蛋白質(zhì)測序PPT課件(PPT 56頁)

1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)（primary structure）的測定 蛋白質(zhì)氨基酸序列測定的一般策略和涉及的一些重要方法與技術(shù)第1頁，共56頁。序列測定前的準(zhǔn)備工作：樣品的純度：97%以上相對分子質(zhì)量：允許誤差在10%左右 肽鏈的數(shù)目氨基酸組成一級結(jié)構(gòu)的測定主要用小片段重疊的原理 第2頁，共56頁。一、蛋白質(zhì)氨基酸測序的策略 (1)肽鏈的拆開和分離 (2)測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 (3)二硫鍵的斷裂 (4)測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出 氨基酸成分的分子比 (5)N端、C端的測定 (6)多肽鏈斷裂 (7)測定每個肽段的氨基酸順序。 (8)確定肽段在多肽鏈中的次序。 (9)確定原多肽鏈中二硫鍵的

2、位置。第3頁，共56頁。二、測定步驟(一) 多肽鏈的拆分 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。第4頁，共56頁。 幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍或高濃度的鹽處理，即可使寡聚蛋白質(zhì)中的亞基拆開. 如果多肽鏈間通過共價鍵（S-S）連接在一起，可采用氧化劑或還原劑將其斷裂。(一) 多肽鏈的拆分第5頁，共56頁。(二) 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。第6頁，共56頁。(三) 二硫鍵的斷裂 幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽

3、酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。第7頁，共56頁。作用：這些反應(yīng)可用于巰基的保護。巰基（-SH）的保護芐氧（苯甲氧）甲酰氯碘乙酰胺第8頁，共56頁。(4)測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比第9頁，共56頁。(五)分析多肽鏈的N-末端和C-末端。第10頁，共56頁。N末端：1、Sanger法2、Edman法3、DNS-Cl法4、酶降解法C末端：1、肼解法2、酶降解法3、硼氫化鋰法在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。(五)分析多肽鏈的N-末端和C-末端第11頁，共56頁。Sanger法

4、。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成黃色二硝基苯衍生物（DNP-氨基酸）。 二硝基氟苯（DNFB）法（黃色）弱堿N末端：第12頁，共56頁。 Edman 降解法(I) PITC（pH8.3）三氟乙酸CH3NO2第13頁，共56頁。Edman 降解法(II)第14頁，共56頁。PITC法可用來連續(xù)測定出60個以上的氨基酸順序。 Edman 降解法(I) 第15頁，共56頁。 丹磺酰氯（DNS）法 在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到110-

5、9mol。第16頁，共56頁。丹磺酰氯主要與氨基（包括Lys的-氨基）反應(yīng)。蛋白質(zhì)除含有N-末端的-氨基外，在它的序列中可能含有一個或幾個Lys殘基。為什么某多肽鏈用丹磺酰氯處理后，繼之用酸水解可產(chǎn)生幾種丹磺酰氨基酸？第17頁，共56頁。氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個地向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。 氨肽酶法 AlaValGly第18頁，共56頁。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物

6、質(zhì)而與C-端氨基酸分離。 肼解法 100C-末端第19頁，共56頁。 肼解過程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破壞不易測出，C-末端的精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸。 肼解法 第20頁，共56頁。羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。 羧肽酶法 第21頁，共56頁。4種羧肽酶的來源和專一性 羧肽酶來源專一性CpA胰臟能釋放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰臟主要水解C端為Arg或Lys的肽鍵C

7、pC植物或微生物相當(dāng)廣泛，幾乎能釋放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可釋放C端所有氨基酸第22頁，共56頁。 多肽C-端氨基酸可被硼氫化鋰還原成-氨基醇，用層析法可以鑒定氨基酸種類。 Sanger早期測定胰島素C-末端氨基酸采用此法。 硼氫化鋰（LiBH4）還原法 第23頁，共56頁。 硼氫化鋰（LiBH4）還原法 第24頁，共56頁。(六) 多肽鏈斷裂成多個肽段 可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。并對每一肽段進行氨基酸組成和末端殘基的分析第25頁，共56頁。多肽鏈的選擇性降解 酶解法: 胰蛋白酶：得到以Arg和Lys為C-末端的肽段，產(chǎn)生的肽

8、段數(shù)一般等于Arg和Lys總數(shù)加1第26頁，共56頁。 酶解法:糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）專一性水解芳香族氨基酸羧基端形成的肽鍵，若羧基端與Pro相連，則不被水解多肽鏈的選擇性降解第27頁，共56頁。 酶解法:酸性磷酸酶多肽鏈的選擇性降解第28頁，共56頁。 酶解法: 彈性蛋白酶多肽鏈的選擇性降解第29頁，共56頁。 化學(xué)法：溴化氰(CNBr)水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。多肽鏈的選擇性降解第30頁，共56頁。 化學(xué)法： 羥胺斷裂法，NH2OH在pH9下能專一性地斷裂Asn-Gly之間的肽鍵，但專一性不很強，Asn-Leu、Asn-Ala鍵也能部分水解。多肽鏈的選擇性降解

9、第31頁，共56頁。ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE*A,*A+B, *A+B+C+D+E*A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 結(jié)論：A B C D EDNFB完全水解部分水解(七)測定每個肽段的氨基酸順序。第32頁，共56頁。(八)確定肽段在多肽鏈中的次序 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。第33頁，共56頁。重疊法 多肽 氨基酸序列第34頁，共56頁。第35頁，共56頁。(九)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置確定二硫鍵的位置一般采用胃蛋白酶水解原來的含二硫鍵的蛋白質(zhì)。選用胃蛋白酶水解

10、的好處？該酶的專一性比較低，切點多，生成的肽段包括含有二硫鍵的肽段比較小，對后面的分離、鑒定比較容易；該酶的作用pH在酸性范圍，有利于防止二硫鍵發(fā)生交換而造成的麻煩。第36頁，共56頁。方法-對角線電泳把水解后的混合肽段點到濾紙的中央，在pH6.5的條件下，進行第一次電泳，肽段將按其大小及電荷的不同分離開來；把濾紙暴露在過甲酸蒸汽中，使S-S斷裂。每個含二硫鍵的肽段被氧化成一對含磺基丙氨酸的肽；濾紙旋轉(zhuǎn)90角在與第一次完全相同的條件下進行第二次電泳。第37頁，共56頁。二硫鍵位置的確定 對角線電泳分離 結(jié)果：大多數(shù)肽段的遷移率未變，并將位于濾紙的一條對角線上。含磺基丙氨酸的成對肽段比原來含二硫

11、鍵的肽小而負(fù)電荷增加，偏離了對角線。第38頁，共56頁。 a. Sanger的雙脫氧鏈終止法 Frederick Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測定單鏈DNA的序列-雙脫氧末端終止法（分析用酶法合成的互補鏈）。b Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法(哈佛大學(xué)) Alan Maxam和Walter Gilbert 發(fā)明的-化學(xué)化學(xué)修飾法（分析待序的DNA鏈）.c DNA序列分析自動化DNA序列分析第39頁，共56頁。1.雙脫氧末端終止法：DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補鏈；該酶能夠用2，3-雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3-末端，從而

12、終止其延伸反應(yīng)。第40頁，共56頁。1.雙脫氧末端終止法：在DNA測序反應(yīng)中，(1)加入模板DNA，(2)引物（特異性引物，如T7，M13等），(3)DNA聚合酶，(4)dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無53外切酶活性。第41頁，共56頁。雙脫氧核苷酸末端終止法特點是在 PCR 反應(yīng)中加入 2，3-二脫氧核苷三磷酸（ddNTP）。OHHHOCH2OHHO12345堿基PO23二脫氧核苷酸,第42頁，共56頁。 由于雙脫氧的 ddNTP 比正常的 dNTP 少了3-羥基，當(dāng)它在 DNA 聚合酶作用下?lián)饺氲秸谘由斓?DNA 鏈時，因 ddNTP 不含 3 -羥基，

13、于是就阻止了其它 dNTP 的繼續(xù)摻入，起了特異性終止劑的作用。第43頁，共56頁。（1）將被測 DNA 制成單鏈模板，分別加入 4 個反應(yīng)管中；（2）在每個管中加入引物、緩沖液、DNA 聚合酶 和 4 種 dNTP（其中一種為32P標(biāo)記）；（3）在 1、2、3、4 個管中分別加入 ddTTP、ddCTP、ddGTP 和 ddATP* ，然后進行保溫反應(yīng)。Sanger 法的程序第44頁，共56頁。第45頁，共56頁。第46頁，共56頁。 dATP+ddATPdGTP+ddGTPdCTP+ddCTPdTTPdTTP+ddTTPdCTPdGTPdATPdATPdCTPdTTPdTTPdGTPdAT

14、PdCTPdGTP1234-ATCGTddT-ATCGddT-AddT-ATddC-ATCGTTddG-ATCddG-ATCGTTGddA-ddA35TAGCAACT5模板引物雙脫氧法原理示意圖管管管管引物延長和合成阻斷電泳后的放射自顯影直讀圖產(chǎn)物按長短排列：AGTTGCTA35 -ATCGTTGddA-ATCGTTddG-ATCGTddT-ATCGddT-ATCddG-ATddC-AddT-ddATGCAATCGTTGA熒光標(biāo)記第47頁，共56頁。b.Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法 該方法的基本原理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長

15、度的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。 DNA序列分析第48頁，共56頁。 該反應(yīng)的關(guān)鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割反應(yīng)：堿基的特異性修飾；被修飾的堿基從核糖環(huán)上轉(zhuǎn)移；失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。 專門用來對核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學(xué)試劑有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。 DNA序列分析第49頁，共56頁。 硫酸二甲酯是堿性化學(xué)試劑，能使DNA鏈中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位發(fā)生甲基化，在中性PH環(huán)境中就能使糖苷鍵發(fā)生水解，并引起DNA鏈的斷裂。 肼在堿性條件下，能特異性切割C和T。如果加入1 mol/L的NaCl，那么，只有C被特異性切割。 DNA序列分析第50頁，共56頁。第51頁，共56頁。第52頁，共56頁。第53頁，共56頁。第54頁，共56頁。經(jīng)常不斷地學(xué)習(xí),你就什么