引物步移法測(cè)序

1、引物步移法測(cè)序復(fù)制網(wǎng)址新浪微博豆瓣社區(qū)騰訊微博開(kāi)心網(wǎng)人人網(wǎng)只看樓主聽(tīng)說(shuō)長(zhǎng)片段（500）測(cè)序一般采用所謂引物步移”的方法，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物繼續(xù)walking，直至測(cè) 通全長(zhǎng)。那么根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)一個(gè)引物，另一端用什么引物？是用隨機(jī)引物嗎？如果用隨機(jī)引物的話， 這組隨機(jī)引物怎么設(shè)計(jì)？各位高手有沒(méi)有這方面的資料可以看看，先謝謝了0票票數(shù)good good study day day up flameofstar edited on 2006-08-20 13:57 舉報(bào)【專題討論】將支氣管鏡操作進(jìn)行到底。熱烈歡迎上海長(zhǎng)海醫(yī)院呼吸內(nèi)科黃海東主治醫(yī)師做客 丁香園。xrsgjt2006-11-13 1

2、4:14 消息 引用 收藏分享測(cè)序引物只要一條就可以了啊。為什么需要兩條呢？呵呵。只要在你巳有的結(jié)果上設(shè)計(jì)一條引物往積分0得票0粉絲加關(guān)注下走就可以了，一般的測(cè)序公司都可以做到。若是片斷太長(zhǎng)你可以重兩頭同時(shí)開(kāi)始測(cè)序這樣省時(shí)些。有什么問(wèn)題發(fā)郵件到 HYPERLINK mailto:xiong_ xiong_ 繼續(xù)探討Re:請(qǐng)問(wèn)什么是步移法步移法一般認(rèn)為是由于反向PCR可用于研究與已知DNA片段相連的未知染色體序列，因 此又被稱為染色體步移法。此法所選擇的引物雖與已知DNA序列互補(bǔ)，但兩引物3端是反 向的。染色體步移技術(shù)主要應(yīng)用于克隆啟動(dòng)子、步查獲得新物種中基因的非保守區(qū)域、鑒定 T-DNA或轉(zhuǎn)座

3、子的插入位點(diǎn)、染色體測(cè)序工作中的空隙填補(bǔ)，從而獲得完整的基因組序列 等方面。screen.width-333)this.width=screen.width-333 width=640 height=404title=Click to view full 染色體步移法 1.JPG (700 X 442) border=0align=absmiddle克隆步移法作者：agui674 提交日期：2007-1-22 16:22:00在基因組測(cè)序中，存在著兩種不同的戰(zhàn)略，即全基因組隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)略和以物理圖為基 礎(chǔ)的以大片斷克隆為單位的定向測(cè)序戰(zhàn)略。兩者的最大區(qū)別在于是否依賴基因組作圖。全基因組隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)

4、略主要采用鳥(niǎo)槍法(shotgun)。鳥(niǎo)槍法，也俗稱“霰彈法”，是隨 機(jī)先將整個(gè)基因組打碎成小片段進(jìn)行測(cè)序，最終利用計(jì)算機(jī)根據(jù)序列之間的重疊關(guān)系進(jìn)行排 序和組裝，并確定它們?cè)诨蚪M中的正確位置。“鳥(niǎo)槍法”優(yōu)點(diǎn)是速度快，簡(jiǎn)單易行，成本較 低，可以在較短的時(shí)間內(nèi)通過(guò)集中機(jī)器和人力的方法獲得大量的基因片斷。但是用它來(lái)測(cè)序， 最終排序結(jié)果的拼接組裝比較困難，尤其在部分重復(fù)序列較高的地方難度較大。此外有許多 序列片段難以定位在確切的染色體上，成為游離片斷；同時(shí)又會(huì)有許多地方由于沒(méi)有足夠的 覆蓋率而形成空缺。這些缺陷最終導(dǎo)致整個(gè)基因圖會(huì)留下大量的空洞（gap），也影響其準(zhǔn)確 度。以大片斷以定位的克隆為基礎(chǔ)的

5、定向測(cè)序戰(zhàn)略主要采用克隆步移法或稱克隆連克隆法 （clone by clone）：先構(gòu)建遺傳圖，再利用幾套高度覆蓋的大片段基因組文庫(kù)（BAC、PAC等） 獲得精細(xì)的物理圖，選擇合適的BAC或PAC克隆測(cè)序，利用計(jì)算機(jī)拼裝。BAC內(nèi)的空洞 基本上都可以利用設(shè)計(jì)引物等手段填補(bǔ)，形成一條完整的BAC序列。然后由相互關(guān)聯(lián)、部 分重疊的BAC克隆連成一個(gè)大的重疊群（Contig）。理想狀況下，整條染色體就是由一個(gè)完 整的重疊群構(gòu)成。但通常情況下部分BAC之間會(huì)有物理空洞（Physical Gap），這是目前國(guó) 際上還未克服的難題。利用克隆步移法測(cè)序，國(guó)際上通行的標(biāo)準(zhǔn)要求BAC測(cè)序達(dá)到十倍覆 蓋率，使所測(cè)

6、的序列達(dá)到99.99%以上的準(zhǔn)確度。該方法的技術(shù)難度較高，尤其大片段基因 組文庫(kù)（BAC）和精細(xì)物理圖構(gòu)建是技術(shù)性極強(qiáng)的工作；此外，費(fèi)用相對(duì)于鳥(niǎo)槍法要稍高 一些，完成整個(gè)基因組測(cè)序周期也要長(zhǎng)些。但是，通過(guò)這種方法得到的基因組數(shù)據(jù)是最為準(zhǔn) 確和精細(xì)的數(shù)據(jù)，也是基因組測(cè)序的最終目標(biāo)。大基因組“完成圖”目前大多都是通過(guò)這種方 法獲得的。基因組“完成圖”，即完全覆蓋所測(cè)物種的基因組、準(zhǔn)確率超過(guò)99.99%的全DNA序列 圖。“完成圖”的覆蓋率接近100%，準(zhǔn)確率更高，達(dá)到99.99%?！巴瓿蓤D”將為人們提供更 詳盡、更準(zhǔn)確的基因圖譜。草圖與完成圖是測(cè)定水稻基因組序列的兩個(gè)階段，草圖繪制的是 整個(gè)基因組

7、的框架，完成圖則是基因組序列測(cè)定的完成結(jié)果和最終目標(biāo)。【求助/交流】染色體步移的方法獲取基因全長(zhǎng)序列，測(cè)序結(jié)果不對(duì)，是什么原因?作者:pcc163 （站內(nèi)聯(lián)系 TA）收錄:2010-06-07發(fā)布:2010-05-26染色體步移的方法獲取基因全長(zhǎng)序列，引物設(shè)計(jì)和模板都沒(méi)問(wèn)題，PCR結(jié)果顯示有一條清 晰的條帶，但測(cè)序結(jié)果不對(duì)，是什么原因？大家?guī)兔ο胂胧窃趺椿厥?，謝謝了linxi8579 （站內(nèi)聯(lián)系 TA）你說(shuō)的就是walking吧，我也正在做呢。前段時(shí)間我也出現(xiàn)這樣的情況，后來(lái)我又重新做的。 原因可能是測(cè)序有問(wèn)題，或者在PCR時(shí)模板是混雜的染色體，有可能別的搭在了正確的序 列上恰好被擴(kuò)增了。我們

8、當(dāng)初分析了這兩個(gè)原因，總之還是要重做的吧。希望有同行能夠推 翻我的解釋啊。2585165 （站內(nèi)聯(lián)系TA）是用PCR產(chǎn)物直接測(cè)得序么？還是連接之后測(cè)得？biosafety （站內(nèi)聯(lián)系 TA）walking會(huì)產(chǎn)生一些非特異性的擴(kuò)增，建議在已知的一端設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增片段短的鑒定引物， 先對(duì)walking產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證后再測(cè)序。測(cè)序還是克隆到載體上較好，用上面所說(shuō)的引物再鑒 定一下，測(cè)序結(jié)果就沒(méi)問(wèn)題了。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，一是引物位置附近序列無(wú)法獲得，其 次是如果模板不純，效果不好。zsxnd （站內(nèi)聯(lián)系TA）Originally posted by biosafety at 2010-05-27 0621:walking會(huì)產(chǎn)生一些非特異性的擴(kuò)增，建議在已知的一端設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增片段短的鑒定引物， 先對(duì)walking產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證后再測(cè)序。測(cè)序還是克隆到載體上較好，用上面所說(shuō)的引物再鑒 定一下，測(cè)序結(jié)果就沒(méi)問(wèn)題了。PCR產(chǎn)物直接.I think so ！liuxn0103 （站內(nèi)聯(lián)系 TA）我們也再做，也出現(xiàn)過(guò)這樣結(jié)果。除了上面提到可能原因。我們認(rèn)為還有一個(gè)原因：你的模 板質(zhì)量很重要。順祝試驗(yàn)順利！linxi8579 （站內(nèi)聯(lián)系 TA）Originally posted by pcc163 at 2010-05-26 2