在活體成像中熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的方法舉例

1、本實驗技術(shù)來源于SciMall科學(xué)在線在活體成像中熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的方法舉例活體光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)技術(shù)與熒光(fluores cence)技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，今天，生物發(fā)光標(biāo)記物可以標(biāo)記 到任何一種基因上，使對基因功能的全面細(xì)致研究成為現(xiàn)實。而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團(GFP、RF P, Cyt及dyes等)進行標(biāo)記，利用熒光蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測 信號。研究人員能夠利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的

2、細(xì)胞活動和基因行為。該技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記細(xì)胞或基因的示蹤及檢測；基因治療在活體動物體內(nèi)直接的觀察和檢測； 基因組、蛋白組學(xué)、藥學(xué)及生物技術(shù)在活體動物內(nèi)的研究；藥物及化學(xué)合成藥物的藥物代謝及毒理學(xué)監(jiān)測； 食品菌落生長成像；皮膚醫(yī)學(xué)中皮膚疾病的體內(nèi)成像；法醫(yī)鑒定；微孔板成像，例如：免疫分析、報告基 因、基因探針和嗜菌作用分析等；熒光團的體內(nèi)成像，例如：Alzheimer疾病研究中結(jié)合嗪的伊淀粉沉淀 物分析；轉(zhuǎn)基因植物中通過報告基因?qū)ι碇芷诠?jié)奏的研究；凝膠成像分析等等。但在研究過程中，研究者們必須事先用基因技術(shù)進行熒光素酶基因標(biāo)記，或者某種熒光報告基團標(biāo)記。目前活體光學(xué)成像系統(tǒng)的知名制造商，如

3、Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health 等，不僅為客戶提供先進的儀器，也提供具體實驗所需的整套解決方案，包括試劑、實驗手冊、特殊用途 的質(zhì)粒、細(xì)胞株、轉(zhuǎn)基因動物、細(xì)胞處理和動物處理設(shè)施等配套技術(shù)支持。出色的多任務(wù)處理能力，人性 化的整體設(shè)計，便捷精確的操作系統(tǒng)，使實驗室影像分析領(lǐng)域進入了一個全新的時代下面以研究干細(xì)胞活體移植后的存活率為例，簡介一兩種內(nèi)源性熒光色素標(biāo)記的實驗方法，以供參考。一、用熒光色素DiD標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞先用胰蛋白酶消化待標(biāo)記材料，使之成為一定密度的懸浮液；從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出間充質(zhì)干細(xì)胞，吸取含原有培養(yǎng)基的細(xì)胞懸

4、浮液進行標(biāo)記；用10 ml Mg/Ca-free PBS (不含鈣鎂離子的磷酸緩沖液)清洗細(xì)胞，吸去PBS，鈣鎂離子會影響胰蛋白酶的活性，必須小心；加入預(yù)熱的0.05%胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶為例，每瓶加5ml,確保瓶的表面被完全覆蓋；在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 C孵育約5分鐘；然后在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞已經(jīng)完全分散，如果有細(xì)胞貼壁情況，輕拍若干次或延長孵育時間直至酶解消化完全成功；加入等量含10% FCS的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶；用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散；然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；400 RCF離心5分鐘；小心移去上清液，不要擾動細(xì)胞；將細(xì)胞重新懸浮于DMEM

5、并進行計數(shù)；需要待標(biāo)記細(xì)胞在無血清DMEM溶液中的密度應(yīng)為1x106 /ml ；每ml細(xì)胞懸浮液加入5 rL DiD染色液；用移液器將染色液與細(xì)胞懸浮液混合均勻；在6孔低附著性細(xì)胞板上37 C孵育20分鐘；孵育完全后移取細(xì)胞懸浮液至15ml已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；400 RCF離心5分鐘；小心移去染色液，不要擾動細(xì)胞；用PBS清洗細(xì)胞，用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散；重復(fù)洗三次；細(xì)胞重新計數(shù)并用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性；可以進行活細(xì)胞成像了！二、用熒光色素ICG標(biāo)記 人胚胎干細(xì)胞必須先準(zhǔn)備好吲哚菁綠溶液（血容量、心輸出量、肝功能測定劑）作為對照品，然后使之與轉(zhuǎn)染試劑 魚精蛋白（抗凝血

6、作用）混合；測出1ml吲哚菁綠溶液的活力，然后在100 rL DMSO中溶解ICG；向混合物中加入400 rL Dulbecco的改良Eagles培養(yǎng)基（DMEM + 10%胎牛血清），震蕩均勻，吲哚菁 綠溶液終濃度為2mg/ml；加入轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白，魚精蛋白作為對照品的載體，使之能夠有效進入細(xì)胞；在300 rL ICG和300 rL無血清Dulbecco改良Eagles培養(yǎng)基中混入5 rL硫酸魚精蛋白溶液，使之終 濃度為10mg/ml,；震蕩5分鐘使之形成復(fù)合物，標(biāo)記溶液制備完畢；從hESC 10mm Petri培養(yǎng)皿中移去原有培養(yǎng)基；加入5ml預(yù)熱的DMEM；加入制備好的魚精蛋白/ICG

7、溶液，37 C下孵育1h；孵育完全后移去染色液；用5 ml PBS漂洗培養(yǎng)皿以清除染色液；移去PBS再加入5ml 0.25 %胰蛋白酶液，37 C下孵育5分鐘使之酶解，適當(dāng)震搖培養(yǎng)皿效果會更好;用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散；加入等量含10% KSR的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶；然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中，400 RCF離心5分鐘；在全培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞；如果還有細(xì)胞團塊，可以移去原有培養(yǎng)基用10ml預(yù)熱的全ESC培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，重復(fù)酶解再離心；在這一點上，鼠源飼喂細(xì)胞需從hESCs中分離；然后將細(xì)胞懸浮液移至涂布瓊脂的10 cm培養(yǎng)皿中；37 C孵育45分鐘，注意不要晃動培養(yǎng)皿，如此鼠源飼喂細(xì)胞會貼壁而干細(xì)胞保持懸浮；從Petri培養(yǎng)皿中移出已標(biāo)記的單細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞懸浮液；細(xì)胞重新計數(shù)并用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性；可進行活細(xì)胞成像