原代細胞的培養(yǎng)與鑒定方法

1、1、大鼠骨髓來源肥大細胞原代培養(yǎng)并鑒定：脫頸法處死SD大鼠（體重約200g）, 75%酒精浸泡消毒3min。轉入超凈工 作臺內操作，剪開后肢皮膚，去除腿部肌肉，暴露出股骨，盡可能將股骨外部肌 肉剝離干凈，剪下股骨。剪去股骨兩端的股骨頭，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基礎培養(yǎng)基后將骨髓吹打出來，吹打過程中盡可能將骨髓沖洗干凈。使用 巴氏吸管將骨髓吹打成單細胞懸液，1000rmp/min離心5min收集細胞如發(fā)現(xiàn)收 集的細胞中有大量紅細胞時需使用紅細胞裂解液處理。使用肥大細胞專用培養(yǎng)基 重懸細胞，接種至T25瓶內培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每2-3天換液一次，當發(fā)現(xiàn)有細胞 變圓脫落時，收集脫落細胞至新

2、的T25瓶內誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)四周時肥大細胞誘 導成熟，取成熟的肥大細胞進行甲苯胺藍染色鑒定;取脫落細胞培養(yǎng)一周、二周、 三周、四周的細胞培養(yǎng)上清進行組胺含量檢測。2、小鼠骨髓來源肥大細胞原代培養(yǎng)與鑒定：小鼠經脫頸椎處死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取無 菌PBS從股骨一端刺入，將骨髓細胞洗出，直到骨髓腔變白。離心收集細胞， 加入3mL紅細胞裂解液，室溫裂解3min之后，用PBS漂洗2次。采用現(xiàn)配的 原代細胞培養(yǎng)工作液（含青、鏈霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL， SCF 10ng/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)液）將細胞重懸，按照106個/m

3、L接種 于六孔板中，每孔加3mL培養(yǎng)液，置于37C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每7d 將懸浮細胞按照106個/mL轉移到新的培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)，4-6周細胞分化成 熟。四周后收集懸浮細胞，部分細胞用于流式檢測純度，部分用含10% FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)基重新接板。純度檢測：向誘導分化細胞中按1： 200加入 肥 大 細 胞表面 標志物APC-CD117，F(xiàn)ITC- FceRI，o4C孵育60min，無菌PBS 漂洗3次，流式檢測肥大細胞純度。（SCF： Stem cell factor，干細胞因子；又稱肥大細胞生長因子 MGF）3、大鼠腹腔肥大細胞的分離與培養(yǎng)：選用體重220-25

4、0g的SD大鼠。頸椎脫臼法處死，置于75%酒精中浸泡約2min后取出，在無菌超凈臺內完成后續(xù)操作。無菌注射器向腹腔內注射15 MlRPMI 1640培養(yǎng)基（含10U/mL肝素）,輕柔按摩大鼠腹部約90s；打開腹腔，盡可能多地抽取腹腔液與50 mL離心管，4C, 150g，離心10min,棄去上清；PBS 清洗，用200目篩網過濾收集細胞，4C, 150g，離心10min，棄去上清，PBS 重懸細胞；配制90% Percoll溶液，將細胞懸液與90% Percoll溶液（淋巴細胞分 離液）按1： 4的比例充分混合，后在其上輕輕覆蓋1mLPBS，4C，150g，離 心25min，棄去上清；PBS清

5、洗2次，4C，150g，離心6min；將細胞重懸于含 10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基（加入1%青霉素、鏈霉素），接種于細胞培養(yǎng)皿中，置于5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。肥大細胞表面標志物APC-CD117，F(xiàn)ITC- FcsRIa，4C孵育 60min，無菌 PBS 漂洗 3 次，流式檢測 肥大細胞純度。（肥大細胞的激活：C48/80刺激細胞脫顆粒，20pg/mL； IgE刺激細胞脫顆粒，1g/mL Purifird Rat IgE。文獻：溫度對大鼠腹腔肥大細胞和RBL-2H3細胞活力和功能的影響。）4、小鼠BMSCs的原代培養(yǎng)與鑒定脫頸法處死C57小鼠，在75%乙醇中浸泡5

6、min，轉移至超凈工作臺中，無菌 條件下分離出小鼠的長骨（股骨和脛骨），浸泡于PBS溶液中。對股骨和脛骨進行 深層次解剖，去除附著的肌肉組織，剪掉長骨兩端的十骺端，用10%FBS，DMDM 培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白，收集洗滌液，用移液槍輕輕吹散分離 為單個細胞。細胞接種于六孔板中培養(yǎng)，輕微搖勻，使細胞在孔中均勻分布，放 置于37C、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使BMSCs充分貼壁。培養(yǎng)48h后換液，用 預熱的PBS緩沖液輕輕洗滌細胞2次，添加新鮮培養(yǎng)基，之后每隔48h換液1次， 原代培養(yǎng)至細胞鋪滿80 %進行傳代培養(yǎng)。待原代細胞傳代至P3代時，進行成脂、成骨誘導分化，流式標記對BM

7、SCs 進行鑒定。BMSCs成脂誘導分化：、對照組：BMSCs不作處理、成脂組：BMSCs+成脂誘導劑上述兩個實驗組，每組三個重復孔，BMSCs鋪于六孔板（細胞爬片），細 胞融合達80%以上后，棄去原培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，成脂組加入成脂誘導劑 （成脂肪誘導劑成分為10 -6 mol/L地塞米松+ 5x10 -4 mol/L IBMX+ 2x10 -4 mol/L 吲噪美辛+10四g/ml胰島素）3d換液1次，分化18d。待脂滴形成后，PBS緩沖液清 洗3次，10%中性甲醛固定10min，再用PBS緩沖液清洗2次，進行油紅O染色，拍 照記錄。BMSCs成骨誘導分化：、對照組：BMSCs不作處理

8、、成骨組：BMSCs+成骨誘導劑上述兩個實驗組，每組三個重復孔，BMSCs鋪于六孔板（細胞爬片），細 胞融合達80%以上后，棄去原培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，成骨組加入成骨誘導劑 （成骨誘導劑成分為10-8mol/L地塞米松+50四g/ml維生素C+ 10mmol/L。-甘油磷 酸鈉）。3d換液1次，分化21d，21d后用茜素紅染色，觀察結果并拍照。BMSCs成軟骨誘導分化：、對照組：BMSCs不作處理、成軟骨組：BMSCs+成軟骨誘導劑上述兩個實驗組，每組6個重復孔，每組3孔用于ICC，另3孔用于甲苯胺藍 染色。BMSCs鋪于六孔板（細胞爬片），細胞融合達80%以上后，棄去原培養(yǎng) 基，更換新鮮培

9、養(yǎng)基，成軟骨組加入成軟骨誘導劑（50四g/ml維生素C +100nmol/L 地塞米松+100四g/mL丙酮酸鈉+50mg/mL ITS +5.35四g/mL亞油酸+ 10ng/mLTGF-pi + 1.25ng/mL BSA），培養(yǎng)3周后進行II型膠原免疫組化（ICC）， 取另3孔進行甲苯胺藍染色。流式細胞儀鑒定：收集P3代生長狀態(tài)良好的細胞，用PBS （含1% BSA）清洗細胞3次，計數細 胞，重懸細胞后流式檢測表面標記CD34、CD29、CD45、CD90的表達情況。5、大鼠PMVEC細胞的原代培養(yǎng)與鑒定：取成年SD大鼠（體重約200g），靜脈注射麻醉同時注入肝素鈉，麻醉成功 后用體積分

10、數75%乙醇浸泡全身（頭部以下）消毒5 min，將大鼠固定于超凈工作臺內，用外科剪、鑷逐層剪開胸腔，切下心肺并放入盛有含200IU/ml青霉素 和200ug/ml鏈霉素的D-Hanks液的培養(yǎng)皿內。用D-Hanks液沖洗心肺組織的血 跡，用眼科剪、鑷去除肺組織表面的臟層胸膜，剪取胸膜下肺組織，將組織剪碎，用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，接種T25瓶（需先用1%明膠進行包被）， 放入37C, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞穩(wěn)定貼壁后，更換使用ECM培養(yǎng)液 （微血管內皮細胞專用培養(yǎng)基、含內皮細胞生長因子，根據后續(xù)實驗約需3瓶， 500ml/瓶）進行篩選純化，根據細胞生長狀態(tài)每2-3d更換一次

11、培養(yǎng)液，細胞匯合 度達到85-90%時進行傳代。PMVEC細胞傳代至P3代時進行細胞細胞爬片，以 六孔板計，每孔接種5*105個細胞，待細胞爬滿玻片后，使用CD31抗體進行免 疫熒光鑒定，每個抗體檢測三孔，陽性細胞達到90%方可用于后續(xù)實驗。6、大鼠破骨細胞的原代培養(yǎng)：薄骨磨片的制備及處理：取新鮮成年牛股骨皮質（市售）-20 C貯存。臨用前 鋸成1 cm寬條后，用磨片機磨成厚50pm的Icmxlcm骨片，蒸餾水清洗10次， 置于75%的乙醇浸泡24 h,自然晾干，紫外線照射消毒骨片的兩面，放于DMEM 培養(yǎng)基中4C備用。玻片的制備：將玻片切成1 cmx1cm大小，泡酸過夜，自來水沖洗干凈，蒸

12、餾水洗3遍,，烤箱烤干，高壓消毒滅菌后備用。破骨細胞的分離培養(yǎng)：大鼠麻醉后斷頸處死，無菌取其四肢長骨，在磷酸鹽 緩沖液中盡可能去除附著在其表面的全部軟組織。將骨干置于DMEM培養(yǎng)基（10% 的胎牛血清，4 pmol/L谷氨酰胺）中，然后縱行剖開，刮骨髓腔及靠近干骺端處 內表面直至骨干成為極微小的碎片，300目篩網過濾，吸管反復吹洗篩網上殘渣， 吸取濾過懸液，置入離心管內，4 C 1 000 r/min離心10 min，棄上清，加4mL DMEM培養(yǎng)基吹打均勻，接種于24孔板，24孔板內分別放置制備的玻片和骨 片，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后（時間根據細胞生長狀況進行確定）進行 TRAP染色與

13、噬骨能力檢測，對細胞進行鑒定，每個指標檢測三個重復。（取蓋 玻片進行TRAP染色，取培養(yǎng)液中的骨片檢測噬骨能力檢測，用掃描電鏡觀察骨 片上的陷凹情況，以判定噬骨能力）7、大鼠血管內皮細胞的原代培養(yǎng)：SD大鼠除頭部以外浸入75%的乙醇殺菌，隨后移入無菌操作臺，剖開胸腹 腔，取胸主動脈，置于預冷的無菌PBS液，去掉外結締組織，反復重洗管腔，清 除殘留的血細胞。清除細小的動脈分支，更換培養(yǎng)皿與PBS，將動脈一端輕輕提起，注意不損傷到內膜。將動脈剪成厚度約為1.5mm的動脈環(huán)，將動脈環(huán)移入T25 培養(yǎng)瓶、每瓶接種15-20個動脈環(huán)，加入DMEM培養(yǎng)基（20%FBS、青鏈霉素）， 使培養(yǎng)液剛剛沒過動脈環(huán)

14、，動脈環(huán)需均勻分布于瓶底，將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱內靜置 培養(yǎng)60小時，棄去動脈環(huán)。更換新鮮培養(yǎng)液，根據細胞生長狀態(tài)每2-3d更換一次 培養(yǎng)液，細胞匯合度達到85-90%時進行傳代。細胞傳代至P3代時進行細胞細胞 爬片，以六孔板計，每孔接種5*105個細胞，待細胞爬滿玻片后，使用Factor VIII （vwf）抗體、CD31抗體進行免疫熒光鑒定，每個抗體檢測三孔，陽性細胞達到 90%方可用于后續(xù)實驗。（與主動脈內皮細胞培養(yǎng)方法一致）8、大鼠主動脈平滑肌細胞原代培養(yǎng)與鑒定：SD大鼠經頸椎脫臼致死,75%乙醇浸泡消毒3min，固定后依次剪開胸腹部皮 膚，肌肉及胸骨，暴露胸腔，緊靠脊柱右前方，從主動脈弓至

15、膈面處剪下胸主動脈，并 放入盛有PBS緩沖液的細胞培養(yǎng)皿中，迅速轉入細胞培養(yǎng)室的超凈工作臺。眼科直 鑷和彎鑷去除血凝塊和血管外膜層，然后轉移入另一盛有PBS緩沖液的細胞培養(yǎng) 皿中,剪去血管外的小分支。再轉移入含20%胎牛血清和DMEM混合液的細胞培 養(yǎng)皿中,眼科直剪剪開血管腔，內膜面向上，以眼科彎鑷或手術刀片輕輕擦拭內膜 層，以去除內皮細胞。最后轉移入另一含20%胎牛血清和DMEM混合液的細胞培 養(yǎng)皿中，用眼科剪將血管段剪成1mm X 1mm大小的組織塊，用吸管把組織塊轉入 T25細胞培養(yǎng)瓶中，并均勻貼壁于培養(yǎng)瓶底面，組織塊的間距為0.5cm。蓋好瓶蓋， 輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上，并向瓶內注

16、入適量20%胎牛血清和DMEM混合液以 及相應比例的青鏈霉素混合液，置于37C，5% CO2培養(yǎng)箱內放置35h，使得組織 塊干涸，并與瓶底貼附，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉平放,使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù) 靜置3天，切勿移動,45天會有細胞從組織塊周圍游離出，即可換液進行培養(yǎng)。細 胞傳代至P3代時進行細胞爬片，以六孔板計，每孔接種5x105個細胞，待細胞爬 滿玻片后，使用o-SM-actin抗體進行免疫熒光鑒定，每個抗體檢測三孔，陽性細 胞達到90%方可用于后續(xù)實驗9、人正常角質形成細胞與成纖維細胞原代培養(yǎng)：取健康兒童包皮環(huán)切手術后的殘余皮膚組織，經dispase酶消化后，分離表 皮與真皮、再經Typ

17、sin-EDTA （0.25%）分別消化，表皮消化后形成的角質形成 細胞接種于W型膠原包被過的細胞培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)（角質形成細胞專用培養(yǎng)基，Keratinocyte Medium-defined），真皮消化后形成的成纖維細胞接種于Fibroblast Medium serum free 培養(yǎng)基（成纖維細胞專用培養(yǎng)基）中進行培養(yǎng)。傳代至 P5代時，進行免疫熒光鑒定，其中原代培養(yǎng)的角質形成細胞用pan-Cytokeratin 抗體進行鑒定，成纖維細胞用vimentin與cytokeratin15抗體進行鑒定。10、臍帶血間充質干細胞的原代培養(yǎng)與鑒定：臍帶血間充質十細胞的分離培養(yǎng)：從胎盤臍靜脈穿

18、刺抽取15 mL臍帶血，肝 素抗凝，加等量磷酸緩沖液稀釋，取 50 mL離心管，先加入 15 mL密度 1.077g/mL的Percoll梯度分離液，小心加入稀釋后的臍帶血，2 000 r/min離心 25 min后，用吸管吸取分層界面的白色環(huán)形絮狀物（富含單個核細胞），800 r/min 離心洗滌2次，5min/次，沉積細胞用含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基懸浮，調整細胞密度為1X109/L，接種于25 T的培養(yǎng) 瓶內，放置在37C、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育72 h后更 換培養(yǎng)基，去除紅細胞及其他未貼壁細胞，以后視

19、細胞生長情況平均三四天換液 1次。BMSCs成脂誘導分化：、對照組：BMSCs不作處理、成脂組：BMSCs+成脂誘導劑上述兩個實驗組，每組三個重復孔，BMSCs鋪于六孔板（細胞爬片），細 胞融合達80%以上后，棄去原培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，成脂組加入成脂誘導劑 （成脂肪誘導劑成分為10 -6 mol/L地塞米松+ 5x10 -4 mol/L IBMX+ 2x10 -4 mol/L 吲噪美辛+10g/m胰島素）3d換液1次，分化18d。待脂滴形成后，PBS緩沖液清 洗3次，10%中性甲醛固定10min，再用PBS緩沖液清洗2次，進行油紅O染色，拍 照記錄。BMSCs成骨誘導分化：、對照組：BMS

20、Cs不作處理、成骨組：BMSCs+成骨誘導劑上述兩個實驗組，每組三個重復孔，BMSCs鋪于六孔板（細胞爬片），細 胞融合達80%以上后，棄去原培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，成骨組加入成骨誘導劑 （成骨誘導劑成分為10-8mol/L地塞米松+50四g/ml維生素C+ 10mmol/L。-甘油磷 酸鈉）。3d換液1次，分化21d，21d后用茜素紅染色，觀察結果并拍照。BMSCs成軟骨誘導分化：、對照組：BMSCs不作處理、成軟骨組：BMSCs+成軟骨誘導劑上述兩個實驗組，每組6個重復孔，每組3孔用于ICC，另3孔用于甲苯胺藍 染色。BMSCs鋪于六孔板（細胞爬片），細胞融合達80%以上后，棄去原培養(yǎng) 基

21、，更換新鮮培養(yǎng)基，成軟骨組加入成軟骨誘導劑（50四g/ml維生素C +100nmol/L 地塞米松+100四g/mL丙酮酸鈉+50mg/mL ITS +5.35四g/mL亞油酸+ 10ng/mLTGF-pi + 1.25ng/mL BSA），培養(yǎng)3周后進行II型膠原免疫組化（ICC）， 取另3孔進行甲苯胺藍染色。（參考文獻：人臍帶血間充質干細胞分離培養(yǎng)及向軟骨細胞的分化）11、人黑素細胞的原代培養(yǎng)與鑒定取健康兒童包皮環(huán)切術標本，經75%乙醇浸泡10min后，用含高濃度青霉素/ 鏈霉素的生理鹽水反復沖洗，剪去皮下組織，修剪為5mmX10mm的細條。用 Dispase II酶37 C消化12h，分離表、真皮。獲取的表皮加入0.1%胰酶（含 0.53mmol/L EDT