質(zhì)粒DNA的提取、定量、酶切與PCR鑒定試驗(yàn)報(bào)告

1、質(zhì)粒DNA勺提取.定量.酶切與PCR判定.試驗(yàn)?zāi)繕?biāo).進(jìn)修并控制用堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA勺力法；.進(jìn)修并控制懂得質(zhì)粒酶切判定的辦法 ；.進(jìn)修并控制紫外接收檢測(cè) DN雁度和純度的道理和辦法；.進(jìn)修并控制PCFS因擴(kuò)增的試驗(yàn)道理和操縱辦法 ；.進(jìn)修并控制程度式瓊脂糖凝膠電泳的道理和應(yīng)用辦法.試驗(yàn)道理.PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒错懀┰贒NA聚合酶催化下，可以DNA為模板,以特定引物為延長(zhǎng)起點(diǎn)，以dNTP 為原料，經(jīng)由過(guò)程變性.退火.延長(zhǎng)等步調(diào)，在體外（緩沖液中）復(fù)制 DNA, 使目標(biāo)DNA 2n方法呈指數(shù)情勢(shì)擴(kuò)增.PCRH次輪回的具體反響步調(diào)為：A.變性：加熱反響體系至 95C,使模板DNA在高溫下完整變

2、性，雙鏈解 鏈.B.退火：逐漸下降溶液溫度，使合成引物在低溫（35-70 C, 一般低于模板Tm值白5 c閣下），與模板DNAS補(bǔ)退火形成部分雙鏈.C.延長(zhǎng)：溶液反響溫度升至中溫 72C,在Taq酶感化下，以dNTP為原料， 引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板DNA的一條單鏈在解鏈和退火之后延長(zhǎng)為一條雙鏈.2.質(zhì)粒DNA勺提取與制備.堿裂解法：染色體DNAW質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性消失差別：A.高堿性前提下，染色體DN所口質(zhì)粒DNA勻變性；B.當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其 pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并保管在 溶液中，染色體DNA不克不及復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀構(gòu)造 ，可經(jīng)由過(guò)程離 心形成沉沉淀去除.2）.離心層

3、析柱：A.硅基質(zhì)膜在高鹽.低pH值狀況下可選擇性地聯(lián)合溶液中的質(zhì)粒DNA,而不吸附溶液中的蛋白質(zhì)和多糖等物資；B.通曩昔蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除；C.低鹽，高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNAR硅基質(zhì)月！上洗脫.質(zhì)粒DNA勺定量剖析（紫外分光光度法）：A.物資在光的照耀下會(huì)產(chǎn)生對(duì)光的吸見(jiàn)效應(yīng)，且其對(duì)光的接收是具有選擇性；B.各類(lèi)不合的物資都具有其各自的接收光譜：DN心對(duì)波長(zhǎng)260nm的紫外光有特異的接收峰蛋白質(zhì)對(duì)波長(zhǎng)280nm的紫外光有特異的接收峰碳水化合物對(duì)230nm的紫外光有特異的接收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反響 DNA的純度；A260/A28

4、0=1.8 DNA 純凈A260/A2801.8含 RNAfe質(zhì)，用 RNAS1去除.質(zhì)粒DNA勺酶切判定：限制性?xún)?nèi)切酶是 DNA重組操縱進(jìn)程中所應(yīng)用的根本對(duì)象.限制性?xún)?nèi)切酶能特異性地與一段被稱(chēng)為限制酶辨認(rèn)序列的特別DNA序列聯(lián)合，或是與其鄰近的特異位點(diǎn)聯(lián)合，并在聯(lián)合位點(diǎn)切割雙鏈 DNA.瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖是一種自然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決議于瓊脂糖的濃度.DN心子在堿性情形中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)感化下向正極泳動(dòng).DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)：不合的 DNA, 分子量大小及構(gòu)型不合 ，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不合，從而分出不合的區(qū)帶(遷徙速

5、度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系).三.材料與辦法：(一)試驗(yàn)材料：.PCR儀器：PCF .臺(tái)式離心計(jì)心情.微量加樣槍.滅菌的薄壁離心管材料：菌液【大腸桿菌 DH5a菌株(pMD19-T質(zhì)粒，含目標(biāo)片斷-綠色熒光蛋白GFP .無(wú)菌去離子水.2xPremixTaq.弓I物.質(zhì)粒DNA勺提取與制備儀器：恒溫造就箱.臺(tái)式離心計(jì)心情.離心層析柱.Eppendorf管.微量加 樣槍.離心管材料：溶液 P1 (S1).溶液 P2 (S2 ).溶液 P3 (S3).去蛋白液 PE (W1漂洗液 WB(W2 .洗脫液EB (Eluent).含pMD19-T質(zhì)粒的大腸桿菌 DH5%.質(zhì)粒DNA勺定量(紫外分光光度法

6、)儀器：比色杯.紫外分光光度計(jì).微量加樣槍材料：蒸儲(chǔ)水.質(zhì)粒DNA.質(zhì)粒DNA勺酶切判定儀器：1.5ml的EP管.微量加樣槍材料：無(wú)菌水.10XM 酶切緩沖液 Buf R.質(zhì)粒 DNA.Hind III (15U/ul).EcoR I(12U/ul).瓊脂糖凝膠電泳儀器：凝膠電泳體系.凝膠成像體系材料：電泳指導(dǎo)劑.Gelview.TBE.瓊脂糖.DNA Marker 5000.電泳緩沖液 (二)試驗(yàn)辦法1.PCR空柱13000rpm離心1min,然后室溫放置3min,使殘留乙醇揮發(fā),在吸附膜的中央加 50卜1洗脫緩沖液（Eluent）,室溫放時(shí)1min, 13000rpm離心1min洗脫質(zhì)粒D

7、NA ,-印C保管備用-，清濟(jì)比色皿：用微量加樣槍向比色皿參加話(huà)一4,質(zhì)粒DNA勺酶切學(xué)再向比色皿參加2ul的質(zhì)粒DNA,于紫外分光IJ定光度計(jì)長(zhǎng)進(jìn)行sample測(cè)定,記載相干數(shù)據(jù)5.瓊脂糖凝膠電、混勻試劑，將EP管置于恒溫水浴箱中37C 1. 5小時(shí),取質(zhì)粒 DNA,經(jīng)酶切發(fā)響后的 DNA片斷和PCR1 MGejyiew染料康宇溫放胃匚一6 a7空不至P忤巾笄砌子標(biāo)識(shí)用微量加樣槍分離各汲取10ul,按序號(hào)參加到電泳儀的凝膠孔中電泳30分鐘四,成果與評(píng)論辯論:, n ，掏出膠紫外光下不雅察，攝（一）試驗(yàn)現(xiàn)象.參加溶液P1,消失懸顯現(xiàn)象；.參加溶液P2,平和混勻，溶液會(huì)變得清澈；.參加溶液P3,

8、有白色絮狀沉淀生成；4.電泳時(shí),可不雅察到在電流感化下，點(diǎn)樣的溶液消失電泳現(xiàn)象，電泳速度不合.在紫外檢測(cè)儀前提下，可以不雅察到不合的物資消失不合的電泳帶（二）試驗(yàn)成果原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)量次數(shù)質(zhì)粒DNA濃度（ug/ml）Ratio比值（A260/A280）11481.46電泳后的圖片（四）試驗(yàn)剖析.由上數(shù)據(jù)可知,Ratio=1.47樣品中含有較多的蛋白質(zhì)（芬芳族）.在圖片中，其他三類(lèi)DNA與Maker比擬較，可知質(zhì)粒DNA的分子大小 在2500bp-3500bp,酶切反響的質(zhì)粒DNA片斷分子大小在2800-3000bp和 400-500閣下,PCR的DN心子大小在400-500bp.根本相符預(yù)期.（

9、四）試驗(yàn)評(píng)論辯論.質(zhì)粒DNA中消失三條帶，分離對(duì)應(yīng)超螺旋質(zhì)粒 DNA線(xiàn)上i DNA和開(kāi)環(huán)狀 質(zhì)粒DNA這三種不合構(gòu)型的分子有不合的遷徙率 ，在一般情形下，遷徙速 度最快的為超螺旋型，其次為線(xiàn)性分子，最慢的為開(kāi)環(huán)狀分子，所以條帶 從上到下分離為：超螺旋型 DNA線(xiàn)性分子.開(kāi)環(huán)狀分子.,.對(duì)于試驗(yàn)成果中：的可能原因?yàn)椋骸叭∩锨逡骸辈秸{(diào)中吸入沉淀導(dǎo)致引入較多的蛋白雜質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)試驗(yàn)中因蛋白質(zhì)量較多而難以去除.B.可能為試劑污染引起雜質(zhì)蛋白的引入.試驗(yàn)中需留意的事項(xiàng)：用微量加樣槍加試劑時(shí),同種試劑可以不必?fù)Q吸頭，每次換不合試劑時(shí)要 記得換一個(gè)新吸頭.在PCR中，假如配好的反響液較多沾到管壁上，要將

10、PCRS響管置臺(tái)式離心計(jì)心情中瞬時(shí)離心，使反響液分散于管底，然后才將反響管放到基因擴(kuò) 增儀上.在質(zhì)粒DNA提取的t驗(yàn)中，參加溶液S2時(shí)，時(shí)光不克不及太久，動(dòng)作要溫 順，輕輕顛倒幾回.在電泳試驗(yàn)中，點(diǎn)樣時(shí)槍頭下伸，點(diǎn)樣孔內(nèi)不克不及有氣泡.在電泳中,Geldview有毒，切勿用手接觸.思慮題：(1)堿裂解法提取質(zhì)粒時(shí)，溶液I.II.III 的感化分離為？答：溶液I :螯合金屬離子，克制脫氧核酸酶對(duì) DNA的降解感化；有利于溶酶 體的感化.溶液II :細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性.溶液III :酸性前提下質(zhì)粒 DNAM，性，變性蛋白-SDS+線(xiàn)Ti DNA沉淀,Na+ 可中和DNA.(2)聯(lián)合試驗(yàn)情形，若何進(jìn)步限制性酶切的反響效力？答：盡量選擇粘端酶切和那些酶切效力高的限制酶.酶量的選