蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)課件(PPT 31頁(yè))

1、第二章蛋白質(zhì)的分離與純化1第1頁(yè)，共31頁(yè)。第二章 蛋白質(zhì)的分離與純化一、蛋白質(zhì)的測(cè)定技術(shù)紫外分光光度法比色法二、蛋白質(zhì)的分離提取蛋白質(zhì)材料的處理蛋白質(zhì)的粗分離蛋白質(zhì)的純化三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析2第2頁(yè)，共31頁(yè)。一、蛋白質(zhì)的測(cè)定技術(shù)3第3頁(yè)，共31頁(yè)。定義：蛋白質(zhì)濃度或含量的測(cè)定方法：凱氏定氮法紫外分光光度法比色法雙縮尿法（Biuret法）Folin酚試劑法（Lowry法）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）BCA法4第4頁(yè)，共31頁(yè)。測(cè)定蛋白質(zhì)含量的是我們研究蛋白質(zhì)功能等方面的基礎(chǔ)，這種技術(shù)也廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量檢測(cè)方面等。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液

2、中存在的干擾物質(zhì)；測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。5第5頁(yè)，共31頁(yè)。一、凱氏定氮法（ Kieldahl Method）測(cè)定蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)方法。測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和重現(xiàn)性最好的方法之一。原理：蛋白質(zhì)的含氮量約16%，含氮量因構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的不同有所差別，在14-19%之間。測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的含氮量，乘以6.25即為蛋白質(zhì)的含量（以蛋白質(zhì)平均含氮量16%計(jì)算）。6第6頁(yè)，共31頁(yè)。測(cè)定分兩步：用沸濃硫酸消化，并以硫酸銅為催化劑，使碳、氫分別以二氧化碳及水蒸汽形態(tài)逸去，而氮轉(zhuǎn)為銨鹽。此過(guò)程需時(shí)較長(zhǎng)，可達(dá)數(shù)小時(shí)。加堿，并將氨自堿液中蒸至標(biāo)準(zhǔn)酸液中，測(cè)定中和氨所消耗的酸

3、量，計(jì)算出樣品中含氮量，再乘以625（經(jīng)驗(yàn)平均值），則得蛋白質(zhì)含量。7第7頁(yè)，共31頁(yè)。反應(yīng)：以甘氨酸為例 CH2COOH | + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O+NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)硫酸銅為催化劑（促進(jìn)有機(jī)含氮化合物分解完全），K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)（290 oC提高到400 oC ）。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。8第8頁(yè)，共31頁(yè)。特點(diǎn)：時(shí)間較長(zhǎng)；蛋白質(zhì)中含氮量通常并不確定，因?yàn)椴煌鞍踪|(zhì)含 氮量不相同，使得計(jì)算所得蛋白質(zhì)量只是

4、具有相當(dāng)誤差的近似值；若欲得精確值，需預(yù)先將蛋白質(zhì)分離，可以以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。當(dāng)有其他含氮化合物時(shí)有干擾。凱氏法有常量法、半微量法及微量法（可測(cè)樣品含氮量為0.10 mg以下 ）。9第9頁(yè)，共31頁(yè)。二、紫外分光光度法紫外（或可見(jiàn)）分光光度法：以溶液中物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外（或可見(jiàn)）光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來(lái)的一類(lèi)分析方法。朗伯-比耳定律：A=lg(1/T)=Kbc A為吸光度,T為透射比,是透過(guò)光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度。c為吸光物質(zhì)的濃度 ，b為吸收層厚度。 物理意義：當(dāng)一束平行單色光垂直通過(guò)某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí),其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收

5、層厚度b成正比。10第10頁(yè)，共31頁(yè)。紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)原理1.蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸和色氨酸殘基含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收近紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。2.蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。11第11頁(yè)，共31頁(yè)。紫外分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的吸光度A為縱坐標(biāo)，其濃度c為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)出被試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對(duì)應(yīng)的濃度值，即未知樣的含量。分光光度法測(cè)量圖12第12頁(yè)，共31頁(yè)。常用的方法（四種）

6、A280法 因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這兩種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 測(cè)定時(shí)，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對(duì)照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0.1 1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，A280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。 許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可查。A238法(肽鍵測(cè)定法) 蛋白質(zhì)溶液在2

7、38nm處的光吸收的強(qiáng)弱,與肽鍵的多少成正比。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列50500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測(cè)定238nm的光吸收值A(chǔ)238,以A238為縱座標(biāo),蛋白質(zhì)含量為橫座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。 13第13頁(yè)，共31頁(yè)。A280與A260吸收差法核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm和260nm處都有吸收，其吸收高峰在260nm附近。含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。 蛋白質(zhì)濃度=1.45A2800.74A260(mg/ml) A215與A235吸收差法215

8、nm和235nm光吸收差值在一定范圍與蛋白質(zhì)濃度成正比。用215nm和235nm光吸收差值與單一波長(zhǎng)測(cè)定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差。對(duì)稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，可選用215nm和235nm光吸收差法。 干擾物質(zhì)的影響較多。14第14頁(yè)，共31頁(yè)。優(yōu)點(diǎn)：紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。缺點(diǎn)：1.測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。2.若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾

9、可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?.蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)因pH的改變而有變化。15第15頁(yè)，共31頁(yè)。三、比色法（colorimetry）定義：以生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)比較或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度來(lái)確定待測(cè)組分含量的方法。比色分析對(duì)顯色反應(yīng)的基本要求：1.反應(yīng)應(yīng)具有較高靈敏度和選擇性；2.反應(yīng)生成的有色化合物的組成恒定且較穩(wěn)定；3.反應(yīng)生成的有色化合物和顯色劑的顏色差別較大等。理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律(AKbc)16第16頁(yè)，共31頁(yè)。（一）雙縮脲法（Biuret法）原理：雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的

10、產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物（540nm），稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能通過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。 17第17頁(yè)，共31頁(yè)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為110mg/mL蛋白質(zhì)。干擾物質(zhì)：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。 18第18頁(yè)，共31頁(yè)。雙縮脲法（Biuret法）過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充

11、分搖勻后，在室溫（20-25）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定：取2-3個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過(guò)10mg/ml。19第19頁(yè)，共31頁(yè)。雙縮脲法（Biuret法）特點(diǎn)：較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。20第20頁(yè)，共31頁(yè)。（二）Folin酚試劑法（Lowry法）實(shí)驗(yàn)原理:蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下與Cu

12、2+反應(yīng)，生產(chǎn)紫紅色蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物，這一復(fù)合物中的氨基酸殘基（主要是酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸）還原Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽，產(chǎn)生鉬蘭和鎢蘭復(fù)合物的深蘭色（745-750nm），顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。此法中由于加入Folin酚試劑強(qiáng)化了雙縮脲反應(yīng)，增加顯色量，靈敏度為雙縮脲法的100倍。Folin酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。21第21頁(yè)，共31頁(yè)。Folin酚試劑法（Lowry法）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。缺點(diǎn)：1.費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間（顯色隨時(shí)間不斷加深）；2.標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的

13、直線形式，干擾物質(zhì)較多。由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5g。通常測(cè)定范圍是20250g 。22第22頁(yè)，共31頁(yè)。Folin酚試劑法（Lowry法）注意：對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。如酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素、硫酸納、硝酸納、三氯乙酸、乙醇、乙醚、丙酮等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必

14、須作校正曲線。測(cè)定時(shí)，加Folin-酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性條件下穩(wěn)定，上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。23第23頁(yè)，共31頁(yè)。（三）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。24第24頁(yè)，共31頁(yè)。實(shí)驗(yàn)原理：考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置(

15、max),由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸和賴(lài)氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。 在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。25考馬斯亮蘭G-250第25頁(yè)，共31頁(yè)?？捡R斯亮藍(lán)法（Bradford法）優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1g。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。2.測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約2分鐘即可完成，其顏色可以

16、在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。3.干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K、Na、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇等均不干擾此測(cè)定法。26第26頁(yè)，共31頁(yè)。考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）缺點(diǎn)：1.由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。2.仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，如：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）等。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。 校正：0.05mg /ml BSA溶液的A595約為0.29。27第27頁(yè)，共31頁(yè)。（四）二奎琳甲酸法BCA( bicinchoninic acid)法原理

17、：Bicinchoninic acid (BCA)法是近來(lái)廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。28BCA第28頁(yè)，共31頁(yè)。與Lowery法相比，BCA蛋白測(cè)定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳,并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。29第29頁(yè)，共31頁(yè)。BCA( bicinchoninic acid)法特點(diǎn)1. 操作簡(jiǎn)單

18、，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowery法快4倍且更加方便. 2. 準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200g/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10g/ml。3. 經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；4. 抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無(wú)影響；30第30頁(yè)，共31頁(yè)。方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說(shuō)明凱氏定氮法（Kjedahl法）靈敏度低，適用于0.2 1.0mg氮，誤差為 2費(fèi)時(shí)810小時(shí)將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)紫外吸收法較為靈敏50100mg，比色杯的最小測(cè)量體積為0.1ml快速510分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測(cè)；核酸的吸收可以校正；不消耗樣品，測(cè)定后樣品仍能回收利用雙縮脲法（Biuret法）靈敏度低120mg中速2030分鐘多肽鍵堿性Cu2生成紫色絡(luò)合物硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似Folin酚試劑法（Lowry法）靈敏度高15mg慢速4060分鐘雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)