最新植物生理指標(biāo)測(cè)定方法

1、實(shí)驗(yàn)一植物葉綠素含量的測(cè)定（分光光度法）（張憲政，1992）一、原理根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光 度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯一比爾定律，某有色溶液的吸光度 A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即A=aCL式中：a比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百 分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng) 下的吸光系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù) 種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和。 這就是吸光度的加和性。今欲測(cè)定葉綠體色素

2、混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量， 只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長(zhǎng) 下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色 光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a和b，兩 者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。葉綠素a和葉綠素b的比值反映植物對(duì)光能利用效率 的大小，比值高則大，則反之。二、材料、儀器設(shè)備及試劑試劑：1） 95%乙醇（或80%丙酮）三、實(shí)驗(yàn)步驟稱取剪碎的新鮮樣品0.20.3g，加乙醇10ml，提取直至無(wú)綠色為止。把葉綠體色素提取 液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，以9

3、5%乙醇為空白，在波長(zhǎng)663nm和645nm下測(cè)定吸光度。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果按計(jì)算丙酮法（Arnon法）【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的計(jì)算】葉綠素 a 的含量（mg/g） = （12.71xOD663 - 2.59xOD645） V/1000*W葉綠素 b 的含量（mg/g） =（22.88OD645 - 4.67OD663） V/1000*W葉綠素 a、b 的總含量（mg/g） =（8.04xOD663 +20.29xOD645） V/1000*W按Inskeep公式葉綠素 a 的含量(mg/g) = (12.63xOD663 - 2.52xOD645) V/1000*W 葉綠素 b

4、 的含量(mg/g) =(20.47OD645 - 4.73OD663) V/1000*W葉綠素 a、b 的總含量(mg/g) =(7.90 xOD663 + 17.95xOD645) V/1000*W 注：1、葉綠素a和葉綠素b的比值反映植物對(duì)光能利用率【1】比如陽(yáng)生植物葉綠素a和葉綠素b的比值較大【2】陰生植物葉綠素a和葉綠素b的比值較小2、丙酮熔點(diǎn):-94C ；沸點(diǎn):56.48C ；是一種無(wú)色透明液體，有特殊的辛辣氣味易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、毗啶等有機(jī)溶劑.下一步實(shí)驗(yàn)方法比較【1】95%乙醇直接提?。?）【2】95%乙醇加熱提取（馮瑞云，1985）【3】無(wú)水酒精和80%丙酮等體

5、積混合提取實(shí)驗(yàn)二、不良環(huán)境對(duì)植物細(xì)胞膜的傷害（張憲政，1992）原理植物組織在受到各種不利的環(huán)境條件（如干旱、低溫、高溫、鹽漬和大氣污染）危害時(shí)， 細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能首先受到傷害，細(xì)胞膜透性增大。若將受傷害的組織浸入無(wú)離子水中， 其外滲液中電解質(zhì)的含量比正常組織外滲液中含量增加，組織受傷害越嚴(yán)重，電解質(zhì)含量增 加越多。用電導(dǎo)儀測(cè)定外滲液電導(dǎo)率的變化，可反映出質(zhì)膜受傷害的程度。在電解質(zhì)外滲透 的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)可溶性有機(jī)物也隨之滲出，引起外滲液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增 加，氨基酸和核苷酸對(duì)紫外光有吸收，對(duì)紫外分光光度計(jì)測(cè)定受傷害組織外滲液消光值，同 樣可反映出質(zhì)膜受傷害的程度。用電導(dǎo)儀法和紫

6、外法測(cè)定結(jié)果有很好的一致性。二、方法步驟1、取樣及處理采用電導(dǎo)法（張憲政，1992）：將選取的幼嫩葉片和成熟葉片剪下，包在密封袋內(nèi)置于冰盒 中帶回實(shí)驗(yàn)室。將新鮮的葉樣先用自來(lái)水輕輕沖洗葉片，除去表面沾污物，再用去離子水沖 洗12次，用濾紙輕輕吸干葉片表面水分，稱0.20.3 g并剪成切段，放入50 mL帶塞試管 中，加入20 mL去離子H2O,浸沒(méi)樣品45 h，各處理浸泡時(shí)間和測(cè)定溫度一致，在室溫下 進(jìn)行，用DDs11型電導(dǎo)儀測(cè)其電導(dǎo)率，然后沸水浴15 min，冷卻至室溫再測(cè)一次總電導(dǎo)率 值。以相對(duì)電導(dǎo)率表示細(xì)胞質(zhì)膜透性大小。2、計(jì)算：植物組織浸泡的電導(dǎo)率，特稱外滲電導(dǎo)率，此測(cè)定方法稱外滲電導(dǎo)

7、率法。（1）外滲電導(dǎo)率K （us/cm*g） =SQ=測(cè)定電導(dǎo)率/稱取質(zhì)量或 K （us/cm*g*ml） =SQ=測(cè)定電導(dǎo)率/稱取質(zhì)量*量取體積（2）相對(duì)電解質(zhì)滲出率.電解質(zhì)滲出率（%） = L1 （浸泡液電導(dǎo)率）/ L2 （煮沸后電導(dǎo)率）X100 電解質(zhì)滲出率（%）= L1（浸泡液電導(dǎo)率）-本底電導(dǎo)率/ L2 （煮沸后電導(dǎo)率）-本底電導(dǎo)率X100 式中：L1：組織殺死前外滲液的電導(dǎo)值；L2組織殺死后外滲液的電導(dǎo)值。注：1、事先測(cè)定水的電導(dǎo)率2、用吸水紙吸干探頭的水分實(shí)驗(yàn)三 植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定一、目的在逆境條件下（旱、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加，植物體內(nèi)脯氨酸含 量

8、在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種積累的脯氨酸多。因此測(cè)定脯氨酸含 量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織 內(nèi)的代謝過(guò)程，因而能降低冰點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨 酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。二、原理磺基水楊酸對(duì)脯氨酸有特定反應(yīng)，當(dāng)用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺 基水楊酸溶液中。然后用酸性茚三酮加熱處理后，茚三酮與脯氨酸反應(yīng)，生成穩(wěn)定的紅色化 合物，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在 520nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上

9、查出脯氨酸的含量。三、材料、儀器及試劑試劑及配制：（1）2.5%酸性茚三酮溶液配制：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol - L-1 磷酸中（原液稀釋2.3倍），攪拌加熱（70C ）溶解，貯于4C冰箱中，2-3日有效。（2）3%磺基水楊酸配配制：3.496g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。（3）10p g - ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液配制：精確稱取20mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少 量蒸餾水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度（為100. g - ml-1脯氨酸母 液），再吸取該溶液10ml，加蒸餾水稀釋定容至100ml，即為10. gml-1脯氨酸標(biāo)

10、準(zhǔn)液。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1.1取6支試管，編號(hào)，按下表配制每管含量為012. g的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。加入表中試 劑后，置于沸水浴中加熱30min。取出冷卻。以去離子水溶液為空白對(duì)照，在520mm波長(zhǎng)處 測(cè)定吸光度（A）值。試劑管號(hào)01234510gdl脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.60.81.0蒸餾水（ml）21.81.61.41.21.0冰醋酸（ml）2222223%磺基水楊酸2222222.5%酸性茚三酮（ml）444444每管脯氨酸含量（.g）02468101.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以15號(hào)管脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定2.1脯氨酸的提取

11、稱取0.20.3g葉片于20ml試管+ 10ml 3%磺基水楊酸溶液一沸水浴10min （提取過(guò) 程中要經(jīng)常搖動(dòng)）一冷卻過(guò)濾于干凈的試管中一脯氨酸提取液。2.2測(cè)定吸取酶提取液2ml + 2ml H2O + 2ml冰醋酸+ 4ml 2.5%酸性茚三酮一沸水浴30min一溶 液呈紅色一冷卻一取上層液于比色杯520mm處測(cè)定吸光度（A）值。五、計(jì)算結(jié)果從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測(cè)定液中脯氨酸的含量，按下公式計(jì)算樣品中脯氨酸含量：XX提取液總量（ml）脯氨酸含量（pgg-1Fw） =樣品鮮重（g）X測(cè)定時(shí)提取液用量（ml）公式中：X 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量（pg）實(shí)驗(yàn)四 植物體內(nèi)丙二醛含量的測(cè)定一、

12、原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧 化反應(yīng)而產(chǎn)生的。它的含量與植物衰老及逆境傷害有密切關(guān)系。測(cè)定植物體內(nèi)丙二醛含量， 通常利用硫代巴比妥酸（TBA ）在酸性條件下加熱與組織中的丙二醛產(chǎn)生顯色反應(yīng)，生成紅棕色 的三甲川（3、5、5三甲基惡唑2、4二酮），三甲川最大的吸收波長(zhǎng)在532nm。但是測(cè)定 植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與硫代巴比妥酸顯色反 應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在450nm處，在532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆 境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中丙二醛與硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物含量時(shí)一定要

13、 排除可溶性糖的干擾。此外在532nm波長(zhǎng)處尚有非特異的背景吸收的影響也要加以排除。低 濃度的鐵離子能顯著增加硫代巴比妥酸與蔗糖或丙二醛顯色反應(yīng)物在532、450nm處的吸光度 值，所以在蔗糖、丙二醛與硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)中需要有一定的鐵離子，通常植物組織中 鐵離子的含量為100 300. gg1Dw，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3 +的終濃 度為0.5nmol L1。在532nm、600nm和450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，即可計(jì)算出丙二醛 含量。二、實(shí)驗(yàn)步驟提取采用硫代巴比妥酸顯色法(趙世杰等，2002)。稱取0.20.3 g樣品，口 10%三氯乙酸2mL 和少量石英砂，研磨至勻漿

14、，再加8ml三氯乙酸進(jìn)一步研磨，勻漿后4000 rpm，離心10min。顯色取上清液5 mL，叫.6% TBA 5 mL，混合后在100C水浴上煮沸30 min，迅速在冰浴上冷 卻后再離心一次。分別測(cè)定上清液在450nm、532 nm和600 nm處的吸光度值，方法一：MDA 質(zhì)量摩爾濃度(nmol/g)= ( A532-A600)xVZxV1/(0.155xWxV2)式中：VZ:反應(yīng)液總量(4 mL)；V1:提取液體積(10 mL)；V2:測(cè)定用用提取液量(2 mL)；W:取樣葉鮮重(g)0.155:為MDA的消光系數(shù)(nmol/l)方法二：方程組：A450= (85.4X10 3) C 糖

15、(A532A600) = (155X10 3) CMDA+ (7.4X103) C 糖解得：A450C 糖=11.71A450 (mmol L1)85.4X103Cmda= 6.45 (A532A600)0.56A450 (M molLD公式中：A450在450nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值A(chǔ)532在532nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值A(chǔ)600在600nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值* 1.55X105為摩爾比吸收系數(shù)C糖、CMDA分別是反應(yīng)混合液中可溶性糖、MDA的濃度。按下式計(jì)算提取液中MDA濃度反應(yīng)液體積(ml)CMDA X1000提取液中MDA濃度(.mol ml1)=測(cè)定時(shí)提取液用量(ml)2.按下式計(jì)

16、算樣品中MDA含量提取液中MDA濃度（|J mol-ml-1）X提取液總量（ml）MDA 含量（p mol g1 Fw）=植物組織鮮重（g）試劑：1、10%三氯乙酸：稱取三氯乙酸55.5556g加水溶解定容至500ml2、0.6%硫代巴比妥酸（用10%三氯乙酸配制）：稱0.6707g TBA用少量1mol/L氫氧化 鈉溶解后加10%TCA溶解定容至100ml （4C貯存）實(shí)驗(yàn)五、SOD活力測(cè)定（NBT還原法）植物葉片在衰老過(guò)程中發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降 解、光合作用降低及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等。這些指標(biāo)在一定程度上反映衰老過(guò)程的變化。近 來(lái)大量研究表明，植物在逆境脅

17、迫或衰老過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自 由基的產(chǎn)生。過(guò)剩自由基的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷， 嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。自由基是具有未配對(duì)價(jià)電子的原子或原子團(tuán)。生物體內(nèi)產(chǎn)生的 自由基主要有超氧自由基（O2）、羥自由基（OH.）、過(guò)氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO） 等。植物細(xì)胞膜有酶促和非酶促兩類過(guò)氧化物防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫 酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系統(tǒng)的重要 保護(hù)酶。抗壞血酸（VC）、VE和還原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化 劑。SOD、C

18、AT等活性氧清除劑的含量水平和O2 、H2O2、OH.和O2等活性氧的含量水平可 作為植物衰老的生理生化指標(biāo)。超氧自由基（O2.）是生物細(xì)胞某些生理生化反應(yīng)常見(jiàn)的中間產(chǎn)物。自由基是本身帶 有不成對(duì)價(jià)電子的分子、原子、原子團(tuán)或離子，化學(xué)性質(zhì)非常活潑，是活性氧的一種。如果 細(xì)胞中缺乏清除自由基的酶時(shí)，機(jī)體就會(huì)受到各種損傷。超氧化物歧化酶（ Superoxide Dismutase），簡(jiǎn)稱SOD，能通過(guò)歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基（O2.），生成H2O2 和O2。H2O2由過(guò)氧化氫酶（CAT）催化生成H2O和O2，從而減少自由基對(duì)有機(jī)體的毒害。一、原理超氧物歧化酶（superoxidedism

19、utase， SOD）普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)，是一種清除超 氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT ）在光下的還原作用來(lái)確 定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極 易再氧化而產(chǎn)生O2-，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD 可清除O2-，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈 低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。二、試劑（一）試劑（1） 0.2 mol/L pH7.8 磷酸鈉（Na2HPO4-NaH2PO4 ）緩沖液：A 液（0.2 mol/L NaH2PO

20、4 溶液）：準(zhǔn)確稱取 NaH2PO42H2O （MW=156.01） 15.715g 于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入500mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分 混勻。4C冰箱中保存?zhèn)溆?。B 液（0.2 mol/L Na2HPO4 溶液）：準(zhǔn)確稱取 Na2HPO412H2O（MW=358.14） 71.63g 于 100mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混 勻。4C冰箱中保存?zhèn)溆?。取上述A液34mL與B液366mL充分混勻后即為0.2mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液。4C 冰箱中保存?zhèn)溆谩?.05 mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖

21、液取0.2 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液250mL，移入1000 mL容量瓶中用蒸餾水定容至 刻度，充分混勻。4C冰箱中保存?zhèn)溆谩?30mmol/L蛋氨酸(Met)磷酸鈉緩沖液準(zhǔn)確稱取L-蛋氨酸(C5H11NO2S, MW=149.21) 0.9699g于小燒杯中，用少量0.05 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解后，移入50mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液 定容至刻度，充分混勻(現(xiàn)用現(xiàn)配)?！救苡谒?.3g/100ml 25C，不溶于有機(jī)溶劑】4C保 存可用12d.750p mol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.03066g NBT用磷酸緩沖液定容至5

22、0ml，避光4C保 存，先用現(xiàn)配.100p mol/L EDTA-Na2 溶液：稱取 0.03721g EDTA-Na2 用水定容至 1000ml【稱取 7.442 g EDTA-Na2用水定容至200ml，吸取1ml用水定容1000ml】20p mol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存【稱取 1.8825g核黃素用少量NaOH溶解并用蒸餾水定容至25ml，吸取1ml用水定容1000ml】。4C 保存8-10天。三、實(shí)驗(yàn)步驟酶液提取取植物葉片0.2g0.3g于預(yù)冷的研缽中，加2ml預(yù)冷的0.05 mol/L pH7.8磷酸緩沖液 在冰浴上研磨成漿，加緩沖

23、液使終體積為10ml。于4000rpm下離心15min，上清液即為SOD 粗提液。2.顯色反應(yīng)取試管3支，1支為測(cè)定管，另2支為對(duì)照管，按下列加入一依次加入各溶液:名稱樣品管對(duì)照管1對(duì)照管250mmol/L磷酸緩沖液(ml)5.05.05.0130mmol/L Met 溶液（ml）0.30.30.3750. mol/L NBT 溶液（ml）0.30.30.3100. mol/L EDTA-Na2 液（ml）1.01.01.0去離子水(ml)2.02.02.020p mol/L 核黃素（ml）0.30.30.30.3 (酶液)0.3 (緩沖液)0.3 (緩沖液)混勻后將1支對(duì)照管置暗處，其它各管

24、于4000Lx日光下反應(yīng)20min，然后立即遮光，以 遮光管為對(duì)照調(diào)零，于560nm下測(cè)定光密度。(要求各管受光情況一致，溫度高時(shí)間縮短，低 時(shí)延長(zhǎng))。3.SOD活性測(cè)定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對(duì)照管做空白，分別測(cè)定其它各管的吸光度。四、結(jié)果計(jì)算已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活 性。SOD 總活性=(Ack-AE)XV/(AckX0.5XWXVt)= (Ack-AE)/(AckX0. 015XW)SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量上式中：SOD總活性以每克鮮重酶單位表示;表示SOD比活力：?jiǎn)挝灰悦竼挝? mg蛋白Ack：照光對(duì)照管

25、的吸光度AE：樣品管的吸光度V：樣品液總體積（ml）Vt測(cè)定時(shí)樣品用量（ml）實(shí)驗(yàn)六、過(guò)氧化物酶活性測(cè)定一、試驗(yàn)?zāi)康模哼^(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的活性較高的一種酶，他與呼吸作用、光合作用以及生 長(zhǎng)素的氧化等都有密切關(guān)系。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中他的活性不斷發(fā)生變化，因此測(cè)量這種 酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝的變化。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)了解過(guò)氧化物酶的作用，掌握常用 的測(cè)定過(guò)氧化物酶的方法一一愈創(chuàng)木酚法。二、實(shí)驗(yàn)原理：在過(guò)氧化物酶催化下，雙氧水將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物，此產(chǎn)物在X470 nm處有最 大吸收峰，故可以通過(guò)測(cè)其吸光度的變化測(cè)定過(guò)氧化物酶的活性。三、實(shí)驗(yàn)試劑1、0.05 mol/L PH 7

26、.0的磷酸緩沖液：0.2M A 液（Na2HPO4）61ml 和 0.2M B 液（NaH2PO4）39ml 混合 100ml，用去離子 水定容400ml2、0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液：取0.6207g定容100ml1%愈創(chuàng)木酚溶液：吸取1毫升愈創(chuàng)木酚，加入少量95%酒精溶解，用水定容100ml， 放于棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆?、2%雙氧水溶液:：取30% H2O2 10ml用去離子水定容150ml4、反應(yīng)混合液取50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）30mL，2%過(guò)氧化氫10mL，1%愈創(chuàng)木酚10mL混合。四、操作步驟酶液提?。呵逑锤蓛羧~片擦干，稱取0.20.3 g葉片，剪成小片，放入研

27、缽加入適 量10%PVPP （除去酚類物質(zhì)）、石英沙、及2ml 50mmol的PH 7.0（5.5-7.5）的磷酸緩沖液PBS （0.02-0.1mmol ）進(jìn)行研磨，磨碎后在加入8mlPBS溶液洗滌研缽一并裝入離心管內(nèi)，4C下 4000rmin-1離心15min，收集上清液4C保存?zhèn)溆?。顯色反應(yīng)類別對(duì)照管樣品管反應(yīng)液3.0 mL溫度25C緩沖液0.5 mL酶液0.5 mL測(cè)定波長(zhǎng)470nm五、計(jì)算過(guò)氧化物酶活性（左OD470/（min.g） = （AA470XVT） / （WXVSX001Xt）式中：人彳?。為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，W為葉片鮮重g，t為反應(yīng)時(shí)間min，Vt為提取 酶液總體積

28、ml，Vs為測(cè)定時(shí)取用的酶液體積ml。實(shí)驗(yàn)19植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定I考馬斯亮藍(lán)G -50染色法一、原理考馬斯亮藍(lán)G - 250 （ Coomassie brilliant blue , G-250 ）法是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié) 合的原理，定量地測(cè)定微量蛋白質(zhì)濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過(guò)范德瓦爾 鍵結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合 后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式，最大光吸收由465 nm變成595 nm，通過(guò)測(cè)定595 nm 處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和染

29、料結(jié)合是一個(gè)很快的過(guò)程，約2 min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可 穩(wěn)定1h，之后，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來(lái)。此法靈敏度高（比Lowry法靈 敏4倍），易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的定量法。其缺點(diǎn)是在蛋白質(zhì)含量很高時(shí) 線性偏低，且不同來(lái)源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備（一）試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（100瞄/mL牛血清白蛋白）：稱取牛血清蛋白25 mg，加水溶解 并定容至100 mL，吸取上述溶液40 mL，用蒸餾水稀釋至100 mL即可?？捡R斯亮藍(lán)試劑：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 90 %乙醇中， 加入100 mL 85

30、%（ W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1000 mL，貯于棕色瓶中。常溫下 可保存一個(gè)月。三、實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支試管，按表26-1加入試劑，搖勻，向各管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻， 并放置5 min左右，以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595 nm下比色測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)含 量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（mL ）00.200.400.600.801.00蒸餾水量（mL ）1.000.800.600.400.200蛋白質(zhì)含量（瞄）020406080100樣品測(cè)定（1 ）樣品提取稱取鮮樣0.250.5 g，用5 mL蒸餡水或緩沖液研磨成勻漿后

31、， 3000 r/min離心10 min，上清液備用。（2 ）吸取樣品提取液0.3 mL （視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋），放入試管中（每個(gè)樣品重 復(fù)2次），加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，放置2 min后在595 nm下比色，測(cè)定吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。四、結(jié)果計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量=xlOOO（mg/g）式中：C查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，曜。T提取液總體積，mL。WF樣品鮮重,g。S測(cè)定時(shí)加樣量,mL。注意點(diǎn)：1，考馬斯亮藍(lán)G-250所配溶液不穩(wěn)定，所以每次實(shí)驗(yàn)都必須新配，且必須新做標(biāo)準(zhǔn)曲線;考馬斯亮藍(lán)G-250配制完畢，如果發(fā)現(xiàn)溶液中有絮狀沉淀，可以試用濾紙過(guò)濾后使用， 如果實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用過(guò)

32、濾后的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液在與樣品接觸后短時(shí)間內(nèi)便又發(fā)生絮 凝，基本上推測(cè)該考馬斯亮藍(lán)G-250過(guò)期（比較容易出現(xiàn)）。實(shí)驗(yàn)七、過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定一一高錳酸鉀滴定法【原理】過(guò)氧化氫酶（CAT ）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧， 在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。據(jù)此，可根據(jù)h2o2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定 量（反應(yīng)過(guò)量）的h2o2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多 余的h2o25HO+2KMnO+4HSO _ 5O +2KHSO +8H O+2MnSO2 2424 2424即可

33、求出消耗的H2O2的量?！驹噭俊?】3M H2SO4:吸取濃硫酸80ml用去離子水定容至500ml【2】0.2mol/L磷酸緩沖液pH7.0；【3】0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱取KMnO4 （AR） 16 g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成 1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；0.1mol/L H2O2:市售 30% H2O2 大約等于 17.6mol/L，取 30% H2O2 溶液 4.87ml，稀釋至 500ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；【實(shí)驗(yàn)步驟】1、酶液提取 取葉片0.20.3g加入2ml pH7.0的磷酸緩沖液少量研磨成勻漿，在加緩

34、沖液定容轉(zhuǎn)移至10ml后轉(zhuǎn)入離心管中，4000rpm離心15min，上清液即為過(guò)氧化氫酶的粗提 液。2.滴定反應(yīng)管號(hào)對(duì)照管樣品管粗酶液（ml）0.20.23mol/L H2SO4 (ml)50PH 7.0磷酸緩沖液1.81.80.1mol/L H2O2 (ml)55條件加入H2O2立即計(jì)時(shí)于35C恒溫水浴中保溫3min3mol/L H2SO4 (ml)05用01mol/L KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在？0min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)所用KMnO4體積（ml）|AB【結(jié)果計(jì)算】：酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示:（A - B） x VT x 1.7酶活（岫2。

35、/即. min）= gw x V X t一式中A一對(duì)照KMnO4滴定毫升數(shù)；B一酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)；VT一酶液總量（ml）；V1反應(yīng)所用酶液量（ml）;W一樣品鮮重（g） ；1.71ml 0.1mol/L 的 KMnO4 相當(dāng)于 1.7mg H2O2。過(guò)氧化氫酶的活性測(cè)定一一紫外吸收法一、原理H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度（A240 隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活性。二、實(shí)驗(yàn)步驟1、 酶液提取 取葉片0.20.3g加入2ml pH7.0的磷酸緩沖液少量研磨成勻漿，在加緩 沖液定容轉(zhuǎn)移至10ml后轉(zhuǎn)入離

36、心管中，4000rpm離心15min,上清液即為過(guò)氧化氫酶的粗提 液。4C下保存?zhèn)溆?。測(cè)定：取10ml試管3支，其中1號(hào)為樣品測(cè)定管，1號(hào)為空白管，按表40-2順序加入 試劑。表40-2紫外吸收法測(cè)定H2O2樣品液配置表管號(hào)樣品管對(duì)照管粗酶液（ml）0.2（煮死酶液）0.2pH7.0 磷酸(ml)1.51.5蒸餾水（ml）1.01.025C預(yù)熱后，逐管加入05ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min,待3支管全部測(cè)定完后， 按下式計(jì)算酶活性。結(jié)果計(jì)算：以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位(u)。過(guò)氧化氫酶活性(u/gFW/min) = 人240 X Vt式中 A240= AS0-以$1 ； A2)0.1 x V1 x t x FWAS0加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值；AS1 AS2一樣品管吸光值；Vt粗酶提取液總體積(ml)；V1測(cè)定用粗酶液體積(ml)；FW一樣品鮮重(g)；0.1一A240每下降0.1為1個(gè)酶活單位(u)；t一加過(guò)氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間(min)。高錳酸鉀滴定液的配制和標(biāo)定1 .高錳酸鉀滴定液(0.1mol / L )的配制市售高錳酸鉀常含有少量MnO2等雜質(zhì)，蒸餾水也常有微量的灰塵，溶液在配制初期不 夠穩(wěn)定，濃度常降低，因此