貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同課件(PPT 18頁)

1、1.細(xì)胞培養(yǎng)中為什么添加血清？2.使用血清需注意哪些方面？3.消化液胰酶的濃度是多少？4.使用小濾器過濾要注意哪些？第1頁，共18頁。 針頭濾器使用應(yīng)注意的問題 1.擰緊濾器 2.注射器吸液體 3.注射器插好濾器 4.對(duì)著燒杯慢推壓針芯看是否漏 5.如不漏對(duì)小瓶過濾。 6.濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復(fù)多次，濾完。 7.檢查濾器濾膜是否完好。第2頁，共18頁。一、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞貼壁過程第3頁，共18頁。培養(yǎng)細(xì)胞一代生長(zhǎng)過程第4頁，共18頁。 什么時(shí)候傳代？第5頁，共18頁。第6頁，共18頁。 細(xì)胞消化的最佳程度第7頁，共18頁。 細(xì)胞凍存要求凍存條件操作要點(diǎn) 第8頁，共18頁。二、

2、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握無菌操作技術(shù)。 掌握傳代細(xì)胞的培養(yǎng)的一般方法與步驟。 掌握培養(yǎng)細(xì)胞的消化方法。 了解在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。第9頁，共18頁。三、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備 1. 細(xì)胞 人宮頸癌HeLa 細(xì)胞 人胃癌BGC-823細(xì)胞2. 試劑 胰酶、DMEM培養(yǎng)基、血清、DMSO、抗生素 3. 儀器 超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡4.其它用品： 培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75酒精棉球，酒精燈 第10頁，共18頁。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.準(zhǔn)備：超凈工作臺(tái)紫外線處理30分鐘, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。2. 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是

3、否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置室溫下預(yù)熱。3關(guān)閉超凈臺(tái)紫外燈, 打開可見光燈開關(guān),打開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。用75%酒精擦雙手消毒 。 4.正確擺放超凈臺(tái)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品：酒精燈、酒精棉球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒（頭）、吸管筒（頭）、廢液缸等。點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基（其中血清含量10%）、 血清、胰酶等。第11頁，共18頁。第12頁，共18頁。5.點(diǎn)燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。6.將培養(yǎng)用液（90mL) 瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。7. 打開血清（10.5mL

4、) 瓶，瓶口過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。8. 無菌吸取10mL血清加入到培養(yǎng)液（90mL)中，用微量移液器加入雙抗100L輕輕混勻，配置完全培養(yǎng)基。9. 在血清中（剩余0.5mL) 加入4mL完全培養(yǎng)基輕輕混勻，加入0.5mL DMSO（凍存保護(hù)劑），輕輕混勻即為凍存液 。第13頁，共18頁。第14頁，共18頁。10.細(xì)胞瓶口靠近火焰打開瓶蓋并在酒精燈上燒口消毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基（對(duì)于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法,對(duì)于培養(yǎng)皿,必須用吸管吸出）11.加一滴管胰酶輕輕漂洗一下細(xì)胞，棄胰酶，再加入一滴管或兩滴管胰酶（以蓋住細(xì)胞量為準(zhǔn)，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其濕潤(rùn)整個(gè)細(xì)胞層，蓋好瓶蓋。12.顯微鏡下觀

5、察細(xì)胞的消化狀態(tài)，待細(xì)胞大部分收縮、突起、一半變圓，細(xì)胞邊界清晰時(shí)，即可立起或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶停止消化，在超凈臺(tái)內(nèi)靠近火焰處棄胰酶第15頁，共18頁。13. 加兩滴管（約1.8-2mL）凍存液既全面吹打細(xì)胞瓶壁,吹打均勻，細(xì)胞濃度宜大，3106個(gè)/mL左右。將細(xì)胞懸液吸至凍存管中，擰好蓋，封好膠布，并標(biāo)記好細(xì)胞種類，凍存時(shí)間，保存條件以及凍存者姓名等（懸浮細(xì)胞凍存將細(xì)胞離心后再加凍存液）在培養(yǎng)瓶(殘余少量細(xì)胞）中加入5mL完全培養(yǎng)及，蓋好瓶蓋（擰緊后并旋回半圈）。做好記錄，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。凍存管在4度以下存放30min，轉(zhuǎn)放到20度 1.52h，再轉(zhuǎn)到70度412h后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)，注意做好凍存記錄。第16頁，共18頁。把握好傳代時(shí)機(jī)，80-90%匯合度階段最好，過早細(xì)胞產(chǎn)量少，過晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳消化時(shí)間要適度，過短細(xì)胞不易脫落，過長(zhǎng)細(xì)胞可脫落流失。消化液濃度要適宜，過濃時(shí)消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反應(yīng)快，所需消化時(shí)間短，掌握不好，細(xì)胞易流失。不同細(xì)胞對(duì)消化反應(yīng)不同。 貼壁不牢直接吹下細(xì)胞損傷注意事項(xiàng)第17頁，共18頁。1.試述傳代培養(yǎng)的步驟和注意事項(xiàng)，并指出哪些