分子生物學(xué)技術(shù)在食源性微生物檢測中的應(yīng)用胡競進(jìn)(共8頁)

1、分子生物學(xué)技術(shù)(jsh)在食源性微生物檢測(jin c)中的應(yīng)用(浙江大學(xué)(zh jin d xu)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 胡競進(jìn) 11513021)摘要：食源性微生物污染是食品安全中最突出的問題之一,對人們的健康有著深遠(yuǎn)的影響。然而，傳統(tǒng)的食源性微生物檢測方法繁瑣復(fù)雜、周期較長, 因此以分子生物學(xué)技術(shù)為代表的快速、簡便、特異的檢測方法成為研究的熱點。本文介紹了以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基因探針檢測法、變形梯度凝膠電泳、基因芯片、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性等分子生物學(xué)技術(shù)在食源性微生物檢測中的應(yīng)用，為今后進(jìn)一步研究和開發(fā)新檢測技術(shù)提供一些參考。關(guān)鍵詞：食源性微生物；分子生物學(xué)技術(shù)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；基因探針

2、；變性梯度凝膠電泳；基因芯片；隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性Application of molecular biotechnology in foodborne microorganisms detectionCollege of Biosystems engineering and Food Science 11513021 JingJin HuAbstract: The pollution caused by foodborne microorganisms is one of the most dominant issue for food safety, which has deeply aff

3、ected the public health.However, traditional methods for detection of food borne pathogens are quite complex, and cost much time, so increasing number researches focus on the quick, convenient and differential methods such as molecular biotechnology. This article introduced several molecular biotech

4、nology which commonly used in detection of food microorganisms including polymerase chain reaction (PCR), gene probe , denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), gene chip , random amplified polymorphism DNA (RAPD), aiming to provide a reference for the further study.Key words: foodborne microo

5、rganisms; molecular biotechnology; PCR; gene probe ; DGGE; gene chip ; RAPD微生物污染是諸多食品安全問題中最突出的環(huán)節(jié)之一，一方面因為微生物個體小、生長快、分布廣、種類多，易于在食品生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售過程中造成污染；另一方面，微生物在污染食品后其菌體本身以及產(chǎn)生的毒素等代謝產(chǎn)物會對食品本身造成品質(zhì)的破壞使其失去使用價值造成經(jīng)濟(jì)損失，并會對誤食者造成健康上的損害甚至生命的威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,全世界每年發(fā)生食源性疾病數(shù)十億人,甚至在發(fā)達(dá)國家,也有三分之一的人群每年遭受食源性致病菌的侵襲。因此，食品微生物檢測對于

6、保障食品安全起著及其重要的作用。傳統(tǒng)的食源性微生物檢測和鑒定方法主要有分離培養(yǎng)鑒定法、生化鑒定、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)及自動酶聯(lián)熒光免疫檢測方法、電阻抗測量法、放射測量法、生物發(fā)光法、直接外熒光過濾技術(shù)、色法等物理和化學(xué)的方法。傳統(tǒng)的微生物檢測方法雖然有效，但存在速度慢、成本高、效率低等問題,例如，需要5一7天的培養(yǎng)鑒定時間,不能實現(xiàn)快速檢測；微生物的生化特征以及生化試劑的不穩(wěn)定,經(jīng)常鑒定的結(jié)果不準(zhǔn)確、重復(fù)性差。因此，傳統(tǒng)的檢測方法越來越難以滿足現(xiàn)代社會快速檢測的要求。隨著細(xì)菌基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，誕生了許多準(zhǔn)確度和靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便、檢測周期短、效率高的分子生物

7、學(xué)技術(shù)，它們越來越廣泛地應(yīng)用于食源性微生物的檢測。本文對在食品病原微生物檢測中常用的幾種分子生物學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用。1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lin sh fn yng)（ polymerase chain reaction，PCR）美國(mi u)人 Mullis于1985年發(fā)明(fmng)了PCR技術(shù)，并榮獲了1993年諾貝爾化學(xué)獎。PCR現(xiàn)在已成為生命科學(xué)領(lǐng)域最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一，它是一種體外酶促合成DNA 片段方法，由變性、退火和延伸等幾步反應(yīng)組成一個循環(huán)，重復(fù)進(jìn)行，最終使目的DNA 以指數(shù)級迅速擴(kuò)增。常規(guī)PCR反應(yīng)體系中包括模板、引物、Taq DNA聚合酶、 dNTP、 Mg2 + 及緩

8、沖液等成分。與傳統(tǒng)的微生物檢測方法相比，PC具有以下特點:(1)靈敏度高:病毒檢測的靈敏度可達(dá)3 個 RFU，細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌；(2)特異性強(qiáng):對不同微生物型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定； (3) 操作簡便省時:一般12 h就可完成檢測。1.1多重 PCR多重 PCR 又稱多重引物 PCR，其基本原理和操作程序與常規(guī) PCR 相同，只是在反應(yīng)體系中加入多對特異性的引物, 可同時檢出多種致病菌或?qū)ν恢虏【亩鄠€亞型進(jìn)行分類，也可以通過檢測微生物的致病性基因判斷微生物的致病性。多重 PCR 可以顯著提高檢測效率和降低檢測成本，在食品、藥品微生物檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。衛(wèi)沛楠等建立的針對金黃色葡萄

9、球菌9種腸毒素的多重PCR方法檢快速、簡便，且特異性較高，較傳統(tǒng)方法有明顯的優(yōu)勢1；滕要輝等建立的多重 PCR 方法經(jīng)過 4 h 的增菌培養(yǎng)即可從速凍水餃中同時檢出起始菌數(shù) 100 CFUg1的沙門菌和金黃色葡萄球菌，且特異性為100%2；張政等用金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和蠟樣芽孢桿菌 DNA 作為模版建立多重 PCR 方法，在 6 h 內(nèi)即可完成檢測，檢出限達(dá)到 104 CFUmL1 3；強(qiáng)世龍等根據(jù)副溶血性弧菌tdh、tl基因設(shè)計引物用雙重PCR技術(shù)快速檢測新鮮海水貝類樣品中副溶血性弧菌，該方法的最低檢出限為2.5102cfu/mL，模擬污染樣品的檢測限為10cfu/g，且與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的

10、檢測結(jié)果一致4；楊平等針對食品中金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單增李斯特菌建立的多重PCR檢測方法，只需經(jīng)過48h增菌即可檢測，最低檢出限可達(dá)1cfumL 5；Yang等基于多重PCR建立了對食品中鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157： H7和單增李斯特菌的快速檢測方法，其純菌落的檢測限分別達(dá)1.2102 cuf/mL、4.0102cuf/mL 和5.4102cuf/mL）6；范宏英等運(yùn)用多重PCR技術(shù)成功的建立了沙門氏菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157、 綠膿桿菌和副溶血弧菌5種飲用水中致病菌的同時快速方法7。與傳統(tǒng)檢測方法相比，多重 PCR檢測法大大縮短了檢測時間和樣品量，同時提高了

11、結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。1.2免疫(miny)捕獲 PCR(immuno-capture PCR，IM-PCR)IM-PCR 技術(shù)是一種把抗原(kngyun)抗體反應(yīng)和PCR技術(shù)相結(jié)合、用于檢測微量抗原(kngyun)的新技術(shù), 由抗原抗體的免疫反應(yīng)和常規(guī)的 PCR 反應(yīng)組成。該技術(shù)既保留了抗原抗體反應(yīng)的特異性，又應(yīng)用了 PCR 技術(shù)的高度靈敏性, 具有高度特異性、快速檢測、易于操作、成本低廉等優(yōu)點。夏俊芳等應(yīng)用免疫捕獲 PCR方法特異性的檢測了2 株金黃色葡萄球菌，且在對 5 種食品模擬帶菌檢測時發(fā)現(xiàn)，該方法無需培養(yǎng)，檢測的靈敏度可達(dá)到 2.35103 CFUmL1，是常規(guī) PCR 檢測靈敏

12、度的 100 倍8。1.3實時熒光定量PCR (real-time PCR)常規(guī)的 PCR很難根據(jù) PCR 的擴(kuò)增終產(chǎn)物計算起始模板的拷貝數(shù)，即無法對初始模版進(jìn)行定量分析。而熒光定量 PCR 技術(shù)(real-time quantitative PCR，RT-PCR)在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過熒光信號的積累對整個PCR全過程進(jìn)行實時監(jiān)測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可對未知模板起始濃度進(jìn)行定量。高正琴等建立的特異性檢查支原體的 TaqMan 探針實時熒光定量 PCR 方法，檢測靈敏度達(dá) 9.2 拷貝，且與空腸彎曲菌、肺炎克雷伯桿菌等 8 種細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，為動物源性藥品和生物制品中支原體的快速檢測提供了實

13、用的方法9；Herbel 等利用熒光定量PCR 技術(shù)特異性檢測出酸奶中乳酸桿菌的濃度為105 CFUmL1，能夠完全滿足商品中益生菌濃度檢測的需要(通常檢測范圍為 1061012 CFUmL1) 10；徐楊等用鮑魚管家基因16S rRNA基因設(shè)計特異性引物和探針，建立的鮑魚過敏源基因成分實時熒光PCR快速檢測方法具有良好的特異性和靈敏度11；劉繼超等 以SED基因為腸毒素D的檢測靶序列，設(shè)計熒光定量PCR引物和TaqMan探針，建立了TaqMan探針熒光定量PCR方法對乳中產(chǎn)腸毒素D金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測，具有良好的應(yīng)用前景12；2010年,程曉燕等建立的SYBR Green I 實時熒光

14、定量PCR檢測對蝦白斑綜合征病毒的方法,取得了較好的實現(xiàn)效果13。2基因(jyn)探針檢測方法華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院(xuyun)的 Britten 等于1968年利用堿基配對原理使互補(bǔ)(h b)的 2 條核酸單鏈通過退火形成雙鏈創(chuàng)建了基因探針技術(shù)，又稱核酸分子雜交技術(shù)?；蛱结樇夹g(shù)是現(xiàn)代DNA分析方法的基礎(chǔ)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品微生物的檢測中，能排除非致病性微生物的干擾，靈敏、快速、直接地檢測出致病性微生物14,16 。通過分離和標(biāo)記病原體獨特的核酸片段就可制備出探針，利用帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸探針與待測樣品進(jìn)行雜交，最后使用特定的方法測定標(biāo)記物，便可確定樣品中有無特定病原體。Moseley 等

15、用生物素標(biāo)記沙門菌基因片段制作探針檢測食品中的沙門菌取得了良好的效果； Kerdahi 等使用自動化酶連接的非放射性 DNA 探針，迅速準(zhǔn)確地檢測出了單核細(xì)胞增生李斯特菌17； 陳倩等使用針對 ESIEC 大腸桿菌 HPI毒力島基因設(shè)計的 rpz 探針，成功地鑒定出了 ESIEC 大腸桿菌18。此外，商品化的基因探針試劑盒也已經(jīng)問世，例如：美國 GENETRAK 公司研制出了脫氧核糖核酸雜交篩選比色法，主要利用特異的基因探針對沙門菌、 李斯特菌和大腸桿菌的 rRNA 進(jìn)行檢測；法國梅里埃公司研制的 GENEPROBE系統(tǒng)采用雜交保護(hù)分析法對食品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測19。目前已可以用 DN

16、A 探針檢測食品中的大腸桿菌(Escherichia coli) 20、沙門氏菌( Salmonella) 21、志 賀 氏 菌 (Shigella spp ) （Bei A K , Dicesare J C , Haff L .Appl .Envi ro n . M icrobiol. , 1991 ( 57 ) : 1013 1017）、耶希 氏菌( Yersinia enterocolitica) 22、李斯特菌(Listeria monocytogenes) 23、金黃 色葡萄 球菌( Staphylococcus aureus) 24等。 Wang 等對用 DNA 探針雜交技術(shù)檢測食

17、品中 13 種常見的致病菌的一般方法進(jìn)行了概述25。基因探針檢測技術(shù)不僅具有特異性、靈敏度高的優(yōu)點，而且兼?zhèn)浣M織化學(xué)染色的可見性和定位性。目前核酸探針在食品微生物檢測中主要應(yīng)用于以下幾個方面：（1）檢測無法培養(yǎng)或無法生化鑒定、產(chǎn)物不可觀察的微生物以及診斷抗原缺乏病原體的檢測。（2）用于檢測病毒。（3）用于流行病學(xué)調(diào)查研究，區(qū)分有毒和無毒菌株。（4）檢測細(xì)菌內(nèi)抗藥基因（5）分析食品是否會被某些耐藥菌株污染，判定食品污染的特性。3變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）變性凝膠梯度電泳(DGGE)是在聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑(尿

18、素和甲酰胺),電泳時因為雙鏈DNA分子會所含堿基對不同,導(dǎo)致解鏈的溫度有差異,導(dǎo)致DNA分子在凝膠中的存在位置不同,形成不同的條帶,只要把電泳的條件改變的足夠精細(xì),就能把具有堿基差異的DNA分子分開。在食品微生物的鑒定中，先從食品中提取DNA或RNA然后進(jìn)行PCR或RT-PCR的擴(kuò)增，然后利用DGGE凝膠電泳最后進(jìn)行譜帶分析,對條帶進(jìn)行測序后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析最后分離富集。2004年J.Theunissen和TJBritz等人用DGGE法對南非益生茵食品進(jìn)行(jnxng)了抽樣檢查,確認(rèn)了食品中的微生物；Milica Nikolic等人通過(tnggu)PCRDGGE的方法(fngf)鑒定了山羊

19、奶干酪中的乳酸桿菌；畢水蓮等利用鞭毛蛋白基因 flaA 和 flaB 變性梯度凝膠電脈的方法實現(xiàn)了對食品中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的快速檢測和分析26。DGGE 通常與PCR和核酸測序結(jié)合起來聯(lián)合應(yīng)用。4基因芯片技術(shù)(DNA microarray)基因芯片即DNA微陣列(DNA microarray)，基本原理與核酸雜交相似，是基于探針與樣品中的靶基因片段之間發(fā)生的特異性核酸雜交。一塊帶有DNA微陣列的特殊玻璃片、硅片或尼龍膜在數(shù)平方厘米的面積上可以布放數(shù)千或數(shù)萬個按檢測要求設(shè)計好的核酸探針，當(dāng)檢體中的DNA、cDNA、RNA等與探針結(jié)合后，可用熒光或電流等方式檢測雜交信號來實現(xiàn)對樣品的快速檢測

20、27?；蛐酒瑢⒋罅刻结樄袒瑑H通過一次雜交便可檢測出多種靶基因的相關(guān)信息，具有高通量、多參數(shù)同步分析，快速全自動分析，高精確度、高精密度和高靈敏度分析的特點，是目前鑒別有害微生物的最有效的手段之一。近年來， 許多學(xué)者利用基因芯片對常見致病菌進(jìn)行了分析檢測28,29。Jin通過設(shè)計通用 引物擴(kuò)增細(xì)菌核糖體16S及23SrRNA，并將擴(kuò)增產(chǎn)物與含有探針的芯片進(jìn)行雜交，從而在 3 h 內(nèi)快速鑒定出了致病性腸道微生物30。 Chiang 等使用通用引物擴(kuò)增出了細(xì)菌核糖體 16S rRNA，并將擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，結(jié)果可在 4 h 內(nèi)快速檢測出大腸桿菌、沙門菌及葡萄球菌，檢測準(zhǔn)確率高達(dá)

21、 9831。Wang等也采用該技術(shù)在4 h 內(nèi)快速檢測出了食物中的致病菌，準(zhǔn)確率為 97432。 Kim 等采用比較基因組學(xué)技術(shù)，針對 11 種常見的食物源性致病微生物設(shè)計出了新型探針芯片，與全基因組芯片相比，可更加快速準(zhǔn)確地檢測出食品中的微生物。5隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù) (RAPD)隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)技術(shù)的機(jī)理為使用812個核苷酸長度的隨機(jī)引物于低溫環(huán)境下退火,經(jīng)過基因組DNA和引物之間的非特異位點錯配進(jìn)行復(fù)性,同時利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。PAPD聯(lián)合其他技術(shù)能夠加快對重要基因的獲取速度,結(jié)合染色體步移技術(shù)可以對迅速完成對相關(guān)基因克隆分離及定位。目前,RAPD技術(shù)在真菌、支原體和

22、細(xì)菌等微生物的分型中得到了非常廣泛的應(yīng)用。相關(guān)學(xué)者通過利用PAPD技術(shù)對淡水中分離出來的溶血弧菌和溶藻弧菌進(jìn)行了有效的分型33。G.Spano 等從紅葡萄酒中分離出一株菌株，經(jīng)過 RAPD- PCR 技術(shù)鑒定為植物乳桿菌34；Walczak等通過RAPD分析鑒定出非生產(chǎn)用酵母菌株與標(biāo)準(zhǔn)清酒假絲酵母菌株的遺傳相似性。除此之外，應(yīng)用該技術(shù)對食源性致病包括葡萄球菌、 大腸埃希氏、沙門氏菌和志賀氏菌都有一定的研究35。6不足(bz)展望雖然和傳統(tǒng)的檢測(jin c)方法相比分子生物學(xué)技術(shù)(jsh)有著方便快捷等優(yōu)勢，是未來發(fā)展的趨勢但與此同時它也存在這許多尚待改進(jìn)完善的地方。例如：PCR容易出現(xiàn)假陽性

23、的結(jié)果，樣品之間容易造成交叉污染；基因探針檢測技術(shù)放射性同位素標(biāo)記的核酸探針成本高、對人體危害性大、反應(yīng)廢棄物難以處理及操作步驟繁瑣；基因芯片技術(shù)成本過高,而且樣品制備和待測定靶標(biāo)探針標(biāo)記方法復(fù)雜, 需專項技術(shù)人員才可以操作,且存在不同程度的假陽性, 結(jié)果重復(fù)性較差,難以統(tǒng)一化、標(biāo)準(zhǔn)化,基因組學(xué)的資源庫還需要極大的豐富, 信號檢測的靈敏度需要增加等。這些問題都不同程度上限制了分子生物學(xué)技術(shù)在食源性微生物檢測中的商品化大規(guī)模應(yīng)用。 因此，更穩(wěn)定可靠、更低廉有效、更簡單方便、更靈敏無害的檢測方法是今后的研究熱點和發(fā)展趨勢。同時，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和日益完善，一定會在今后的食源性微生物檢測

24、乃至整個食品安全檢測中發(fā)揮更加重大的作用。參考文獻(xiàn)1 WEI P N, LYU G P, XU B H, et al. Multiplex PCR for the detection of the 9 enterotoxin genes in foodborne staphylococcus aureus J. Mod Prev Med(現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)),2013, 40(17): 3269-3272.2 TENG Y H, SUO B, AI Z L, et al. Establishment and application of a multiplex PCR assay for simul

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