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文檔簡介
1、生 物工程下游技術(shù) 學(xué)院(xuyun):資源環(huán)境學(xué)院 專業(yè):生物(shngw)技術(shù)1102班 姓名(xngmng):李紅秀 學(xué)號(hào):311103050201 指導(dǎo)老師:李剛 分子標(biāo)記技術(shù)在動(dòng)植物育種研究(ynji)中的應(yīng)用 摘要(zhiyo) 分子標(biāo)記是繼形態(tài)(xngti)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生物化學(xué)標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種的較為理想的遺傳標(biāo)記形式,近年來發(fā)展非常迅速。本文主要介紹幾種應(yīng)用在植物育種中的分子標(biāo)記技術(shù)。分別闡述了它們的原理、方法步驟與優(yōu)缺點(diǎn)、應(yīng)用范圍等。 關(guān)鍵詞 分子標(biāo)記 植物育種 應(yīng)用 分子標(biāo)記(Molecular Markers),是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi) HYPERLINK /view
2、/117213.htm t /_blank 核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記,其研究始于20世紀(jì)80年代,它是 HYPERLINK /view/758.htm t /_blank DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種 HYPERLINK /view/226639.htm t /_blank 遺傳標(biāo)記如 HYPERLINK /view/1015107.htm t /_blank 形態(tài)學(xué)標(biāo)記、 HYPERLINK /view/1015140.htm t /_blank 生物化學(xué)標(biāo)記、 HYPERLINK /view/1015111.htm t /_blank 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比,具有很多的優(yōu)點(diǎn),
3、大多數(shù)分子標(biāo)記為 HYPERLINK /view/716319.htm t /_blank 共顯性,對(duì) HYPERLINK /view/1298951.htm t /_blank 隱性的性狀的選擇十分便利;基因組變異極其豐富,分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無限的;在 HYPERLINK /view/4579.htm t /_blank 生物發(fā)育的不同階段,不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析;分子標(biāo)記揭示來自DNA的變異;表現(xiàn)為中性標(biāo)記; HYPERLINK /view/66302.htm t /_blank 檢測手段簡單、迅速等而被的廣泛應(yīng)用于遺傳育種、 HYPERLINK /view/3853603.h
4、tm t /_blank 基因組作圖、 HYPERLINK /view/87883.htm t /_blank 基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫構(gòu)建、基因 HYPERLINK /view/1364.htm t /_blank 克隆等方面。本文主要論述幾種植物育種中的分子標(biāo)記技術(shù)。1 分子標(biāo)記技術(shù)種類 1980年Bostern將生物個(gè)體之間DNA序列的差異作為標(biāo)記用于遺傳作圖,從此開創(chuàng)了在DNA水平上研究遺傳變異的新階段?,F(xiàn)階段,隨著 HYPERLINK /view/667116.htm t /_blank 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種,主要包括3種類型:一是建立在Sou
5、thern雜交基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù),如限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性標(biāo)記(RFLP )、染色體原位雜交(CISH);二是以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù),它包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA( RAPD )、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (AFLP) 、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(TRAP)、序列特征化擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP )等。第三類是基于 DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記,如單核苷酸多態(tài)性(SNP)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)等1。目前(mqin),用于植物(zhw)育種的分子標(biāo)記主要有限制性片斷(pindun)長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD)、微衛(wèi)星DN
6、A(SSR)又稱簡單重復(fù)序列,擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性(AFLP)等。2 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)RFLP是應(yīng)用最早的分子標(biāo)記技術(shù),1974年Grodzicker等創(chuàng)立了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù),1980年Botesin提出RELP可以作為遺傳標(biāo)記,開創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA多態(tài)性的新階段。RFLP原理為當(dāng)用特定限制性內(nèi)切酶處理不同生物體的DNA時(shí),所產(chǎn)生的大分子片段長度可能不相同,這種限制性片段長度的差異就是限制性片段長度多態(tài)性,當(dāng)這些長度不同的片段通過凝膠電泳時(shí),就形成不同的帶,再通過與克隆的DNA探針進(jìn)行Southern雜交和放射自顯影后,即獲得反映個(gè)體特性的RFLP圖譜,依據(jù)限
7、制性片段或位點(diǎn)的差異,計(jì)算DNA間的遺傳距離,據(jù)此來判定個(gè)體間、群體間或種間的差異。它所代表的是基因組DNA在 HYPERLINK /view/48578.htm t /_blank 限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生片段在長度上差異。由于不同個(gè)體的等位基因之間 HYPERLINK /view/24576.htm t /_blank 堿基的替換、重排、缺失等變化導(dǎo)致限制 HYPERLINK /view/1327347.htm t /_blank 內(nèi)切酶識(shí)別和酶切發(fā)生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。 RFLP標(biāo)記具有共顯性的特點(diǎn),標(biāo)記位點(diǎn)不受數(shù)量限制,可以區(qū)別純合基因型和雜合基因型,能夠提供單個(gè)位
8、點(diǎn)上的較完整的資料。但是RFLP標(biāo)記對(duì)DNA的需要量較大,克隆能表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難,而且實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣、檢測周期長、費(fèi)用高,主要適用于研究進(jìn)化關(guān)系較近種之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,而用于相距較遠(yuǎn)種時(shí)需特別小心,因?yàn)檩^遠(yuǎn)種間的酶切片段同源性差,不能清晰地推演種間進(jìn)化關(guān)系。RFLP遺傳圖譜是植物遺傳育種研究中的一個(gè)熱點(diǎn).結(jié)合RFLP連鎖圖,任何能用RFLP探針檢測出的基因及其DNA片段都可以通過回交快速、有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)移.尤其是分離群體中進(jìn)行目標(biāo)性狀的檢測和篩選時(shí),不再需要等到目標(biāo)性狀表達(dá),大大縮短了傳統(tǒng)回交育種的周期,減少了后期的篩選.李平等也利用RFLP標(biāo)記構(gòu)建了一張水稻分子連鎖圖譜。
9、黃烈健采用RFLP標(biāo)記構(gòu)建了包含124個(gè)標(biāo)記的玉米R(shí)FLP連鎖圖,覆蓋玉米基因組1 999.8CM,標(biāo)記間平均距離為16.5CM3。原始種、野生種和老品種中存在豐富的基因資源.如抗病基因、抗逆基因,及一些特殊用途的基因等.傳統(tǒng)方法在轉(zhuǎn)移這些基因時(shí)受到很大的限制,主要是因?yàn)闊o法保證種質(zhì)資源中的目標(biāo)基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)移.利用RFLP技術(shù)能夠準(zhǔn)確地標(biāo)記定位種質(zhì)中的目標(biāo)基因,結(jié)合雜交、回交(hu jio)、組培等標(biāo)記就可以快速有效地將所需目標(biāo)基因的DNA片段引入栽培品種中,實(shí)現(xiàn)品種改良.因此在遺傳育種研究中運(yùn)用RFLP進(jìn)行基因定位十分廣泛4。3 隨機(jī)(su j)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD)RAPD,即隨機(jī)擴(kuò)
10、增多態(tài)性DNA技術(shù),是由美國科學(xué)家Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的,又稱任意引物PCR。RAPD是建立在PCR 基礎(chǔ)(jch)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行 HYPERLINK /view/126521.htm t /_blank 多態(tài)性分析的分子技術(shù)。其以 HYPERLINK /view/3851989.htm t /_blank 基因組DNA為模板,以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài) HYPERLINK /view/3851939.htm t /_blank 核苷酸序列為 HYPERLINK /view/352480.htm t /_blank 引物,在熱穩(wěn)定的DNA 聚
11、合酶或Taq 酶作用下,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺 HYPERLINK /view/25110.htm t /_blank 電泳分離、 HYPERLINK /view/480156.htm t /_blank 溴化乙錠染色后,在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性5?;蛐筒煌钠贩N或不同親緣關(guān)系的物種, 基因組內(nèi)核苷酸序列存在差異。當(dāng)使用同一隨機(jī)引物對(duì)不同基因組體外擴(kuò)增時(shí), 基因組上與引物互補(bǔ)的DNA 片段的數(shù)目、位點(diǎn)是不同的, 因而其擴(kuò)增產(chǎn)物的大小、數(shù)目也不同, 亦即擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)出多態(tài)性。當(dāng)使用一系列不同的隨機(jī)引物擴(kuò)增時(shí), 這種多態(tài)性更加豐富。這
12、種擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了被測材料的遺傳多樣性。進(jìn)一步通過相關(guān)分析、聚類分析等數(shù)量遺傳分析手段, 還可以對(duì)不同親緣物種間的分類、遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育、親緣關(guān)系等進(jìn)行研究。通過 RAPD 分析可以篩選出與目標(biāo)基因連鎖的 DNA片段, 作為輔助育種的分子標(biāo)記。很多植物的目標(biāo)基因已經(jīng)找到與其連鎖的RAPD分子標(biāo)記, 這些標(biāo)記在植物育種中發(fā)揮了重要作用。近等基因系是由提供目標(biāo)基因的親本同輪回親本雜交, 并連續(xù)回交, 經(jīng)每代對(duì)目標(biāo)基因選擇而獲得。近等基因系也可以由自然突變或誘發(fā)突變產(chǎn)生。利用 RAPD 對(duì)這兩種基因組 DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測, 找出兩種基因組擴(kuò)增產(chǎn)物的差異, 并以這些差異產(chǎn)物為探針,經(jīng) RFL
13、P 分析即可定位此基因。通過檢測遠(yuǎn)緣雜種或體細(xì)胞雜種中特異性RAPD 標(biāo)記的有無, 可以鑒定雜種的真實(shí)性。也可以通過建立品種(組合)的 RAPD 指紋檔案, 用來鑒定品種純度, 為種子質(zhì)量提供可靠資料, 或用來保護(hù)品種專利6。4 簡單(jindn)重復(fù)序列(SSR)簡單重復(fù)序(SSR)也稱微衛(wèi)星DNA,其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1-6 bp,其中最常見是雙核苷酸重復(fù),即(CA)n和(TG)n每個(gè)微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同,重復(fù)單位數(shù)目10-60個(gè),其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。SSR標(biāo)記的基本原理:根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物,通過(tnggu)PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段,由于核心
14、序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同,因而能夠用PCR的方法擴(kuò)增出不同長度的PCR產(chǎn)物,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳,根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計(jì)算等位基因頻率。在真核生物中,存在許多2-5bp簡單重復(fù)序列,稱為“微衛(wèi)星DNA”其兩端的序列高度保守,可設(shè)計(jì)雙引物進(jìn)行(jnxng)PCR擴(kuò)增,揭示其多態(tài)性。SSR具有很多優(yōu)點(diǎn),SSR數(shù)量極為豐富,而且分布于整個(gè)基因組,多態(tài)性高,等位位點(diǎn)多,因此信息含量極為豐富.它一般檢測到的是一個(gè)單一的多 HYPERLINK /s?wd=%E7%AD%89%E4%BD%8D%E5%9F%BA%E5%9B%A0&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v
15、6zkg6 t /_blank 等位基因位點(diǎn)且呈共 HYPERLINK /s?wd=%E6%98%BE%E6%80%A7%E9%81%97%E4%BC%A0&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t /_blank 顯性遺傳,故可鑒別雜合子和 HYPERLINK /s?wd=%E7%BA%AF%E5%90%88%E5%AD%90&hl_tag=textlink&tn=SE_hldp01350_v6v6zkg6 t /_blank 純合子,另外所需DNA量少。然而,在采用SSR技術(shù)分析微衛(wèi)星DNA多態(tài)性時(shí)必須知道重復(fù)序列兩端的DNA序列的信息。如不能直
16、接從DNA數(shù)據(jù)庫查尋則首先必須對(duì)其進(jìn)行測序。近年來,SSR作為分子標(biāo)記所具有的優(yōu)點(diǎn)使其在植物遺傳育種中得到廣泛應(yīng)用。SSR作為以PCR為基礎(chǔ)的第二代分子遺傳標(biāo)記,是構(gòu)建高密度分子遺傳圖譜的有效工具。近年來,國內(nèi)外許多學(xué)者利用標(biāo)記構(gòu)建了許多植物的圖譜。通過研究DNA的差異來分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性更為直接,對(duì)正確評(píng)價(jià)植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性、制訂育種策略十分重要。在水稻、玉米、小麥、大麥、大豆等作物中,SSR的多態(tài)性顯著高于RFLP。郭小麗等利用 108對(duì)SSR引物對(duì)36個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種和來自不同生態(tài)區(qū)的12個(gè)普通品種進(jìn)行了遺傳差異分析和比較研究,共擴(kuò)增出705個(gè)等位位點(diǎn),平均每個(gè)位點(diǎn)有6.
17、53個(gè)等位變異,其中B 組位點(diǎn)的變異最多,聚類結(jié)果和品種的系譜來源及地域相吻合7。雜種優(yōu)勢(shì)是指兩個(gè)遺傳組成(z chn)不同的親本雜交產(chǎn)生的F1在扣除上位性效應(yīng)后產(chǎn)生的比親本具有更強(qiáng)的生活力、生長勢(shì)、適應(yīng)性、抗逆性和豐產(chǎn)性等現(xiàn)象。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)生曾提出過顯性假說、超顯性假說、生活力學(xué)說、活性基因效應(yīng)假說等觀點(diǎn)。現(xiàn)代雜種優(yōu)勢(shì)理論認(rèn)為,雜種優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)弱在一定程度上取決于親本間遺傳差異的大小。番興明等利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)18個(gè)優(yōu)質(zhì)蛋白玉米自交系和4個(gè)代表國內(nèi)主要雜種優(yōu)勢(shì)群的普通玉米標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)種進(jìn)行了雜種優(yōu)勢(shì)群劃分,劃分結(jié)果與田間產(chǎn)量配合力劃分結(jié)果及系譜分析基本一致8。參考文獻(xiàn)12 李平,朱立煌,周開達(dá),等.利用分子標(biāo)記和水稻秈粳交雙單倍體群體(qnt)進(jìn)行遺傳作圖研究.植物學(xué)報(bào),1996,38(11):881-886.3 黃烈健,向道權(quán),楊俊品,等.玉米PFLP連鎖圖譜(tp)構(gòu)建及大斑病QTL定位.遺傳學(xué)報(bào),2002,29(12):1100-1104.4 張漢堯,劉小珍,等.RFLP在植物遺傳育種研究中的應(yīng)用
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