散射光和拉曼光的影響及消除

1、3散射光和拉曼光的影響及消除 蕾萊（瑞利）（Rayleigh scattering light）散射光光子和物質(zhì)分子碰撞時，未發(fā)生能量交換，僅運動方向發(fā)生改變，其波長和入射光波長相同，這種散射光叫做瑞利散色光。發(fā)射光波長與激發(fā)光波幾乎相等。由溶劑、容器、膠體等散射引起，距離熒光峰較遠(yuǎn)，只要選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL，由單色器消除。 3散射光和拉曼光的影響及消除拉曼散射光Raman scattering light)光子和物質(zhì)分子碰撞時，在光子運動方向發(fā)生改變的同時，將部分能量轉(zhuǎn)給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子得到能量，均使光子能量發(fā)生改變。前者使光子能量減少，波長比入射光更長；后者使光子能量增加，波長比入射光要短，

2、這兩種光均稱為拉曼散色光。 發(fā)射光波長與熒光波長相近，即與熒光峰靠近，難區(qū)別。由空白溶劑產(chǎn)生。3散射光和拉曼光的影響及消除消除方法：因為熒光波長不隨激發(fā)光的改變而改變，而拉曼散射光隨激發(fā)光改變而改變，所以，只要采用波長較短的激發(fā)光進行激發(fā)，就可避免干擾。例如，硫酸喹啉及其溶劑（硫酸溶液）在不同波長激發(fā)下的散射光。 3散射光和拉曼光的影響及消除350熒光448350拉曼400320拉曼360320熒光448拉曼360溶劑的激發(fā)光譜,拉曼散射硫酸喹啉及其溶劑（硫酸溶液）在不同波長激發(fā)下的光譜。320nm激發(fā)350nm激發(fā)3散射光和拉曼光的影響及消除硫酸喹啉分別用320nm，350nm激發(fā)時的熒光光

3、譜。320nm激發(fā)，拉曼光在360nm，對熒光（448nm）無影響；350nm激發(fā)，拉曼光在400nm，與熒光（448nm）疊加，產(chǎn)生干擾。因此，采用波長較短的激發(fā)光（320nm）進行激發(fā)，就可避免拉曼光的干擾。 第二節(jié) 分子熒光光譜儀 熒光計、熒光分光光度計基本結(jié)構(gòu)相似。 儀器基本結(jié)構(gòu) 由激發(fā)光源、樣品池、用于選擇激發(fā)光波長和熒光波長的單色器、檢測器及記錄儀組成。 熒光光譜儀激發(fā)單色器或濾光片記錄儀發(fā)射單色器或濾光片熒光光源激發(fā)樣品池檢測器儀器測量基本原理 由光源發(fā)射的光經(jīng)激發(fā)單色器得到所需的激發(fā)光波長，通過樣品池后，一部分光能被熒光物質(zhì)所吸收，熒光物質(zhì)被激發(fā)后，發(fā)射熒光。可以在溶液的各個方

4、向觀察到熒光，但由于激發(fā)光一部分可透過溶液，為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發(fā)光成直角的方向上進行。為消除可能共存的其它光線的干擾，如由激發(fā)所產(chǎn)生的反射光、Raman光以及為將溶液中雜質(zhì)濾去，以獲得所需的熒光，在樣品池和檢測器之間設(shè)置了發(fā)射單色器。熒光作用于檢測器上，得到響應(yīng)的電信號。注意熒光測量方向。 1. 光源 在紫外-可見區(qū)范圍，通常的光源是熒光計用溴鎢燈或高壓汞燈。 熒光分光光度計用氙弧燈，連續(xù)光源，可用于200700nm，在300400nm光譜強度幾乎相等。 新型激發(fā)光源：高功率連續(xù)可調(diào)染料激光光源。2.單色器 激發(fā)單色器（第一單色器）在光源和樣品池之間，濾去非特征

5、波長的激發(fā)光。發(fā)射單色器（第二單色器）在樣品池和檢測器之間設(shè)置，為消除可能共存的其它光線的干擾，如由激發(fā)所產(chǎn)生的反射光、Raman光以及將溶液中雜質(zhì)濾去，以獲得所需的熒光，。熒光計用濾光片作單色器，分光能力差。熒光分光光度計用棱鏡或光柵作單色器，分光能力強。 3. 樣品池?zé)晒庥玫臉悠烦仨氂玫蜔晒獾牟牧现瞥?，四面透光，通常用石英，形狀以方形和長方形為宜。 4.檢測器熒光計用光電池或光電管，熒光分光光度計用光電倍增管作檢測器，并與激發(fā)光成直角。 第三節(jié) 分子熒光光譜法的應(yīng)用一、定性分析二、定量分析三、其他應(yīng)用分析方法的特點 靈敏度高：視不同物質(zhì)，檢測下限在0.10.001g/mL之間。比UV-Vi

6、s的靈敏度高得多！WHY？ 選擇性好：可同時用激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜定性。 試樣量少和方法簡單結(jié)構(gòu)信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強、熒光量子效率、熒光壽命等。 應(yīng)用不廣泛：主要是因為能發(fā)熒光的物質(zhì)不具普遍性、增強熒光的方法有限、外界環(huán)境對熒光量子效率影響大、干擾測量的因素較多。 一、定性分析任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒（磷）光定性分析的基礎(chǔ)。定性鑒定物質(zhì)的可靠性較紫外可見光譜更強，但定性必須有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在同樣條件下對照。 二、定量分析熒光強度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率 。 If = Ia 式中為熒光量子效率，又根據(jù)Beer定律Ia = I0

7、 - I = I0(1- 10 - b C) I0和I分別是入射光強度和透射光強度。代入上式得 1熒光強度與溶液濃度的關(guān)系1熒光強度與溶液濃度的關(guān)系If = I0(1- 10 - b c) If = I0(1- e -2.303bc) Taylor展開： 當(dāng)lc0.05時， If =2.303I0bc當(dāng)入射光強度I0 和b一定時，上式為：If=kc1熒光強度與溶液濃度的關(guān)系即熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成之正比，作為熒光定量分析的依據(jù)。但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，當(dāng)bc0.05時才成立。對于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度和濃度不呈線性關(guān)系。If =2.303I0bc提高入射

8、光強度I0，有利于提高靈敏度，改變量子產(chǎn)率，有利于提高靈敏度；當(dāng)增加，熒光強度If增加。1熒光強度與溶液濃度的關(guān)系對于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度和濃度不呈線性關(guān)系。這種彎曲，隨著樣品池厚度的增加而出現(xiàn)得更早。 熒光光度法的靈敏度比紫外可見光度法高的原因（1）增大光源強度，可提高熒光測定的靈敏度，而不能提高紫外-可見分光光度法的靈敏度；（2）熒光光度法直接測定發(fā)射熒光的強度，熒光強度大，信號強；而紫外可見光度法測定吸收光前后的強度變化（吸光度），信號弱。熒光光度法的選擇性比紫外可見光度法高的原因熒光光譜有激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。能吸收光的物質(zhì)不一定都能發(fā)熒光；不同物質(zhì)吸收某一相

9、同波長的光后所發(fā)射的熒光波長也不盡相同。標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)作熒光強度測量時，標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)的作用是什么？如何進行測量的？ 答：作熒光強度測量時，標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)的作用是校正儀器，用標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)把儀器讀數(shù)定位到某個值，以此為標(biāo)準(zhǔn)，測定空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液的（相對）熒光強度，使標(biāo)準(zhǔn)樣和樣品溶液有一較好的讀數(shù)。2.單組分的熒光直接測定和間接測定 直接測定：被測物發(fā)熒光間接測定：利用化學(xué)反應(yīng)使非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟苡糜跍y定的熒光物質(zhì)；熒光猝滅法，利用某物質(zhì)使熒光化合物的熒光降低來進行測定。如對氟、硫、鐵、銀等的測定。應(yīng)用于無機化合物有機化合物定量方法：當(dāng)lc0.05時， If =2.303I0bc當(dāng)入射光強度

10、I0 和b一定時，上式為：If=kc標(biāo)準(zhǔn)曲線法、直接比較法求出被測物濃度 。2.單組分的熒光直接測定和間接測定 3.多組分的熒光測定由于有激發(fā)和發(fā)射波長可分別選擇，因此選擇性也較好，方法靈敏度比吸收光度法高13數(shù)量級。 三、其他應(yīng)用（自學(xué)）激光誘導(dǎo)熒光分析法具有超高靈敏度，可應(yīng)用于生物大分子的分析。1.溶液中單分子行為的研究2.基因研究及檢測第四節(jié) 磷光光譜法與熒光相比，磷光具有如下三個特點：（1）磷光輻射的波長比熒光長 分子的T1態(tài)能量比S1態(tài)低。（2）磷光的壽命比熒光長 由于熒光是S1 S0躍遷產(chǎn)生的，這種躍遷是自旋許可的躍遷，因而S1態(tài)的輻射壽命通常在10-7 10-9s，磷光是T1 S

11、0躍遷產(chǎn)生的，這種躍遷屬自旋禁阻的躍遷，其速率常數(shù)要小，因而輻射壽命要長，大約為10-4 10s，（3）磷光的壽命和輻射強度對于重原子和順磁性離子敏感。 一、低溫磷光 低溫磷光分析中，液氮是最常用的合適的冷卻劑。因此要求所使用的溶劑，在液氮溫度（77K）下應(yīng)具有足夠的粘度并能形成透明的剛性玻璃體，對所分析的試樣應(yīng)具有良好的溶解特性。試樣的剛性可減少磷光的碰撞猝滅。 一、低溫磷光溶劑的選擇 溶劑應(yīng)易于提純，以除去芳香族和雜環(huán)化合物等雜質(zhì)。溶劑應(yīng)在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)沒有很強的吸收和發(fā)射。最常用的溶劑是EPA，它由乙醇、異戊烷和二乙醚按體積比為2：5：5混合而成。使用含有重原子的混合溶劑IEPA（由

12、EPA：碘甲烷=10：1組成），有利于系間跨越躍遷，可以增加磷光效應(yīng)。 二、室溫磷光由于低溫磷光需要低溫實驗裝置，溶劑選擇的限制等因素，從而發(fā)展了多種室溫磷光法。固體基質(zhì)室溫磷光法 此法基于測量室溫下吸附于固體基質(zhì)上的有機化合物所發(fā)射的磷光。所用的載體種類較多，有纖維素載體（如濾紙、玻璃纖維）、無機載體（如硅膠、氧化鋁）以及有機載體（如乙酸鈉、聚合物、纖維素膜）等。理想的載體是既能將分析物質(zhì)牢固地束縛在表面或基質(zhì)中以增加其剛性，并能減小三重態(tài)的碰撞猝滅等非輻射去活化過程，而本身又不產(chǎn)生磷光背景。 膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法 當(dāng)溶液中表面活性劑的濃度達到臨界膠束濃度后，便相互聚集形成膠束。由于這種

13、膠束的多相性，改變了磷光團的微環(huán)境和定向的約束力，從而強烈影響了磷光團的物理性質(zhì)，減小了內(nèi)轉(zhuǎn)化和碰撞能量損失等非輻射去活化過程的趨勢，明顯增加了三重態(tài)的穩(wěn)定性，從而可以實現(xiàn)在溶液中測量室溫磷光。利用膠束穩(wěn)定的因素，結(jié)合重原子效應(yīng)，并對溶液除氧，是該法的三個要素。三、磷光分析儀 磷光分析儀與熒光分析儀相似，在熒光分光光度計上配上磷光配件后，即可用于磷光測定。（1）樣品池如將樣品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，即可用于低溫磷光測定。（2）可轉(zhuǎn)動的斬波片或圓柱形筒在激發(fā)光單色器和樣品池之間，樣品池和發(fā)射光單色器之間，各裝一個斬波片，并由一個同步電動機帶動，這兩個斬波片可調(diào)節(jié)為同相或異相，同相時，磷光和熒

14、光一起進入發(fā)射光單色器，測得的是兩者總光強；當(dāng)斬波器調(diào)節(jié)為異相時，激發(fā)光被遮斷，此時，熒光的壽命短，立即消失，磷光壽命長，所測到的僅為磷光。具有時間分辨功能。 三、磷光分析儀可轉(zhuǎn)動的圓柱形筒可轉(zhuǎn)動的斬波片四、應(yīng)用 磷光強度與濃度的關(guān)系Ip =2.303 p I0 bc p磷光量子效率Ip也只有在低濃度時，才與濃度c成線性關(guān)系，但磷光的濃度線性范圍要比熒光大。 磷光分析主要用于測定有機化合物，如石油產(chǎn)品、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥、藥物等方面。第五節(jié) 化學(xué)發(fā)光與生物發(fā)光分析 某些物質(zhì)在進行化學(xué)反應(yīng)時，由于吸收了反應(yīng)時產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便發(fā)出一定波長的光。

15、這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程稱為化學(xué)發(fā)光。利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而建立起來的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法?；瘜W(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系，這種發(fā)光稱為生物發(fā)光。如螢火蟲、某些細(xì)菌、真菌、原生動物、蠕蟲以及甲殼動物等所發(fā)射的光。 一、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理 化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。任何一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個步驟，必須滿足如下條件： 化學(xué)發(fā)光必須滿足如下條件： （1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來源于反應(yīng)焓。（大多數(shù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)為氧化還原反應(yīng)）（2）要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。（3）

16、發(fā)光效率高。激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。 化學(xué)發(fā)光效率cl化學(xué)發(fā)光效率cl ，又稱化學(xué)發(fā)光的總量子產(chǎn)率。它決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)效率r和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率f。定義為：cl =發(fā)射光子的分子數(shù) / 參加反應(yīng)的分子數(shù) = r f 二、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型 1.直接化學(xué)發(fā)光 直接發(fā)光是被測物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。A + B C* + DC* C + h式中A或B是被測物，通過反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ，當(dāng)C* 躍遷回基態(tài)時，輻射光子。 2.間接化學(xué)發(fā)光 間接發(fā)光是被測物

17、A或B，通過化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ， C* 不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。 A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h 式中C*為能量給予體，而F為能量接受體。 2.間接化學(xué)發(fā)光例如，臭氧的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)沒食子酸+O3 A*（受激中間體）+O2羅丹明B+A* 羅丹明B*+ B（最終氧化產(chǎn)物）羅丹明B* 羅丹明B+h（584nm）測定大氣中微量臭氧。 3.液相化學(xué)發(fā)光 按反應(yīng)體系的狀態(tài)分類，可分為液相化學(xué)發(fā)光、氣相化學(xué)發(fā)光等。 液相化學(xué)發(fā)光在痕量分析十分重要 用于此類化學(xué)發(fā)光分析的發(fā)光物質(zhì)有魯米諾、光澤精、洛粉堿等。 例如，利用發(fā)光物

18、質(zhì)魯米諾，可測定痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金屬離子。 3.液相化學(xué)發(fā)光例如，在生化分析中，氨基酸+O2 氨基酸氧化酶 酮酸+NH3+H2O2H2O2+魯米諾 A*A* 產(chǎn)物+h max=425nm（魯米諾3-氨基苯二甲酸肼）用于測定氨基酸含量。pH 9-113.液相化學(xué)發(fā)光魯米諾與H2O2的化學(xué)反應(yīng)。可檢測低至10-9mol/L的H2O2，此反應(yīng)可被一些痕量金屬（過渡金屬）催化，使發(fā)光大大增強，另一方面，又可被Ce4+、Hf4+等抑制，使發(fā)光大大減弱，這樣就可測定很多金屬離子，檢測限可低至0.01g/g。4.氣相化學(xué)發(fā)光 主要有O3、NO、S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測空氣中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。臭氧與乙烯的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；一氧化氮與臭氧的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。 三、生物發(fā)光分析法 生物發(fā)光分析中，通常涉及到酶促反應(yīng)和發(fā)光反應(yīng)，這類發(fā)光分析不僅靈敏度高，選擇性也很高。例如，三磷酸腺苷（ATP）的測定，就是生物發(fā)光分析的成功實例。細(xì)菌發(fā)光也可用于發(fā)光分析。 三、生物發(fā)光分析法 生物化學(xué)發(fā)光分析法在免疫