定量與常規(guī)PCR的差別頁P(yáng)PT課件

1、定量與常規(guī)PCR的差別Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析定量PCR技術(shù)：通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析三個(gè)關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)，定量，熒光Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。 為什么要用Ct值定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。 定量原理初始 DNA量越多, 熒光達(dá)

2、到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量確定初始模板的濃度Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 SYBR Green 1Molecular Beacons TaqMan熒光化學(xué)Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 AmplifluorRoche熒光化學(xué)Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 陰陽探針R1R2RQSYBR Green I 工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCC

3、CCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT變性 DNA未結(jié)合SYBR Green 1 dye變性: 無熒光信號(hào)SYBR Green I 工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 應(yīng)用范圍起始模板濃度定量融解曲線分析 -可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體基因型分析Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 SYBR Green I 優(yōu)點(diǎn)使用方便 - 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之

4、SYBR Green I 缺點(diǎn)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 Molecular BeaconsMolecular BeaconsOpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 發(fā)夾型雜交探針Molecular Beacons原理：熒光諧振能量傳遞（FRET） 莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對(duì)莖Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 熒光素淬滅劑環(huán)變性: 產(chǎn)生非特異性的熒光Molecular BeaconsOpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 Molecular Beacons SNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ熒光素目標(biāo)序

5、列莖淬滅劑Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 延伸: 沒有熒光Molecular Beacons SNPOpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 Molecular Beacons 應(yīng)用范圍定量起始模板濃度基因型分析鑒定產(chǎn)物單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 Molecular Beacons 優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 用于SNP檢測(cè)的最靈敏的試劑之一熒光背景低Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 Molecular Beacons 缺點(diǎn)設(shè)計(jì)困難無終點(diǎn)分析功能只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 TaqMan探針熒光素淬滅劑Opti

6、con實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 TaqMan水解型雜交探針TaqMan目標(biāo)特異性探針5 為熒光素， 3 為淬滅劑5 熒光素3淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 TaqMan 工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 退火: 無熒光信號(hào)3355模板和探針雜交延伸: 聚合反應(yīng)5533TaqMan 工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 3355延伸: Taq酶切下5端熒光素出現(xiàn)熒光TaqMan 工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 TaqMan SNP分析TACCGGGGGTTACGAACGGTAATG A T C C T A C CG A T C C C A C COpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 TaqMan 應(yīng)用范圍定量起始模板濃度基因型分析產(chǎn)物鑒定SNP分析Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 TaqMan 優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測(cè)與 Molecular Beacons 相比設(shè)計(jì)相 對(duì)簡(jiǎn)單Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之 兼容化學(xué)試劑總結(jié)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針?biāo)庑碗s交探針（5-3外切）延伸復(fù)性任何步驟定量和檢測(cè)目標(biāo)基因融解曲線分析SNP分析定量和檢測(cè)目標(biāo)基因SNP分析定量和檢