免疫分析技術(shù)基本原理

1、 WORD 10/10免疫分析技術(shù)基本原理利用抗原、抗體之間的特異性結(jié)合來測定、分析特定物質(zhì)的方法抗原：可誘導(dǎo)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)。按其引起免疫應(yīng)答的能力分半抗原、抗原、超抗原?？贵w：由動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可特異性結(jié)合某種物質(zhì)的免疫球蛋白。分IgG、 IgM、 IgE、 IgA、 IgD五個(gè)亞型。不同亞型針對同一抗原表位的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)一樣。不同亞型出現(xiàn)的先后順序不同，在血清中的含量不同，在機(jī)體中出現(xiàn)的地點(diǎn)不同。 抗原抗體反應(yīng)的特性1可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAb抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=A

2、gAbAgAb ,AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性2特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。最適比例4敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平。酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10g/ml。免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平。例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。固相免疫測定的原理基礎(chǔ):抗原或抗

3、體的固相化與抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。雙抗體夾心法原理此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。雙抗原夾心法原理用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。間接法原理間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗

4、抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。競爭法的原理小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。俘獲法原理IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。生物素親合素法：固相支持物；：固相化抗原；：特異性IgG（待檢物）；：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）

5、；：辣根過氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；：底物與顯色劑；：顯色。陽性/假陽性陽性（positive, P）：在給定的某一判定標(biāo)準(zhǔn)下，某一測量結(jié)果符合存在條件的稱為陽性。例如ELISA實(shí)驗(yàn)中規(guī)定，標(biāo)本的測量結(jié)果大于界值判定為陽性。假陽性：真實(shí)結(jié)果不滿足存在的條件，由于某些因素的干擾，導(dǎo)致測量結(jié)果滿足存在條件的稱為假陽性。在表述陽性或者假陽性時(shí)，測量方法、測量對象和適用圍一定要具體。例如，我們經(jīng)常說某人HCV陽性，嚴(yán)格的說這是一個(gè)不規(guī)的說法。因?yàn)榭梢岳斫鉃檫@么多的意思：此人是丙肝患者；此人HCV抗原陽性；此人HCV抗體陽性（可能是患者也可能不是患者）；此人HCV RNA陽性；等等等

6、等。陰性/假陰性陰性（Negtive,N）：在給定的某一判定標(biāo)準(zhǔn)下，某一結(jié)果不符合存在條件的稱為陽性。假陰性：真實(shí)結(jié)果滿足存在的條件，由于某些因素的干擾，導(dǎo)致測量結(jié)果不滿足存在條件的稱為假陰性。在表述陰性和假陰性時(shí)，和表述陽性/假陽性一樣，測量方法、測量對象和適用圍一定要具體。樣本/標(biāo)本/臨床標(biāo)本樣本：在統(tǒng)計(jì)里, 我們把所要考察對象的全體叫做總體, 其中每一個(gè)考察對象叫做個(gè)體, 從整體中所抽取的一部分個(gè)體叫做總體的一個(gè)樣本。樣本是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)的概念，樣本往往不只包含一個(gè)個(gè)體。標(biāo)本（Sample, S）：在給定的考察或測量方法中的具體測量對象，往往和統(tǒng)計(jì)學(xué)的個(gè)體等價(jià)。例如在ELISA實(shí)驗(yàn)里，HCG

7、有測血樣的也有測尿樣的，對應(yīng)的血樣或尿樣叫這個(gè)測量方法的標(biāo)本。臨床標(biāo)本：在檢驗(yàn)技術(shù)中，直接從機(jī)體采集的，經(jīng)過處理而適用于臨床檢驗(yàn)的標(biāo)本。例如從人體采集的抗凝血清叫臨床標(biāo)本，而經(jīng)過稀釋或濃縮的標(biāo)本只能稱為稀釋標(biāo)本或濃縮標(biāo)本而不能稱之為臨床標(biāo)本。醫(yī)學(xué)決定水平醫(yī)學(xué)決定水平（Medicinedecidelevel, MDL）：是指不同于參考值的另一些限值，通過觀察測定值是否高于或低于這些限值，可在疾病診斷中起排除或確認(rèn)的作用，或?qū)δ承┘膊∵M(jìn)行分級或分類，或?qū)︻A(yù)后作出估計(jì)，以提示醫(yī)師在臨床上應(yīng)采取何種處理方式，如進(jìn)一步進(jìn)行某一方面的檢查，或決定采取某種治療措施等等。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步，某一檢測指標(biāo)檢測靈

8、敏度的提高，臨床意義的改變，往往能改變某一疾病的醫(yī)學(xué)決定水平。例如某些激素項(xiàng)目的超敏試劑盒能幫助醫(yī)師判定疾病的進(jìn)程與處理對策。金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)：現(xiàn)有條件下最科學(xué)最準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)。在檢驗(yàn)學(xué)中指的是某種疾病標(biāo)志物的確證實(shí)驗(yàn)。如菌體培養(yǎng)，組織切片，組織活檢，抗體條帶免疫印跡（WB），核算診斷等等。 ELISA方法往往只檢驗(yàn)?zāi)撤N疾病眾多表征或標(biāo)志物中最具代表性或最具操作性的一種或幾種，即通常所說的初篩實(shí)驗(yàn)，追求的是靈敏、簡便和快速，而這些表征或標(biāo)志物的檢出不能確證患病與否，所以需要更進(jìn)一步的確證實(shí)驗(yàn)。對照實(shí)驗(yàn)對照實(shí)驗(yàn)（control experiment ）：一般進(jìn)行某種試驗(yàn)以闡明一定因于對一個(gè)對象的影響和處

9、理效應(yīng)或其意義時(shí)，除了對試驗(yàn)所要求研究的因子或操作處理外，其他因素都保持一致，并把試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較，這種試驗(yàn)稱為對照試驗(yàn)。目的是通過對比實(shí)驗(yàn)的結(jié)果找到想要研究的因素對實(shí)驗(yàn)的影響作用，從而為科學(xué)的研究提供事實(shí)依據(jù)和直接證據(jù)。對照試驗(yàn)有對照組和實(shí)驗(yàn)組。有以下常見的類型：1.空白對照：即不作任何實(shí)驗(yàn)處理的對照組。2.自身對照：即實(shí)驗(yàn)與對照在同一對象上進(jìn)行，不另設(shè)對照組（通常意義上的重復(fù)）。3.條件對照：即給對象施以某種實(shí)驗(yàn)處理，但這種處理不是實(shí)驗(yàn)假設(shè)所給定的實(shí)驗(yàn)變量。例如我們通常在進(jìn)行配方改進(jìn)的時(shí)候，所改變的條件相對于原來的配方來說就屬于條件按對照?？瞻祝╞lank,BL）空白實(shí)驗(yàn)（blank t

10、est）和空白樣品：空白試驗(yàn)指對不含待測物質(zhì)的樣品用與實(shí)際樣品同樣的操作進(jìn)行的試驗(yàn)。對應(yīng)的樣品稱為空白樣品（簡稱：空白）。現(xiàn)場空白和實(shí)驗(yàn)室空白：現(xiàn)場空白指帶到監(jiān)測現(xiàn)場而模擬現(xiàn)場監(jiān)測過程的空白樣品。實(shí)驗(yàn)室空白指沒有帶到監(jiān)測現(xiàn)場的空白樣品。標(biāo)準(zhǔn)空白、試劑空白和全程空白：標(biāo)準(zhǔn)空白是指配標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)準(zhǔn)系列溶液）時(shí)“零”濃度的空白，或不添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的空白。試劑空白是指隨同試樣分析步驟的空白樣品。全程空白即全程試劑空白，是指經(jīng)歷試樣分析全部步驟的空白樣品。本底/非特異結(jié)合本底（background ）：亦稱背景，指某一測量方法中陰性樣本的信號值或計(jì)數(shù)值。非特異結(jié)合（nonspecific bind, NS

11、B）：由非待檢物產(chǎn)生的有用檢測信號。表現(xiàn)形式為高本底陰性或陽性。CO值CO值（Cut Off Value, CO）：界值或陽性判定值，指某儀測量方法中用于區(qū)分陽性和陰性的數(shù)值。有兩種判斷方式：一種是大于CO值判為陽性，否則為陰性，常見于ELISA實(shí)驗(yàn)中除競爭抑制法以外的方法，判斷方法較為直觀；另一種是小于CO值判為陽性，否則為陰性，常見于ELISA實(shí)驗(yàn)中的競爭抑制法，判斷方法不直觀，要求測量方法穩(wěn)定且重復(fù)性好。CO值的計(jì)算方式：往往以某一常數(shù)加上或乘以一個(gè)變量，變量的變動圍較小，常數(shù)反映本底信號，變量反映多次測量之間的差異。例如，我公司HIV試劑盒CO值計(jì)算公式：CO=NC+0.1（NC0.0

12、5時(shí)按照0.05計(jì)算）。CO值的設(shè)定：通常采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，即測量大量的陰性樣本，測量結(jié)果呈正態(tài)分布，取95%或99%為置信區(qū)，取置信區(qū)上線為CO值。S/CO值或P/N值S/CO值：即樣本值和界值的比值，相當(dāng)于一個(gè)半定量的判斷。在ELISA檢驗(yàn)中，S/CO值的判斷方法比將樣本值和CO值直接比較更具科學(xué)性，在不同廠家試劑對比實(shí)驗(yàn)時(shí)往往用S/CO值而不是OD值。做長期動態(tài)的觀察時(shí)（例如做質(zhì)控圖），用絕對的OD值做質(zhì)控圖不能準(zhǔn)確的反映實(shí)驗(yàn)環(huán)境給實(shí)驗(yàn)帶來的影響，而S/CO值則能盡量的減小這種影響。P/N值：有兩種說法，一種是標(biāo)本值和陰性對照的比值，是早期采用的定性判斷方法；另一種是患者測量值（陽性

13、值）和正常人測量值（陰性值）的比值。第二個(gè)個(gè)概念比較有用，它反應(yīng)的是試劑的陰陽反差，即有用信號和背景信號的區(qū)分能力，一定程度上體現(xiàn)了試劑靈敏度的高低。校準(zhǔn)品/標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品：1、國際標(biāo)準(zhǔn)品：由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的，用肯定的、公認(rèn)的、準(zhǔn)確的物理或化學(xué)方法測定的定值材料。如FDA的標(biāo)準(zhǔn)品。2、國際生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品：根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的國際活性單位的材料。3、參考標(biāo)準(zhǔn)血清：國家標(biāo)準(zhǔn)化組織根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的法定材料?？捎糜阼b定儀器和鑒定方法準(zhǔn)確性。如HBsAg的國家標(biāo)準(zhǔn)血清盤。校準(zhǔn)品：使測量值具有可比性的對照物質(zhì)。對于測量血清標(biāo)本的檢驗(yàn)手段來說，最佳的校準(zhǔn)品應(yīng)該是用決定性方法定值的

14、新鮮混合血清。校準(zhǔn)品具有系統(tǒng)專一性，不同系統(tǒng)的校準(zhǔn)品不能混用（例如不同廠家或者不同批次的“標(biāo)準(zhǔn)品”不能替換使用）。我們定量產(chǎn)品常所說的標(biāo)準(zhǔn)品嚴(yán)格以上來說應(yīng)當(dāng)叫校準(zhǔn)品，校準(zhǔn)品往上溯源才是標(biāo)準(zhǔn)品。 ISO17511對控制品有較為詳細(xì)的說明。質(zhì)控品/控品質(zhì)控品（control）：是已有靶值的對照物質(zhì)，在每次的常規(guī)檢驗(yàn)中加入一份或數(shù)份，通過所得結(jié)果來了解本次檢驗(yàn)的情況。質(zhì)控品檢驗(yàn)的結(jié)果如能控制其誤差在一定圍，就說明該檢驗(yàn)沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過允許誤差圍的異常結(jié)果，提示該檢驗(yàn)不合格，應(yīng)尋找原因，糾正后，重檢待測標(biāo)本。IVD行業(yè)中，通常使用的質(zhì)控品有衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（NCCL）提供的定值質(zhì)控

15、品。在臨床實(shí)驗(yàn)室中，經(jīng)常使用各省疾控中心（CDC）發(fā)放的定值質(zhì)控品。各臨床實(shí)驗(yàn)室每年還在第三方（通常由各省的相關(guān)領(lǐng)導(dǎo)部門擔(dān)任）的組織下進(jìn)行室間質(zhì)評，以評價(jià)實(shí)驗(yàn)室的總體檢驗(yàn)水平。控品：由實(shí)驗(yàn)室參照權(quán)威機(jī)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品自己標(biāo)定的對照物質(zhì)，用于控制本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)誤差。質(zhì)控品和控品都要保證其溯源性！成品成品：通俗來說就是符合客戶要求和滿足法律法規(guī)要求，可以直接交貨或售賣的產(chǎn)品。比如試組裝完畢、檢驗(yàn)合格，貼上合格簽的試劑盒。對于國家批批檢的產(chǎn)品，必須還要有國家相關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的合格檢驗(yàn)報(bào)告，并經(jīng)過相關(guān)機(jī)構(gòu)做出合格標(biāo)示的試劑盒才能算成品試劑盒。成品與半成品是公司對生產(chǎn)流程的分類，可是對外，就沒有什么成品

16、和半成品之分了，如果客戶要買你的“半成品”，那么“半成品”也就變成你們的成品了，如果客戶不買你的“成品”，那么你的“成品”則連半成品也不是！所以我們一定要把東西賣出去。半成品/中間品半成品：通俗來說，品質(zhì)要求已達(dá)到客戶要求，但還需要經(jīng)過一道或幾道后序加工程序才能成為成品的產(chǎn)品，通常的后序加工程序指的是組裝。例如：檢驗(yàn)合格的包被板，分裝并檢驗(yàn)合格的酶結(jié)合物和標(biāo)準(zhǔn)品等。中間品：半成品生產(chǎn)過程中所處的合格的形態(tài)。例如：包被后檢驗(yàn)合格的包被板，分裝前檢驗(yàn)合格的酶結(jié)合物和標(biāo)準(zhǔn)品。無論是成品、半成品還是中間品，必須強(qiáng)調(diào)檢驗(yàn)合格的概念！質(zhì)量檢驗(yàn)質(zhì)量檢驗(yàn)：對產(chǎn)品的一個(gè)或多個(gè)質(zhì)量特性進(jìn)行觀察、測量、試驗(yàn)，并將結(jié)

17、果和規(guī)定的質(zhì)量要求進(jìn)行比較，以確定每項(xiàng)質(zhì)量特性合格情況的技術(shù)性檢查活動。質(zhì)量檢驗(yàn)的職能：鑒別、把關(guān)、預(yù)防、報(bào)告、監(jiān)督。質(zhì)量檢驗(yàn)的步驟(1)檢驗(yàn)的準(zhǔn)備。熟悉規(guī)定要求，選擇檢驗(yàn)方法，制定檢驗(yàn)規(guī)。在檢驗(yàn)的準(zhǔn)備階段，必要時(shí)要對檢驗(yàn)人員進(jìn)行相關(guān)知識和技能的培訓(xùn)和考核，確認(rèn)能否適應(yīng)檢驗(yàn)工作的需要。(2)測量或試驗(yàn)。按已確定的檢驗(yàn)方法和方案，對產(chǎn)品質(zhì)量特性進(jìn)行定量或定性的觀察、測量、試驗(yàn)，得到需要的量值和結(jié)果。測量和試驗(yàn)前后，檢驗(yàn)人員要確認(rèn)檢驗(yàn)儀器設(shè)備和被檢物品試樣狀態(tài)正常，保證測量和試驗(yàn)數(shù)據(jù)的正確、有效。(3)記錄。對測量的條件、測量得到的量值和觀察得到的技術(shù)狀態(tài)用規(guī)化的格式和要求予以記載或描述，作為客觀

18、的質(zhì)量證據(jù)保存下來。質(zhì)量檢驗(yàn)記錄是證實(shí)產(chǎn)品質(zhì)量的證據(jù)，因此數(shù)據(jù)要客觀、真實(shí)，字跡要清晰、整齊，不能隨意涂改，需要更改的要按規(guī)定程序和要求辦理。質(zhì)量檢驗(yàn)記錄不僅要記錄檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，還要記錄檢驗(yàn)日期、班次，由檢驗(yàn)人員簽名，便于質(zhì)量追溯，明確質(zhì)量責(zé)任。(4)比較和判定。由專職人員將檢驗(yàn)的結(jié)果與規(guī)定要求進(jìn)行對照比較，確定每一項(xiàng)質(zhì)量特性是否符合規(guī)定要求，從而判定被檢驗(yàn)的產(chǎn)品是否合格。質(zhì)量控制/質(zhì)量保證質(zhì)量控制（Quaility Control, Q.C）：質(zhì)量控制是監(jiān)視全過程，排除誤差，防止變化，維持標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀的一個(gè)管理過程。這一過程是通過一個(gè)反饋環(huán)路進(jìn)行的。1）確定控制的對象；2）規(guī)定控制對象的標(biāo)準(zhǔn)（預(yù)期

19、值）；3）制定或選擇控制方法和手段；3）測量實(shí)際數(shù)據(jù)；4）比較或較對實(shí)際數(shù)據(jù)與預(yù)期值之間的差異，并說明產(chǎn)生這一差異的原因。超出預(yù)定誤差圍，報(bào)警系發(fā)出信號，反饋通道中斷。5）采取行動，解決差異?；謴?fù)原狀（原標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)）的手段發(fā)揮作用。質(zhì)量保證（ quality assurance , Q.A ）：提供質(zhì)量要求會得到滿足的信任的一系列活動。質(zhì)量保證的關(guān)鍵詞是“提供信任”，提供信任的對象對可以是管理者，對外可以是顧客；“提供信任”的方法是需要提供能夠證實(shí)質(zhì)量要求會得到滿足的證據(jù)。 對或?qū)ν馓峁┊a(chǎn)品質(zhì)量保證文件、過程監(jiān)控記錄、質(zhì)量手冊或認(rèn)證證書，都可以作為“提供信任”的方法。基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)（matri

20、x effect）：基質(zhì)指的是樣品中被分析物以外的組分，基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)在兩個(gè)方面：1.標(biāo)本中除分析物以外的其他成分對分析物測定值的影響。2.基質(zhì)對分析方法準(zhǔn)確測定分析物的能力的干擾。廣義說來，基質(zhì)效應(yīng)也應(yīng)包括已知的干擾物（如Chol測定中膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸等都是干擾物），但目前只將基質(zhì)效應(yīng)限于生物材料中未知或未定性的物質(zhì)或因素（如粘度、pH等）的影響。基質(zhì)偏差（matrix bias）基質(zhì)效應(yīng)所致分析結(jié)果的偏差稱為基質(zhì)偏差。用作校準(zhǔn)物質(zhì)或質(zhì)控物的經(jīng)過處理的混合血清，由于血清基質(zhì)的理化性質(zhì)在處理過

21、程中的改變，在常規(guī)測定上往往出現(xiàn)基質(zhì)偏差?；|(zhì)偏差的出現(xiàn)也與分析系統(tǒng)（包括方法、試劑與所用儀器設(shè)備）有關(guān)，所以有人將基質(zhì)效應(yīng)定性為方法、材料與基質(zhì)的特異性反應(yīng)。國外已有不少文獻(xiàn)指出某些在制備過程中經(jīng)過加工或添加某些成分(如制備的LDL)的參考血清，會在某些分析系統(tǒng)中出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect)，而使標(biāo)本(新鮮血清)的分析結(jié)果出現(xiàn)明顯偏差。用新鮮血清為參考材料是最理想的，但顯然是不現(xiàn)實(shí)的，所以對參考材料的研制又提出了新的難題。Naito等（1993年）提出過減少基質(zhì)效應(yīng)的研究方向，至今仍有參考價(jià)值：改進(jìn)室間質(zhì)評樣品，使其作用更像新鮮人血清。改進(jìn)儀器設(shè)計(jì)與試劑組成。選擇方法與方法學(xué)參

22、數(shù)，使其適應(yīng)性更強(qiáng)，且容易掌握，對制備物（校準(zhǔn)物、室間質(zhì)評樣品與質(zhì)控物）基質(zhì)的確切性質(zhì)不敏感。HOOK效應(yīng)高值鉤鐮效應(yīng)（HD-HOOK） 在二位點(diǎn)夾心ELISA中，其劑量反應(yīng)曲線的高劑（HIGH DOSE，HD）區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀（HOOK），MILES（1974）根據(jù)此現(xiàn)象寫實(shí)性地稱之為“HD-HOOK”效應(yīng)。在一步法和兩步法中均有HOOK效應(yīng)一步夾心法HOOK效應(yīng)實(shí)際上是一種“濃度效應(yīng)”，待測物中抗原數(shù)量過高所致次要因素：標(biāo)記抗體與被捕捉抗原的交叉重疊結(jié)合而導(dǎo)致抗原變構(gòu)只要靶抗原的正常值與病理值之差大于3個(gè)數(shù)量級，均應(yīng)警示由于嚴(yán)重的“H

23、D-HOOK效應(yīng)”而發(fā)生的假陰性，假低值兩步夾心法HOOK效應(yīng)僅發(fā)現(xiàn)于少數(shù)具有多重抗原決定簇的大分子蛋白質(zhì)抗原如：SF、AFP、PSA、HCG等）。隨著雜交瘤單抗的問世，F(xiàn)emando等設(shè)計(jì)了一個(gè)堪稱現(xiàn)代經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ? 使這一課題的研究取得了突破性進(jìn)展。所選用的試驗(yàn)方法是二步IRMA,靶抗原是一個(gè)已知其WM為22kDa、 僅有 二個(gè)不同抗原簇的人生長因子(hGH)。一個(gè)單抗用于包被,另一 個(gè)作125I標(biāo)記 作二抗。用此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),測定單體hGH抗原時(shí),沒有發(fā)現(xiàn)“HD-HOOK效應(yīng)”問 題奇怪的是,用同樣實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),測定非共價(jià)結(jié)合的二聚體(D)-hGH則呈現(xiàn)了 “HD-HOOK效應(yīng)”。據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果

24、,推導(dǎo)出一個(gè)新理論:即標(biāo)記二抗介導(dǎo)被捕捉抗原分子發(fā)生分子變構(gòu)(Confromational change),使之形成標(biāo)記二抗與變構(gòu)的抗原分子復(fù)合物, 從固相一抗上解離, 最終產(chǎn)生反應(yīng)信號減低的“HD-HOOK”效應(yīng)。這種“抗原分子變構(gòu)理論”的核心是抗原的“質(zhì)”的問題。理論依據(jù)首先,大分子蛋白質(zhì)抗原的可變構(gòu)性是決定性的因。其中構(gòu)象性決定簇是幾條肽鏈(非連續(xù)性)提供的氨基酸組合而成的,比線性(連續(xù)性)決定簇的穩(wěn)定性差,易發(fā)生變構(gòu)(見圖2)。 其次,蛋白質(zhì)分子非共價(jià)結(jié)合鍵,也是發(fā)生分子變構(gòu)的在因素。從現(xiàn)有資料看,僅報(bào)道鐵蛋白、AFP、PSA與HCG等,具有多重決定蔟的大分子抗原,在二步法中產(chǎn)生“HD

25、-HOOK效應(yīng)”。小分子抗原則否。表明抗原“質(zhì)”的特性是關(guān)鍵性因素。其次,抗體分子是介導(dǎo)抗原分子變構(gòu)的重要外因。已知Igs分子在遇到相應(yīng)抗原時(shí),為了執(zhí)行其固有的(本質(zhì)性)生物學(xué)功能,其分子的Fab臂可圍繞鉸鏈區(qū),作變角折彎(100)、錐形轉(zhuǎn)動以與最N末端的可變區(qū),依托Fab的恒定區(qū)作微小的“球穴”擺動(見3)。 當(dāng)其與被捕捉抗原分子之間,發(fā)生交差重疊結(jié)合之后,由于“立體效應(yīng)(steric effect)”,加之標(biāo)記二抗的親和力大于一抗等輔助因素,是可以迫使已被捕捉的抗原分子從一抗上解離洗滌出去的。很可能與下列因素有關(guān)：包被-抗體親和力低洗滌不合適酶標(biāo)抗體不足過度孵育其他非特異性反應(yīng)窗口期窗口期

26、（window period）：病毒感染后病毒出現(xiàn)在血液中直到可以檢出足夠多的相應(yīng)病毒標(biāo)志物（抗原或抗體）前的時(shí)期。在這段時(shí)間，血清中無法檢測出相應(yīng)的抗原抗體標(biāo)志物。各種病毒的窗口期是不一樣的，一般所稱的窗口期指的是檢測到病毒抗體的時(shí)間，但抗原以與核酸檢測同樣存在窗口期，但時(shí)間大大縮短。H B V、H C V、H I V的窗口期的時(shí)間分別為56、70和22天，P24抗原的窗口期平均為15天，而應(yīng)用核酸技術(shù)，可分別將H B V、H C V、H I V的窗口期縮短為41、12、11天。由于檢測技術(shù)的局限，某種檢測結(jié)果為陰性并不意味著就沒有感染，因此定期復(fù)查是非常重要的。相信隨著檢測的病毒標(biāo)志物的不

27、同，檢測技術(shù)的提高，可大大縮短窗口期時(shí)間。心理窗口期還有一個(gè)很重要的“心理窗口期”。由于醫(yī)學(xué)上還沒有絕對明確的窗口期，有個(gè)別朋友甚至2年以后還在檢查，不知道他們還要在恐懼中多久才能找到回家的路！所以，每個(gè)人都應(yīng)該在深思熟慮后為自己確定一個(gè)明確的心理窗口期，也就是說，過了這個(gè)期限還是陰性就可以徹底放心，之后的任務(wù)就是如何恢復(fù)到以前的生理和心理狀態(tài)，回到自己以前的生活中去。潛伏期潛伏期（incubation period）是指病原體侵入機(jī)體到最初出現(xiàn)癥狀和體征之間的這段時(shí)期。各種疾病的潛伏期長短不一，短者數(shù)小時(shí)，長者可達(dá)數(shù)月或數(shù)年。如禽類禽流感的潛伏期從幾小時(shí)到數(shù)天，最長可達(dá)21天。人類患上禽流感

28、后，潛伏期一般為7天以。非典型性肺炎的潛伏期一般在410天，臨床報(bào)告最短病例為1天，最長有20天，甚至有極個(gè)別病例達(dá)到28天。一般認(rèn)為潛伏期長短與感染病毒的種類或者型別、病毒的致病性、病毒的數(shù)量、感染途徑、被感染機(jī)體的免疫力以與其他非生理因素等有關(guān)。比如艾滋病病毒，經(jīng)輸血感染的劑量一般較大，所以潛伏期相對較短，而性接觸感染艾滋病病毒的劑量較小，因此潛伏期相對較長。HBV感染后的潛伏期一般為20天至6個(gè)月，也有報(bào)道28160天，平均7080天；HCV感染后臨床表現(xiàn)一般較輕，常為亞臨床型，但輸血后感染的潛伏期一般為20天至6個(gè)月，也有資料報(bào)道226周，平均8周；HIV感染后1到2個(gè)月可能出現(xiàn)急性的

29、癥狀和體征，隨后進(jìn)入較長的無癥狀期，持續(xù)615年，平均810年，大量輸血的可縮短至15年。梅毒的潛伏期一般為24周灰區(qū)灰區(qū)：把定量分析的正常值圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)圍則報(bào)告+（陽性）。灰區(qū)概念對血站系統(tǒng)的獻(xiàn)血員篩查尤為重要。 灰區(qū)的設(shè)置有二種： 1）C.O（1CV）， CV為該試劑的批CV (一般在15-20%間）； 2）C.O2s，s為實(shí)驗(yàn)室做室質(zhì)控ROC（受試者工作特征曲線）的s。酶免疫吸附實(shí)驗(yàn)（EIA）的性能指標(biāo)（定性產(chǎn)品）靈敏度靈敏度（sensitivity）：某一檢測系統(tǒng)檢出極低被檢物質(zhì)的能

30、力。包括兩層意思：1.檢出被檢物質(zhì)最低量的能力；2.對大量樣品中陽性檢出的能力。檢出被檢物質(zhì)最低量的能力：常用檢出最低量被檢物的含量（即分析靈敏度或最低檢出限）來表示。比如0.1ng, 0.1mIu, 0.1NCU等，意思是在某一檢測方法下，檢測系統(tǒng)能將有用信號和背景信號區(qū)分開來時(shí)所對應(yīng)的被檢物的濃度。但這種區(qū)分在目前的條件下是否在臨床上有確切的意義并不能全部的肯定。評價(jià)方式：用標(biāo)準(zhǔn)被檢物持續(xù)稀釋，直到能區(qū)分有用信號和背景信號的最大稀釋倍數(shù)。也叫滴度。在ELISA實(shí)驗(yàn)里，常用強(qiáng)陽性混合血清系列稀釋，同時(shí)用市場反應(yīng)較好的試劑盒同時(shí)進(jìn)行標(biāo)定，選擇這些試劑盒都能檢出的最大稀釋倍數(shù)的血清作為靈敏度血清

31、，通常會有成系列的幾個(gè)血清。在標(biāo)定系列靈敏度血清的時(shí)候要非常注意一個(gè)問題：要注意基質(zhì)效應(yīng)在不同系統(tǒng)（包括不同廠家的試劑盒、工藝、不同原材料）上對靈敏度血清測量值的影響，在改變系統(tǒng)時(shí)，必須重新標(biāo)定靈敏度血清。2.為試劑對人群或大量樣品中陽性檢出的能力（假陰性越少越好），取決于包被物的全面性和親和力。選擇原材料一定要選擇親和力高的原料。有些廠家為追求試劑對大多數(shù)陽性標(biāo)本的靈敏度，只選擇最強(qiáng)的一種或少數(shù)幾種優(yōu)勢表位，而犧牲了在患者人群中較少出現(xiàn)的亞型或者原材料片段，這種做法是非常危險(xiǎn)的，是對目標(biāo)人群的不負(fù)責(zé)任。特異性特異性：指試劑正確檢定不存在的被檢物質(zhì)的能力（無假陽性），取決于包被抗原（體）與標(biāo)記抗原（體）的純度與特異性，生產(chǎn)工藝對試劑的特異性也有較大影響?？赡苡绊懺噭┖刑禺愋缘囊恍┮蛩夭僮饕蛩兀航徊嫖廴?、洗滌不徹底。試劑盒工藝：試劑盒在生產(chǎn)的時(shí)候被污染了。交叉：相似于被檢物的物質(zhì)交叉反應(yīng)，主要由生物原材料不純造成。標(biāo)本因素：高度溶血、脂血標(biāo)本。血清標(biāo)本處理：抗凝劑、反復(fù)凍融。其它存在于血清中的物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如膽紅素、膽固醇、甘油三酯等。準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度（a