chǎn)物舉行直接測序，篩查整個基因編碼區(qū).通過限定性內(nèi)切酶酶切闡發(fā)患者及其家系成員基因組ALD基因片斷，以進一步確證所創(chuàng)造的基因突變.效果：位于患者ALD基因第6外顯

2、子的第508位暗碼子存在一個新的錯義突變T(P508L)，患者母親為突變攜帶者，患者父親和妹妹不存在此突變.結論：創(chuàng)造中國ALD患者一個新的ALD基因突變，即P508L突變.【關鍵詞】腎上腺白質(zhì)營養(yǎng)不良；ALD基因；突變，誤義；ALD卵白0弁言腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(ALD,adrenleukdystrphy)是最常見的一種遺傳性中樞神經(jīng)髓鞘合成病變1.致病基因ALD基因位于X染色體，編碼一個有745個氨基酸殘基的過氧化物酶體膜卵白，即ALD卵白ALDprtein,ALDP.我們對1例腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良患兒及其家庭成員的ALD基因突變舉行了闡發(fā).1工具和要領12要領ALD基因的RNA長3.7k

3、b，此中編碼區(qū)為2238bp.本研究合成4對引物2，即：PIF和RT1,PF和RT2,PF和RT3,PF和RT4，分4段自5端依次為ALD1,ALD2,ALD3,ALD4對ALD基因編碼區(qū)舉行擴增，預期巨細別離是722,700,723和646bp，此中ALD1的3端和ALD2的5端部門重疊，ALD2的3端和ALD3的5端部門重疊，ALD3的3端和ALD4的5端部門重疊.假設以PIF和RT4為引物對擴增ALD基因DNA，預期片斷巨細是2440bp.引物托付上海生工Sangn生物工程公司合成.121長鏈RTPR及測序從患者取奇怪抗凝血1.53L，按Qiagen產(chǎn)物RNeasyiniKit說明書提取

4、總RNA.長鏈RTPR按TaKaRa試劑盒RNALAPRTKit說明書舉行.先舉行反轉(zhuǎn)錄，然后在PE2400型熱循環(huán)儀上舉行PR反響：94變性2in后，按9430s,6030s,722in循環(huán)30次.末了一個循環(huán)竣事后繼承在72延伸8in.將上述PR混淆物1020L上樣于15gL-1的瓊脂糖凝膠電泳，切下含預期片斷2440bp的膠塊，利用Qiagen的DNA凝膠接納試劑盒QIAquikGelExtratinkit從膠塊中接納DNA.以此DNA為模板，組配4個2次PR反響：反響體積50L，含模板1ng,引物各25pl,4種dNTP各0.2lL-1,Taq酶BiAsia2.5U,gl21.5lL-

5、1，別離擴增ALD1,ALD2,ALD3,ALD4，擴增條件同一為：94預變性2in后，按9430s,5030s,7260s舉行1015個循環(huán)，末了一個循環(huán)竣事后繼承在72延伸9in.用Qiagen的PR產(chǎn)物純化試劑盒QIAquikPRPurifiatinKit直接從PR混淆液中純化PR產(chǎn)物.將純化的4個片斷連同相應PR引物，寄上海博亞生物技能舉行序列測定.122基因組DNA片斷擴增和限定性內(nèi)切酶闡發(fā)患者及其家庭成員的外周血基因組DNA利用Qiagen的DNA提取試劑盒QIAapDNABldiniKit提取.按照突變地點部位，用iga2.0軟件方案針對外顯子6全長序列的PR引物，上游引物(PA

6、5F)序列為：5TGGTTTGGGTA3，卑劣引物PA5R序列為：5AAGGTTTGGT3，預期擴增片斷長330bp.擴增條件：95預變性4in后，按9430s,5530s,7230s舉行30個循環(huán).用Qiagen的PR產(chǎn)物純化試劑盒QIAquikPRPurifiatinKit從PR混淆液中純化PR產(chǎn)物.按照突變的性子，用限定性內(nèi)切酶BspLIBIFerentas對純化的PR產(chǎn)物舉行酶切,于100gL-1聚丙烯酰胺凝膠上電泳,溴化乙啶染色后用美國BiRad公司的FlurS型凝膠成像儀網(wǎng)羅電泳效果.2效果21ALD基因RNA的RTPR擴增及測序用長鏈RTPR試劑盒對患者外周血ALD基因RNA的整

7、個編碼區(qū)舉行擴增，可得到預期的擴增片斷2440bp，也可見一些非特異性片斷.為進步特異性，并得到充足的PR產(chǎn)物，先從凝膠中接納上述覆蓋整個編碼區(qū)的擴增產(chǎn)物，然后分4段ALD1,ALD2,ALD3,ALD4舉行第2輪PR反響.2次PR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠15gL-1電泳效果(Fig1)，14依次是ALD4,ALD3,ALD2和ALD1，4個片斷均得到特異性擴增，其巨細與預期完全符合.直接用Qiagen試劑盒從2次PR混淆物中純化ALD1,ALD2,ALD3,ALD44個片斷后，用美國ABI公司的BigDye體系在377型測序儀上別離對其舉行序列測定.正常比較(Fig2A)和患者(Fig2B)ALD3

8、片斷部門序列，序列下劃線處示產(chǎn)生突變的暗碼子部位.效果表現(xiàn)，患者ALD基因RNA僅有一個堿基產(chǎn)生改變1523T，即第508個暗碼子位于ALD3片斷上產(chǎn)生了T的改變，使正常的脯氨酸被亮氨酸更換.正、反向測序效果同等.圖1-圖2(略)22限定性內(nèi)切酶闡發(fā)以患者及其家庭成員的基因組DNA為模板，擴增突變地點的ALD基因第6外顯子，擴增片斷330bp.正常環(huán)境下，該片斷內(nèi)含有2個BspLI酶切位點GGNN，酶切后產(chǎn)生72,34和224bp3個片斷.患者第508暗碼子的T突變導致72與34bp片斷之間的酶切位點消散，酶切效果產(chǎn)生106和224bp2個片斷.酶切后的電泳效果(Fig3)，可以看出：患者父親

9、和妹妹的酶切形式為正凡人形式含72,34和224bp3個片斷，患者的酶切形式與預期符合含106和224bp兩個片斷，患者母親的酶切圖譜中既有106和224bp兩個片斷，也有72和34bp兩個片斷，為雜合子攜帶者.以上效果還顛末對330bp片斷的直接序列測定證明.圖3患者及其家庭成員ALD基因外顯子6擴增產(chǎn)物的酶切闡發(fā)(略)3討論本患者6歲起病，以舉行性視力落落等中樞神經(jīng)體系病癥為主，病程希望敏捷1a內(nèi)生長成雙目失明，頭部RI查出典范的大腦頂枕部長T1和長T2信號病灶，血漿極長鏈飽和脂肪酸濃度升高240/220比值超出參考范疇，切合兒童大腦型ALD的臨床診斷1.ALD表示出高度的遺傳異質(zhì)性.按照

10、有關國際權力巨子數(shù)據(jù)庫.xald.nl統(tǒng)計，如今在環(huán)球ALD患者中已斷定出500多個ALD基因突變此中有一部門未頒發(fā)，僅在互聯(lián)網(wǎng)上宣布，此中有一半以上僅見于單一家系.本病在臨床表示方面表示型也是高度異質(zhì)的，同一家屬的差異患者在起病時間和臨床病癥上也每每不盡雷同3.表示型的異質(zhì)性說明開展臨床基因診斷的需要性，但遺傳的高度異質(zhì)性又使臨床基因診斷的開展面對較大困難.我們曾報道在中國ALD患者創(chuàng)造的第1個基因突變2,4，本例P508L突變是在中國人群創(chuàng)造的第2個ALD基因突變.查閱國表里文獻，尚未見有關此突變的報道.以下幾點支持該突變是病理性突變的不雅點：患者的ALD基因的整個編碼區(qū)只存在一個堿基改變

11、1523T，別的部門與正常比較的序列和GenBank參考序列N000033同等；患者父親和妹妹的ALD基因不存在該突變，其母親為攜帶者，與ALD作為X染色體隱性遺傳病的特點切合；突變使ALDP的第508位氨基酸由Pr釀成另一個與之性子差異較大的Leu；突變所改變的氨基酸位于ALDP成效區(qū)ATP結合區(qū)守舊序列內(nèi)5；1999年Takan等曾報道在緊鄰的第507位氨基酸產(chǎn)生的一個突變，即G507V3.該突變詳細怎樣影響ALDP的布局和成效，有待進一步研究.以往ALD基因的突變闡發(fā)在技能上大多接納通例RTPR要領：先合成DNA，然后分段對DNA舉行擴增6.我們將新開拓的長鏈RTPR技能引入ALD基因的

12、突變闡發(fā)中：先擴增ALD基因RNA編碼區(qū)全長，然后分段舉行2次PR擴增.該技能途徑簡化了操縱，進步了重復性，淘汰了引物數(shù).該技能途徑在本研究的樂成應用，將為以后其他患者的基因診斷帶來便當.【參考文獻】1TangBS,LiHY.PrgressinthestudyfXlinkedadrenleukdystrphyJ.GuaiYixueShenjingbingxueShenjingaikexueFene(FrEignedSiSetNeurlNeursur),2001;28(3):185-188.2uYB,uYS,YangBS,LanFH.utatinalanalysisfahinesepatient

13、ithXlinkedadrenleukdystrphyJ.ShanghaiYixueJianyanZazhi(ShanghaiJedLabSi),2002;18(2):69-72.3TakanH,KikeR,ndera,SasakiR,TsujiS.utatinalanalysisandgentypephentyperrelatinf29unrelatedJapanesepatientsithXlinkedadrenleukdystrphyJ.ArhNeurl,1999;56(3):295-300.4LanFH.leulardiagnstisinhinaJ.linheLabed,2001;39(12):1190-1194.5RerigP,ayerhferP,HlzingerA,GrtnerJ.haraterizatinandfuntinalanalysisfthenuletidebindingf