蛋白質(zhì)的性質(zhì)實驗(二)——蛋白質(zhì)的等電點測定和沉淀反應(yīng)

1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)實驗（二） 蛋白質(zhì)的等電點測定和沉淀反應(yīng)一、實驗?zāi)康牧私獾鞍踪|(zhì)的兩性解離性質(zhì)學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點的一種方法加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實用意義了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系二、實驗原理蛋白質(zhì)等電點測定蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點（PI）不同蛋白質(zhì)各有其特異的等電點，在等電點時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等

2、電點。我們測等電點最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值本實驗借觀察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉配制成各種不同pH值的緩沖液，向各緩沖液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點蛋白質(zhì)的沉淀與變性在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋淼鞍踪|(zhì)的沉淀可分為兩類： （1）可逆的沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或低溫下用乙醇（或丙

3、酮）短時間作用于蛋白質(zhì) （2）不可逆的沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。如加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)注意：蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出，因此變性的蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性沉淀蛋白質(zhì)的方法鹽析法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（如硫酸銨，硫酸鈉或氯化鈉），使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中析出。鹽析沉淀一般不引起蛋白質(zhì)變性，當(dāng)除去鹽后，即可溶解重金

4、屬鹽沉淀法：當(dāng)溶液pH大于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，容易與重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+或Ag+）結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質(zhì)進(jìn)行解救就是因為它能和重金屬離子形成不溶性鹽，然后再用催吐劑排出體外某些有機(jī)酸沉淀法：某些有機(jī)酸指的是三氯乙酸、磺基水楊酸和硝酸等。當(dāng)溶液pH小于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與酸類的酸根負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀有機(jī)溶劑沉淀法：向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇或丙酮），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。此法如果控制在低溫下操作并且縮短處理時間，則

5、可使變性速度減慢加熱變性沉淀法：幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時，加熱變性凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固沉淀的原因可能是由于熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時由于蛋白質(zhì)處于等電點，也破壞了帶電狀態(tài)。古代人將大豆蛋白質(zhì)的濃溶液加熱并點入大量鹽鹵（含MgCl2）制豆腐，便是此方法的成功應(yīng)用三、實驗器材溫度計錐形瓶恒溫水浴鍋容量瓶吸管試管及試管架乳缽四、實驗材料與試劑0.4酪蛋白醋酸鈉溶液1mol/L醋酸溶液0.1mol/L醋酸溶液0.01mol/L醋酸溶液蛋白質(zhì)溶液：5卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液0.2mo

6、l/L pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液3硝酸銀溶液5三氯乙酸溶液95乙醇飽和硫酸銨溶液 硫酸銨結(jié)晶粉末0.1mol/L鹽酸溶液0.1mol/L氫氧化鈉溶液0.05mol/L碳酸鈉溶液甲基紅溶液五、實驗操作等電點的測定取同樣規(guī)格的4支試管，按下表順序分別精確地加入各試劑，然后混勻向以上試管中各加1mL酪蛋白的醋酸鈉溶液，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.3、4.7、3.5。觀察其渾濁度。靜置10min后，再觀察其混濁度，最渾濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點注意：在測定等電點的實驗中，要求各種試劑的濃度和加入的量相當(dāng)準(zhǔn)確蛋白質(zhì)的鹽析加5卵清蛋白溶液5mL于試管中，再加等量

7、的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀倒出少量渾濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管內(nèi)容物過濾，向濾液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量水，觀察沉淀是否再溶解，為什么？重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL，再加入12滴3硝酸銀溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，觀察沉淀是否溶解？為什么？某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL，再加入1mL 5三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，觀察沉淀是否溶解？為什么？有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL，再加入2mL 95乙醇溶液，混勻，觀察沉淀的生成乙醇引起的變性與沉淀取3支試管，編號，依下表順序加入各試劑振蕩搖勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加8mL水，然后在第2、3號管中各加1滴甲基紅，再分別用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mo