分子生物學(xué)技術(shù)(中國藥科大學(xué))(共12頁)

1、分子生物學(xué)技術(shù)(jsh)克隆(k ln)（clone）定義(dngy)：廣義上是指利用生物技術(shù)由無性生殖產(chǎn)生與原個體有完全相同基因組的后代的過程。在生物學(xué)上，是指選擇性地復(fù)制出一段DNA序列（分子克?。⒓?xì)胞（細(xì)胞克?。┗蚴莻€體（個體克?。??？寺〖夹g(shù)又稱為“生物放大技術(shù)”。限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）：識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶(簡稱限制酶)

2、。命名方式：主要依據(jù)來源來定，一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株(品系)，最后的序號用羅馬字符表示第幾個發(fā)現(xiàn)的。如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。限制與修飾系統(tǒng)（Restriction-modification system，R-M system）限制作用實際就是限制酶降解外源DNA ，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保護(hù)。通過甲基化作用達(dá)到識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。所以，能產(chǎn)生防御病毒侵染的限制酶的細(xì)菌，其自身的基因組中可能有該酶識別的序列，只是該

3、識別序列或酶切位點被甲基化了。但并不是說一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多數(shù)限制酶對DNA甲基化敏感，因此當(dāng)限制酶目標(biāo)序列與甲基化位點重疊時，對酶切的影響有3種可能，即不影響、部分影響、完全阻止。對甲基化DNA的切割能力是限制酶內(nèi)在和不可預(yù)測(yc)的特性，因此，為有效的切割DNA，必須同時考慮DNA甲基化和限制酶對該類型甲基化的敏感性。限制性內(nèi)切酶特異性識別(shbi)位點限制酶識別的序列(xli)大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)（palindromes），切割位點在 DNA 兩條鏈相對稱的位置；識別序列的長度一般為 4-8 個堿基，最常見的為 6 個堿基。不同的限制酶切割DNA位點的效率（fre

4、quency）不一樣。切割DNA 的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端或粘性末端。？同裂酶（isoschizomers）：識別位點相同，切割位點不一樣。同尾酶（isocaudarner）：即能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶載體（vector ）：在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。（目的基因無復(fù)制原點，不能自我復(fù)制）特點：自我復(fù)制、運載工具、多克隆位點、標(biāo)記基因、安全性等。三種最常用的載體是細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。質(zhì)粒載體pBR322抗生素抗性基因：氨芐西林抗性和四環(huán)素抗性DNA復(fù)制(fzh)起點：ori限制性酶切位點：EcoR1，Pst1，B

5、amH1克隆(k ln)過程：pBR322質(zhì)粒和目的(md)基因使用Pst1對質(zhì)粒和目的基因酶切產(chǎn)生粘性末端（sticky ends）DNA連接酶連接成環(huán)狀基因?qū)爰?xì)菌四環(huán)素抗性氨芐西林敏感篩選（外源DNA破壞了氨芐西林抗性基因）影印接種法(replica plating)具體過程是：將待測的濃縮菌懸液涂在合適的平板上，等其長好后作為母平板（每平板上的菌落控制在50300個）；用一小塊滅菌的絲絨固定在直徑較平板略小的圓柱形木塊上，構(gòu)成印章（即接種工具）；然后把長有菌落的母平板倒置在絲絨的印章上，輕輕印一下；再把此印章在另一含有選擇培養(yǎng)基的平板上輕輕印一下，經(jīng)培養(yǎng)后，選擇培養(yǎng)基平板上長出的菌落與

6、母平板上的菌落位置對應(yīng)，比較影印平板與母平板上菌落生長情況，即可從相應(yīng)位置的母平板上選出待測的突變型菌落。影印法最初是為證明微生物的抗藥性突變是自發(fā)的、與相應(yīng)的環(huán)境因素?zé)o關(guān)而設(shè)計的實驗，目前已廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)缺陷型的篩選以及抗藥性菌株篩選等研究工作中。改進(jìn)質(zhì)粒PUC系列18/19，無四環(huán)素抗性基因，含有l(wèi)ac Z基因 LacZ基因（-半乳糖苷酶基因）包括：一段-半乳糖苷酶的啟動子；編碼肽鏈的區(qū)段；一個多克隆位點(MCS)。廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控研究中的一種基因，LacZ基因編碼的beta一半乳糖普酶（簡稱beta-gal)是由4個亞基組成的四聚休，可催化乳糖的水解。Beta-gal比較穩(wěn)定，用X-

7、Gal為底物進(jìn)行染色時，呈藍(lán)色，便于檢測和觀察。LacZ基因是基因工程實驗中的一個常用標(biāo)記基因，比如常用于轉(zhuǎn)化菌株篩選，-半乳糖甘酶顯色反應(yīng)選擇法，即藍(lán)白篩選。例如，基因克隆中常用的質(zhì)粒載體PUC 19及噬菌體載體M13系列均帶有LacZ基因。藍(lán)白斑(bi bn)篩選藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據(jù)載體的遺傳(ychun)特征篩選重組子，如-互補(bǔ)(h b)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到-

8、半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。有色物質(zhì)可以使整個培養(yǎng)菌落產(chǎn)生顏色變化。轉(zhuǎn)化（transformation）是將異源DNA分子導(dǎo)入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段。原理是細(xì)菌處于0， CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。進(jìn)入細(xì)胞的DNA通過復(fù)制、表達(dá)，實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)

9、胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化(zhunhu)方法：電擊(din j)法 ( electroporation)、基因(jyn)槍法(Biolistic-bombardment)等噬菌體載體主要有雙鏈?zhǔn)删w和單鏈絲狀噬菌體兩大類。雙鏈?zhǔn)删w為類噬菌體，單鏈絲狀噬菌體有M13、f1、fd噬菌體。用的噬菌體克隆載體主要有類噬菌體和M13噬菌體。與質(zhì)粒相比，感染細(xì)胞效率更高克隆基因片段更長基因克隆不是細(xì)胞的復(fù)制，而是形成噬菌斑M(jìn)13噬菌體載體特點：Lac Z基因、多克隆位點、單鏈DNA、可定點突變，感染大腸桿菌后變成雙鏈復(fù)制形式。類噬菌體載體：構(gòu)建噬菌體載體的基本原理是多余限制位點的刪除?？梢詺w納成兩種不同

10、的類型：一種是插入型載體（insertionvectors），只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點。另一種是替換型載體（rePlacementvectors），具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的人DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。（有最短片段要求=12kb，常用于構(gòu)建基因文庫）噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點、標(biāo)記基因的特殊類型的載體?？滤官|(zhì)粒：柯斯質(zhì)粒用于克隆大片段的DNA分子特別有效，其特點：（1）具有噬菌體的特性（無法按噬菌體的方式生活，更無法形成子代噬菌體顆粒）（2）具有質(zhì)粒載體的特性 （3）具有高容量的克隆能力（插入的外源片

11、段至少不能小于30 kb）（4） 具有與同源序列的質(zhì)粒重組的能力表達(dá)載體（Expression vectors）就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動子、RBS、終止子等），使目的基因能夠表達(dá)的載體。有很強(qiáng)的啟動子，核糖體結(jié)合位點靠近起始密碼子。誘導(dǎo)表達(dá)載體：原核系統(tǒng)真核蛋白表達(dá)異常，因為誘導(dǎo)性啟動子大量真核蛋白對原核生物有毒性干擾原核生物的正常生長無翻譯后修飾表達(dá)蛋白形成包涵體，失活需要誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)（如IPTG）溫度誘導(dǎo)型原核表達(dá)載體pBV220原理：PLPR啟動子是大腸桿菌l噬菌體中控制早期轉(zhuǎn)錄的啟動子，具有極強(qiáng)的起始RNA轉(zhuǎn)錄的功能，基因工程中常用它來構(gòu)建高效表達(dá)載體，它受

12、抑制物CI蛋白的負(fù)調(diào)控。在實際中CI蛋白被改造成溫度敏感型(CIts)，由DNA片段CIts857（857bp長）編碼。CIts在30時具有抑制啟動子的活性，在42時失活而失去抑制啟動子的活性，因此，改變工程菌的培養(yǎng)溫度即可控制目的基因的表達(dá)，這一點比用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)的系統(tǒng)要節(jié)省操作步驟和成本，在大規(guī)模基因表達(dá)中優(yōu)點尤其明顯。融合(rngh)表達(dá)：在目的基因附近連接標(biāo)簽序列(xli)tag（便于純化或檢驗），如連上六個組氨酸標(biāo)簽，用Ni親和層析柱純化得靶蛋白，用特異性酶切去組氨酸即可。 真核表達(dá)(biod)系統(tǒng) 正確折疊、已修飾、可溶性的蛋白。酵母細(xì)菌穿梭載體雙宿主復(fù)制均可酵母的啟動子和細(xì)菌的

13、復(fù)制起點在酵母中表達(dá)具有蛋白折疊和糖基化作用分泌至胞外（有信號肽）桿狀病毒載體（昆蟲表達(dá)系統(tǒng)）啟動子強(qiáng)基因組過大，用轉(zhuǎn)移載體易發(fā)生同源重組Ti表達(dá)載體（tumor inducing植物載體）PCR（Polymerase chain reaction）對溫度穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq聚合酶，具有5-3聚合酶活性外切酶活性）含有酶切位點的引物溫度循環(huán)變化，94變性解旋、55退火引物結(jié)合、72室溫延伸RT-PCR：是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA

14、病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組 DNA的污染?；パa(bǔ)DNA（Complementary DNA，cDNA）是一種利用逆轉(zhuǎn)錄酶，以RNA（通常是mRNA）為模板作成的復(fù)制品，經(jīng)常用來將真核生物的基因（以mRNA形式）復(fù)制到原核生物細(xì)胞中。若一個cDNA含有許多來自不同基因的mRNA，稱為cDNA基因庫（cDNA library）。重疊PCR(Overlap PCR)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸,將不同

15、來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來.此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組,而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理,可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。不對稱(duchn)PCR(asymmetric PCR) 是用不等量的一對引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生(chnshng)大量的單鏈DNA(SSDNA).這對引物分別稱為非限制引物（高濃度）與限制性引物（低濃度），其比例(bl)一般為501001。不對稱PCR主要為測序制備ss-DNA，尤為用c-DNA經(jīng)不對稱PCR進(jìn)行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。反向PCR是一種新型的基因擴(kuò)增方法，它能擴(kuò)增一段已知序列旁

16、側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。實時熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。如TaqMan熒光探針，每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光。分子分離技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳（核酸分子的分離）瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，小分子受到的阻力小。因此在凝膠電泳

17、中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小。核酸分子帶負(fù)電，由負(fù)極運動到正極，故大分子靠近負(fù)極，小分子靠近正極。對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.52%之間，低濃度的用來進(jìn)行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進(jìn)行小片段分析。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳（蛋白分子分離）聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，它有兩種形式，一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中以三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)

18、中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS會與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)二維聚丙烯凝膠電泳（蛋白分離，分辨率高）二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合了等電聚焦技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)等電點進(jìn)行分離）以及SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進(jìn)行分離）。通常第一維電泳是等電聚焦，在細(xì)管中（13 mm）中加入含有兩性電解質(zhì)、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行等電聚焦，變性的蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點的不同進(jìn)行分離。而后將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩沖液處理30 mi

19、n，使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合。將處理過的凝膠條放在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接。在第二維電泳過程中，結(jié)合SDS的蛋白質(zhì)從等電聚焦凝膠中進(jìn)入SDS聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據(jù)其分子量大小被分離。離子交換(l z jio hun)層析（Ion Exchange Chromatograph）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(lidng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換層析中，基質(zhì)(j zh)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂

20、；而帶有負(fù)電荷的稱之陽離子樹脂。凝膠過濾層析（Gel filtration chromatography）利用一定大小孔隙的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠作層析介質(zhì)（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等），根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小、形狀不同擴(kuò)散到凝膠孔隙內(nèi)的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。分子檢測技術(shù)放射自顯影(autoradiography)（定量或定性）利用放射性同位素所發(fā)射出來的帶電離子(或粒子)作用于感光材料的鹵化銀晶體，從而產(chǎn)生潛影，這種潛影可用顯影液顯示，成為可見的像，因此，它是利用鹵化銀乳膠顯像檢查和測量放射性的一種方法。放射自顯影的主要步驟包括：放射核素的標(biāo)記、

21、樣品制備、核子乳膠膜的制備、自顯影和顯影及定影等。感光成像（Phosphorimaging）（定量更精確）表面涂有感光材料的纖維片（滌綸或醋酸纖維），經(jīng)過照相機(jī)及其他光學(xué)曝光后在底片上形成潛影，在暗房經(jīng)過顯影液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)顯影（藥液的濃度、顯影的溫度、攪動的次數(shù)、顯影的時間等都有一定的要求）后，再進(jìn)行停顯（一般用乙酸），最后是定影、水洗、烘干液體閃爍計數(shù)(liquid scintillation counting)是使用液體閃爍體（閃爍液）接受射線并轉(zhuǎn)換成熒光光子的放射性計量方法。液體閃爍計數(shù)器主要測定發(fā)生核衰變的放射性核素，尤其對低能更為有效。非放射性示蹤（Non-radioactive tra

22、cers）靈敏度高、污染小，如酶標(biāo)探針。核酸雜交技術(shù)（Nucleic Acid Hybridization）定義：互補(bǔ)的核苷酸序列（DNA與DNA、DNA與RNA、RNA與RNA等）通過Watson-Crick堿基配對形成非共價鍵，從而形成穩(wěn)定的同源或異源雙鏈分子的過程，稱為核酸分子雜交技術(shù)，又稱核酸雜交。DNA印跡法（Southern Blots）Southern印跡法(Southern Blot)是將基因組 DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶解、瓊脂糖凝膠電泳分離，使DNA片段按分子量大小排列在瓊脂糖凝膠上。經(jīng)堿處理凝膠使DNA變性（使雙鏈DNA變成單鏈），通過具有一定鹽離子濃度溶液的虹吸作用，將凝膠

23、中變性的單鏈DNA片段原位地吸印到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，經(jīng)過干燥或紫外線照射處理。單鏈DNA片段的極性基團(tuán)與支持膜上的基團(tuán)結(jié)合而使DNA分子牢固地固定到轉(zhuǎn)移膜上，轉(zhuǎn)移后的單鏈DNA分子與32P或35S標(biāo)記的DNA探針按互補(bǔ)原理進(jìn)行雜交。經(jīng)放射自顯影對特定位置上顯現(xiàn)的特異DNA片段進(jìn)行分析。（酶切、電泳、變性、結(jié)合、雜交、顯影）DNA指紋(zhwn)(DNA fingerprint)指具有完全個體(gt)特異的DNA多態(tài)性，其個體識別能力(nngl)足以與手指指紋相媲美，可用來進(jìn)行個人識別及親子鑒定，同人體核DNA的酶切片段雜交，獲得了由多個位點上的等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖

24、紋極少有兩個人完全相同，故稱為DNA指紋。(類似于Southern Blots)DNA分型（DNA typing）通過分子基因分型比較鑒定生物個體的一種DNA分析技術(shù)。用以進(jìn)行比較的生物樣品的DNA通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切、電泳分離和同位素標(biāo)記的重復(fù)DNA雜交，可以提供對于每個個體特異的放射自顯影帶型。原位雜交（situ hybridization）以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異核酸分子的技術(shù)。這一技術(shù)不需要從組織細(xì)胞中提取核酸，對組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，并可保持組織與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整，反映特異核酸分子的定位。特別是配合使用能定位特異蛋白分子的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，就能

25、對生理或病理條件下從DNA到mRNA到蛋白質(zhì)這樣一個基因表達(dá)過程進(jìn)行定性和定位的分析，是基因表達(dá)研究強(qiáng)有力的手段。探針（常使用多聚核苷酸和抗體）多聚核苷酸探針：使用其它來源的同源基因，根據(jù)基因序列推測相應(yīng)蛋白。應(yīng)用：基因在染色體上的定位探針DNA偶臉上顯影劑DNP染色體基因變性解螺旋雜交探針DNP端連接上第一抗體一抗連接上另一帶有熒光基團(tuán)（FITC）的抗抗體PI染色RNA印記（Northern Blots）將經(jīng)過凝膠電泳分離的RNA轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)奈⒖啄?如硝酸纖維素膜、尼龍膜等)上的技術(shù)。膜上的RNA可再與標(biāo)記的特異核酸探針雜交以分析特異性RNA。RNA制備及樣品處理電泳印記（轉(zhuǎn)膜）與標(biāo)記的DN

26、A雜交定性檢測DNA測序（DNA sequencing）Sanger雙脫氧鏈終止法測序：根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機(jī)在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。需要：DNA聚合酶，單鏈DNA模板，帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP），ddNTP。自動測序法（Automated DNA sequencing）建立(jinl)在sanger法的基礎(chǔ)上ddNTP標(biāo)記有不同(b tn)的熒光分子（四色熒光

27、(ynggung)染料）PCR產(chǎn)物為相差1個堿基的3末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物綠色A，橘黃色G，紅色T，藍(lán)色CDNA測序的化學(xué)降解（切割）法（Maxam-Gilbert sequencing）(1)先將DNA的末端之一進(jìn)行標(biāo)記，通常為放射性同位素32P；(2)在多組互相獨立的化學(xué)反應(yīng)中分別進(jìn)行特定堿基的化學(xué)修飾；(3)在修飾堿基位置化學(xué)法斷開DNA鏈；(4)凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列優(yōu)點：所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成所產(chǎn)生的拷貝。限制性酶切圖譜（Restriction maping）將限制性酶切位點標(biāo)定在DNA

28、分子的相對位置，基本方法是用兩種以上的限制性內(nèi)切酶（如Pst1和HamH3）分別對目標(biāo)DNA進(jìn)行酶切，電泳檢測片段的大小。定點突變技術(shù)（Site-directed Mutagenesis）通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。（設(shè)計錯配引物）PCR-based site-directed mutagenesis：DNA變性變?yōu)閱捂溸B接突變引物（堿基錯配）PCR擴(kuò)增幾輪突變DNA的分離Dpnl水解甲基化的GATC位點，以除去野生型DNA轉(zhuǎn)錄圖譜（Mapping transcrip

29、ts）利用表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜被稱為轉(zhuǎn)錄圖譜。定量圖譜反映轉(zhuǎn)錄的速率。S1核酸酶圖譜：用于定位5和3端的mRNA的序列并定量分析RNA如內(nèi)含子?；具^程是含P32DNA探針標(biāo)記5端和目標(biāo)RNA雜交S1核酸酶降解單鏈DNA或RNA電泳分析片段長度。（如圖3端測序）引物延伸(ynshn)除了mRAN的兩端(lin dun)序列，還需獲得中間的堿基序列設(shè)計(shj)引物與mRNA雜交使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA完整序列變性處理反應(yīng)混合物引物、延伸DNA進(jìn)行電泳信號強(qiáng)度反映轉(zhuǎn)錄水平脫落轉(zhuǎn)錄（Run-off transcription）限制酶酶切后，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，由于啟動子

30、下游的序列比較短，這樣RNA聚合酶很快就從模板上跑下來了是一種非常經(jīng)典的檢測啟動子強(qiáng)度和轉(zhuǎn)錄起始位點的分子生物學(xué)實驗方法把要檢測的目的序列用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，一個位點在啟動子上游，一個在啟動子下游，這樣原先非常長的序列就變成了一小段序列。能與最短RNA片段雜交的是含有轉(zhuǎn)錄起點的DNA片段，能與最長RNA片段雜交的是含有轉(zhuǎn)錄終點的DNA，能與中長度RNA雜交的DNA片段位于轉(zhuǎn)錄起點和轉(zhuǎn)錄終點之間盒式轉(zhuǎn)錄（G-less cassette transcription）與脫落轉(zhuǎn)錄不同的是，不用酶切，在啟動子下游的延伸序列的盒式結(jié)構(gòu)缺少鳥嘌呤從而使轉(zhuǎn)錄終止，形成特定長度有的核苷酸片段，電泳檢測。轉(zhuǎn)錄

31、速率的測定：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的濃度取決于合成速率和降解速率，其測定方法有細(xì)胞核連綴轉(zhuǎn)錄分析和報告基因轉(zhuǎn)錄法。連綴轉(zhuǎn)錄（Nuclear run-on transcription）從細(xì)胞內(nèi)分離核子，并在胞外相關(guān)核素的標(biāo)記下繼續(xù)其轉(zhuǎn)錄過程。報告基因轉(zhuǎn)錄（Reporter gene transcription）：檢測啟動子活性的方法。報告基因 (reporter gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，

32、篩選得到轉(zhuǎn)化體。如編碼氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶（CAT）、半乳糖苷酶、熒光素酶等的基因。蛋白質(zhì)印記(yn j)法（western blot，Immunobloting）經(jīng)過(jnggu)PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。DNA-蛋白質(zhì)相互作用檢測(jin c)親和力分析（Filter binding）核酸帶負(fù)電，蛋白質(zhì)帶正點，硝化纖維帶負(fù)電單鏈DNA結(jié)合硝化纖維，而雙鏈不結(jié)合當(dāng)雙鏈DNA結(jié)合蛋白質(zhì)后，能與硝化纖維結(jié)