常用作物遺傳轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)基的配置

1、MS大量元素X20名稱2L的量溶于1L的水4L的量溶于2L的水NH4NO3 （硝酸銨）33g66gKNO3（硝酸鉀）38g76gMgSO4 7H2O（硫酸鎂）7.4g14.8gKH2PO4（磷酸二氫鉀）3.4g6.8gCaCl - 2H2O（氯化鈣）8.8g17.6g備注氯化鈣單溶，溶解后再與前四種混合液混勻，然后 定容。MS微量元素X200KI （碘化鉀）0.166gH3BO3（硼酸）1.24gMnSO4 - H2O（硫酸錳）2.38gZnSO4 - 7H2O（硫酸鋅）1.72gNa2MoO4 - 2H2O （鉬酸鈉）0.050gCuSO4 - 5H2O（硫酸銅）0.0050gCoCl2 -

2、 6H2O （氯化鉆）0.0050g備注：溶于1000ml水。MS有機 X200煙酸0.1gB10.1gB60.1g甘氨酸（氨基乙酸）0.4g備注:溶于1000ml水。MS鐵鹽 X200硫酸亞鐵1.112gNa2 EDTA1.492g- 備注：分別溶解后混勻，定容于200ml水。氫氧化鈉的配置：稱4g NaOH粉末放到蒸餾水中，溶解后再定容到100ml即可。改良 MS （MS）X20KNO3（硝酸鉀）19gMgSO4 - 7H2O（硫酸鎂）3.7gNH4NO3（硝酸銨）16.5gKH2PO4（磷酸二氫鉀）3.4gCaCl2 2H2O（氯化鈣）4.4g備注：溶于1000ml水。MS，有機（與MS

3、相同）X200煙酸0.1gB10.2gB60.1g甘氨酸0.4g備注：溶于1000ml水。N6大量 X20kno3 （硝酸鉀）56.6g（NH4）2SO4（硫酸銨）9.26gMgSO4 7H2O（硫酸鎂）3.7gKH2PO4 （磷酸二氫鉀）8gCaCL 2H.0（氯化鈣）3.32g備注：氯化鈣單溶，溶解后再與前四種混合液混勻，然后定容1000ml。N6微量X200MnS04 H20（硫酸錳）0.666gZnSO4 7H20（硫酸鋅）0.3gH3B03（硼酸）0.32gKI （碘化鉀）0.16g溶于1000ml水。N6有機 與MS有機相同N6鐵鹽與MS鐵鹽相同W14大量X20KNO3 （硝酸鉀）

4、40gNH4H2PO4（磷酸二氫銨）7.6gMgSO4 - 7H2O（硫酸鎂）4gK2SO4 （硫酸鉀）14gCaCL - 2HO2.8g備注：溶于1000ml水。（氯化鈣單容）W14 微量 X200MnSO4 - H2O（硫酸錳）1.6gZnSO4 - 7H2O（硫酸鋅）0.6gH3BO3 （硼酸）0.6gKI（碘化鉀）0.1gCuSO - 5HO（硫酸銅）0.005gCoCL2 6H2O 氯化鉆）0.005N2mOo4 - 2H2O（鉬酸鈉）0.001g備注：溶于1000ml水。W14鐵鹽與MS鐵鹽相同W14有機與MS有機相同接種小麥花藥的程序準備工作；培養(yǎng)基、用滅過菌的一水配75%酒精，

5、棉花，95%,火柴，酒精燈，直鑷， 托盤，燒杯或塑料盒，放燒過鑷子的皿底，裝75%酒精的瓶子，將超凈工作臺打開吹 15分鐘，然后擦干凈即可使用。把樣品拿到準備間內(nèi)去葉，注意尖上留一點小葉，避免酒精滲進去。把一天的量弄夠， 上午做不完的用保鮮膜包好放入4。冰箱，下午再用。消毒：將去葉的樣品拿到超凈工作臺上，先用75%的酒精棉擦2次放入托盤中，再用 酒精棉擦第3次后放入盒中或燒杯中準備接種。點著酒精燈：把皿底及鑷子燒好備用，再把三角瓶皮筋拆下，拿到燈前用火燒一下封 口紙，再斜著拿瓶把紙打開，用火燒一下瓶口，然后把燒好的三角瓶盡量往超凈工作 臺里面放，避免污染。用75%酒精壺噴一下雙手消毒，把樣品外

6、衣剝掉露出長穗，面對有棱的一面，先用直 鑷剝?nèi)ネ鈿ぢ冻龌ㄋ?，每一個花苞有3個花藥，將其用彎鑷輕輕地夾起磕到三角瓶中， 每瓶3個穗子大概100個花藥。接好后，將鑷子及三角瓶瓶口和封口紙燒一下，把三角瓶斜著拿用封口紙蓋好，系上 皮筋寫上名稱及日期，放在培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。觀察：15-20天開始觀察，只要出了愈傷就趕快把它轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上。愈傷越小越好。小麥花藥誘導培養(yǎng)基(PH 5.8)W14大量 X2050 ml/LW14 微量 X10010 ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖100g/L2,4-D(1mg/ml)2mg/LKT(1mg/ml)0.5mg

7、/L瓊脂(培養(yǎng)基稍微軟點)4.5g/L備注：放在30C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。(15 20天左右出愈傷)小麥花藥分化培養(yǎng)基(PH 5.8)MS大量 X2050ml/LMS微量X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖30g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/LKT(1mg/ml)0.5mg/L瓊脂5g/L備注：小麥花藥壯苗培養(yǎng)基(PH 5.8)MS大量 X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖80g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/L多效唑2 mg/L瓊脂

8、5g/L備注：小麥幼穗消毒步驟：1、.用75%酒精快速沖洗幾秒鐘，主要清洗根部。2、再用75%酒精快速沖洗一下，然后撈出放到燒杯里。小麥幼穗誘導培養(yǎng)基(PH 5.8)MS大量X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L鐵鹽X 2005ml/L有機X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖40g/L2,4-D (1 mg/ml)2mg/LNAA (0.5mg/ml)0.125mg/LKT (1mg/ml)0.1mg/L瓊脂5g備注：篩選時再加篩選劑。每年在加篩選劑之前先找老師確認一下，然 后再加。篩選劑：lys (賴氨酸)1ml/LBia (除草劑)200ul/L草甘膦100ul/l小麥幼胚

9、消毒步驟：用75%的酒精沖洗一下。再用次氯酸鈉（1 ： 1）浸泡10分鐘。最后用無菌水沖洗56遍。小麥幼胚誘導培養(yǎng)基（PH 5.8）MS大量 X205 0 ml/LMS微量X 2005 ml/L鐵鹽 X 2005 ml/L有機 X 2005 ml/L肌醇10 0 mg/L蔗糖3 0g/L2,4-D (1mg/ml)2mg/L瓊脂5g/L基因槍轉(zhuǎn)化用植物凝膠4g/L備注：篩選時再加篩選劑篩選劑：lys （賴氨酸）1ml/LBia （除草劑）200ul/L草甘膦100ul/l小麥幼胚、幼穗分化培養(yǎng)基（PH 5.8）MS大量X2050ml/LMS微量X2005ml/L鐵鹽X2005ml/L有機X20

10、05ml/L肌醇100mg/L蔗糖30g/L玉米素(1mg/ml)10mg/LIAA(1mg/ml)1mg/L瓊脂5g/L備注：分化培養(yǎng)基篩選劑減半小麥幼胚、幼穗壯苗培養(yǎng)基（PH 5.8）MS大量 X2050ml/LMS 微量X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖80g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/L多效唑2mg/L瓊脂5g/L備注：玉米幼胚誘導培養(yǎng)基(PH 5.8)N6大量 X2050ML/lN6微量 X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L水解酪蛋白500mg/LL-脯氨酸

11、700mg/L蔗糖30g/L2,4-D (1mg/ml)2mg/L瓊脂5g/L(硝酸銀)AgNO3(10mg/ml)10mg/L備注：篩選培養(yǎng)基=誘導培養(yǎng)基+篩選劑篩選劑：Bia200ul/L草甘膦100ul/L玉米幼胚分化培養(yǎng)基(PH 5.8)MS大量X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L水解酪蛋白500mg/LL-脯氨酸700mg/L蔗糖30g/LKT (1mg/ml)1.5mg/LAgNO3(10mg/ml)0.5mg/L瓊脂5g/L備注：分化培養(yǎng)基篩選劑減半。玉米幼胚壯苗培養(yǎng)基(PH 5.8)1/2MS 大

12、量 X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L水解酪蛋白200mg/LL-脯氨酸700mg/L蔗糖50g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/L多效唑(40mg/ml)2mg/L瓊脂5g/L備注：小結(jié)一、配置玉米誘導、分化培養(yǎng)基時，注意AgNO3（硝酸銀）有毒，添加時要小心。二、如果小麥和玉米要打基因槍，在配置其誘導培養(yǎng)基時，一定要用植物凝膠（加4g/L）。三、在配大量元素時注意有CaCl22H20（氯化鈣），切記把它用一個容器單溶，等前幾樣 完全溶解后，再將溶好的氯化鈣倒入其中混勻。四、在配置培養(yǎng)基時：一般情況下

13、，大量、微量、鐵鹽、有機的實加量X瓶子上的倍數(shù)=1000ml，即實 加量=1000ml ：瓶子上的倍數(shù)。激素的實加量=所給數(shù)：瓶子上的數(shù)。在配好培養(yǎng)基，將它加熱前用NaOH（氫氧化鈉）調(diào)PH值=6.0，一般情況下1L加8 滴即可，如不行再每升加12滴慢慢調(diào)，直到PH=6.0，實際加熱后PH值=5.8 了。當培養(yǎng)基加熱至冒熱氣時，再把稱好的瓊脂倒入其中混勻至開，然后分裝，滅菌。加瓊脂時要根據(jù)其質(zhì)量和天氣冷熱程度添加，一般情況下花藥加4.5g/L，其它加 5g/L即可。到了冬天每升加4.5g。1、穗子拿來后，暫時不接的放入4。冰箱(最多放6天)。2、要接的穗子用百分之百次 氯酸鈉浸泡10-15分鐘

14、，然后用無菌水沖洗56遍。3、接好的花藥放在30C培養(yǎng)箱中 暗培養(yǎng)，培養(yǎng)30天，隨時觀察，發(fā)現(xiàn)愈傷趕快轉(zhuǎn)出來，愈傷越小越好。水稻花藥誘導培養(yǎng)基(PH 5.8)N6大量X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖50g/L2,4-D(1mg/ml)2mg/LNAA(0.5mg/ml)1.5mg/L瓊脂4.5g/L備注：水稻花藥放在30C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。15-20天左右出愈傷，最好每天觀察一下， 防止愈傷長大，愈傷越小越好。水稻花藥分化培養(yǎng)基(PH 5.8)MS大量 X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L鐵鹽

15、X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖30g/LKT (1mg/ml)2mg/LNAA(0.5mg/ml)1mg/LIAA (1mg/ml)0.5mg/L瓊脂5g/L備注：水稻花藥壯苗培養(yǎng)基(PH 5.8)MS大量 X2050ml/LMS微量 X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖80g/LNAA(0.5mg/ml)0.5mg/L多效唑(40mg/ml)2 mg/L瓊脂5g/L備注：接種黑麥草的程序準備工作：先把工作臺打開吹1015分鐘,，同時把培養(yǎng)基、75%的酒精、95%酒 精、酒精燈、火柴、長直鑷、培養(yǎng)皿

16、、裝75%的酒精瓶子（放鑷子）、剝好的草籽、 滅過菌的三角瓶、封口膜全部準備好，然后用75%酒精擦23遍超凈工作臺，即可 操作。操作步驟；1、把草籽外皮剝掉（不用泡水）。2、把剝好的草籽放在50ml的三角瓶里在超凈工作臺上用75%的酒精浸泡23分鐘。3、再用次氯酸鈉濃度為（1 ： 1）浸泡45分鐘，浸泡過程中再倒入另外一個滅過菌的 小三角瓶里，把瓶口燒一下，再經(jīng)常搖一搖。4、最后用無菌水沖洗56遍，即可。黑麥草誘導培養(yǎng)基（PH 5.8）W14大量 X2050ml/LW14 微量 X10010ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖100g/L2,4-D

17、(1mg/ml)8mg/LNAA(0.5mg/ml)4mg/LKT(1mg/ml)0.1mg/L瓊脂5g/L備注：黑麥草分化培養(yǎng)基（PH 5.8）MS大量X2050ml/LMS 微量 X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖30g/LNAA (0.5mg/ml)0.5mg/LKT(1mg/ml)0.5mg/L瓊脂5g/L備注：黑麥草壯苗培養(yǎng)基（PH 5.8）MS大量X2050ml/LMS 微量 X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖80g/LNAA (0.5mg/ml)0.5mg/L多

18、效唑（40mg/ml）2mg/L瓊脂5g/L備注：黑麥草幼穗誘導和小麥幼穗誘導培養(yǎng)基（PH 5.8）W14大量+W14微量+鐵鹽+有機+肌醇+糖100g/L+4mg/L2, 4-D+0.5mg/LKT+瓊脂（黑麥 草）W14大量+W14微量+鐵鹽+有機+肌醇+糖100g/L+2mg/L2, 4-D+0.5mg/LKT+瓊脂（小麥） 煙草轉(zhuǎn)化：共培養(yǎng)：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L分化培養(yǎng)：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+Kan200mg/L+cef500mg/L生根：MS+NAA0.1mg/L+Kan100mg/L+cef200mg/L注意：Kan和cef不能高

19、壓滅菌，滅完菌以后用手摸一摸裝有培養(yǎng)基的三角瓶不燙手了， 然后再加。甘薯快繁（PH 5.8）MS 大量X2050ml/LMS 微量 X 2005ml/L鐵鹽 X 2005ml/L有機 X 2005ml/L肌醇100mg/L蔗糖40g/L瓊脂5g/L備注：甘薯葉片再生（ph 5.8）MS + NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+肌醇 100mg/L+糖 30g/L+瓊脂 5g/L1 /2MS + NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+肌醇 100mg/L+糖 30g/L+瓊脂 5g/L1 /2MS + NAA0.5mg/L+Zt0.1mg/L+肌醇 100mg/L+糖 30g/L+瓊脂

20、 5g/L1 /2MS + NAA0.5mg/L+Zt0.5mg/L+肌醇 100mg/L+糖 30g/L+瓊脂 5g/LMS+NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+AgNO30.5mg/L+糖 30gL+瓊脂 5g/L(1DMS+NAA0.5mg/L+KT0.3mg/L+AgNO30.5mg/L+糖 30g/L+瓊脂 5g/LMS + NAA0.5mg/L + KT0.1mg/L + ABA0.5mg/L + 糖 30g/L+瓊脂 5g/LMS+NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+ABA1mg/L+糖 30g/L+瓊脂 5g/LMS+NAA0.5mg/L+KT0.1mg/L+ABA

21、2mg/L+糖 30g/L+瓊脂 5g/LLB培養(yǎng)基(PH 7.0)胰蛋白豚10g酵母提取物5gNCL10備注：加水至一升?；九囵B(yǎng)基（MS0）MS大量+MS微量+鐵鹽+有機+肌醇100mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L誘導（去分化）培養(yǎng)基一篩選培養(yǎng)基一分化培養(yǎng)基一生根（壯苗）培養(yǎng)基III暗培養(yǎng)（長愈傷）原培養(yǎng)基加篩選劑見光（長苗）用NaOH（氫氧化鈉）調(diào)PH值，PH值5.8。一般情況下一升加8滴即可。一升培養(yǎng)基可倒24皿（2包）。接花藥用小三角瓶，一般情況下一升倒40瓶左右（25ml/瓶）0方盒子一升倒16盒左右。蘭花：MS + 6BA2mg/l+NAA1mg/l其它：MS+GA32mg

22、/l08.4.14蘭花：MS + 6BA0.5mg/l+NAA1mg/lP25頁三、4.有機化合物母液主要是維生素和氨基酸類物質(zhì)，必須單配，其濃度有每毫升含0.1、 1.0、10mg化合物。6.植物激素：每種激素必須單獨配成母液，濃度為每毫升含0.1、0.5、10mg激素，用 時根據(jù)需要取用。由于多數(shù)激素難溶于水，它們的配法如下：IAA、IBA、GA3先溶于少量的95%酒精，再加水定容至一定濃度。NAA可溶于熱水或少量95%酒精，再加水定容至一定濃度。2, 4-D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后，再加水定容至一定濃度。KIN和BA先溶于少量1mol的HCl中，再加水定容至一定濃度。玉米素

23、先溶于少量95%酒精中，再加熱水至一定濃度。激素濃度的表示法有兩種，一種是ppm（或每升中毫克數(shù)），另一種是mol（M）.四、培養(yǎng)基的配置方法：混合培養(yǎng)基中的各種成分依次加；大量微量鐵鹽有機植物激素及其它附加 成分，最后用蒸餾水定容至所需配的培養(yǎng)基體積的一半。PH計或PH試紙測PH值，并用0.1mol的NaOH或HCl調(diào)制PH為5.8。分裝：注意不要把培養(yǎng)基倒在瓶口上以防污染。滅菌：用高溫高壓滅菌，一般用1.1Kg/cm2或15磅/時2壓力，在121C下滅菌1520分鐘。五、常用消毒劑的使用和效果:消毒劑使用濃度（%）清除難度消毒時間（分）效果次氯酸鈉2易530很好次氯酸鈣910易530很好漂

24、白粉飽和溶液易530很好氯化汞0.11較難210最好酒精70 75易0.22好過氧化氫10 12最易515好漠水12易210很好硝酸銀1較難530好抗菌素450mg/L中30 60較好漂白粉：低毒有效的消毒劑，密封貯藏，隨用隨配。酒精：7075%酒精，生長組織只需浸1030秒，常用表面滅菌的第一步。次氯酸鈉：安替福民配置成含有210%的次氯酸鈉，一般組織浸泡1030分鐘。它分解出的氨氣起殺菌作用，很容易清除，對植物無害。氯化汞：是一種重金屬化合物，有劇毒。0.10.2%氯化汞是一種效果極好的殺菌劑。 一般浸泡312分鐘，用無菌水反復沖洗，洗凈殘留的汞，否則對培養(yǎng)物會產(chǎn)生毒害 作用。對于難消毒的材料，如有茸毛的，粗糙不平的、地下部的。在消毒之前，一般 要先在70%的酒精中浸泡數(shù)秒或數(shù)十秒鐘，或在消毒劑中加數(shù)滴土溫，增強消毒劑的 效果。禾谷類：玉米：可從多種外植體誘發(fā)愈傷組織，但再生植株的能力是有限的。幼胚被最廣泛地用 于發(fā)生有植株再生能力的愈傷組織。MS培養(yǎng)基用得最廣泛。2, 4-D是誘發(fā)愈傷組織的唯 一激素，濃度為2.3uM到67.8Um.4.5uM2,4-D再加21.5uM NAA和0.24uM Zip可促進愈傷 組織的發(fā)生。當培養(yǎng)幼胚時，盾片必須保持朝上。如培養(yǎng)幼嫩種子時盾片要向下，這樣形 成的愈傷組織最多。除去2, 4-D可以再生植株。