動物克隆-PPT課件

1、第二章 克隆技術(shù)第三節(jié) 動物的克隆動物細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)動物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展動物組織培養(yǎng)的基本方法和過程動物的克隆繁殖課堂練習動物克隆的基礎(chǔ)是動物細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)細胞培養(yǎng)是研究細胞結(jié)構(gòu)和生理的主要手段動物克隆培養(yǎng)法（細胞克?。﹦游锛毎诤虾蛦慰寺】贵w的制備動物細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)將動物體內(nèi)部分組織取出，分散成單個細胞后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖動物組織培養(yǎng)動物組織在體外及人工條件下維持生活狀態(tài)或生長特性動物細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的關(guān)系切取動物組織塊組織細胞分散為單細胞細胞培養(yǎng)機械方法或胰酶消化體外控制條件細胞保持生長、分裂、接觸抑制和有規(guī)律的衰老、死亡等生命活動現(xiàn)象動

2、物細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的關(guān)系細胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)液中各細胞彼此相互依存，細胞培養(yǎng)的后代在某種程度上會表現(xiàn)出一定的組織特性組織培養(yǎng)中，長期的組織培養(yǎng)往往只能使單一類型的細胞保存下來，而成為簡單的細胞培養(yǎng)統(tǒng)稱為組織培養(yǎng)各種生物體結(jié)構(gòu)成分的體外培養(yǎng)細胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)不能像植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體動物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展1885年雞神經(jīng)板“生理鹽水”培養(yǎng)存活1912年用雞胚浸出液作為添加劑，進行原代培養(yǎng)和長期的傳代培養(yǎng)細胞培養(yǎng)瓶（卡氏瓶）發(fā)明19031907年用血清、腹水和淋巴液作為培養(yǎng)基（含各種營養(yǎng)成分、生長因子并維持滲透壓），使細胞在體外長期存活并生長懸浮培養(yǎng)法1950年人工培養(yǎng)

3、液“199”研制成功19431951年之后能無限傳代的細胞系和細胞株培養(yǎng)成功L細胞系 HeLa細胞系貼壁生長和接觸抑制貼壁生長在細胞體外培養(yǎng)中，動物細胞會粘附于介質(zhì)上，成單細胞層緊貼生長接觸抑制在離體條件下，正常的動物細胞分裂生長到表面相互接觸時，就會停止分裂增殖的現(xiàn)象與細胞表面的糖蛋白有關(guān)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細胞系和細胞株原代培養(yǎng)將組織細胞分離后，置于第一個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程（有時也指細胞分裂10次內(nèi)的培養(yǎng)） 營養(yǎng)消耗，接觸抑制不能繼續(xù)增殖傳代培養(yǎng)將培養(yǎng)的細胞分離后，分裝到多個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)的過程細胞系傳代培養(yǎng)后可連續(xù)傳代的細胞有限細胞系連續(xù)細胞系（無限細胞系）傳代次數(shù)有限連續(xù)細胞系特

4、點： 有的只具有不死性，但仍保留接觸抑制和無異體致癌性；有的不僅有不死性，還具有異體致瘤性 細胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化 （遺傳物質(zhì)改變），多數(shù)具有異倍體核型細胞株通過一定的選擇和純化方法，從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)的細胞有限細胞株連續(xù)細胞株特點：細胞具有恒定的染色體組型、同功酶類型、病毒敏感性和生化特性等動物組織培養(yǎng)的基本方法和過程動物組織培養(yǎng)的一般流程取動物組織塊剪碎組織加培養(yǎng)液制成細胞懸浮液胰蛋白酶處理分散成單個細胞震動轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進行原代培養(yǎng)貼滿瓶壁的細胞用胰蛋白酶處理分散成單個細胞，制成細胞懸液放入CO2培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)分裝到多個培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)幼齡動物：生命力旺盛，分裂能力強分

5、解細胞外的膠原纖維和其他成分細胞分散、充分接觸營養(yǎng)液細胞克?。▌游锟寺∨囵B(yǎng)法）克隆培養(yǎng)法（細胞克?。┇@得細胞株的方法把一個單細胞從群體中分離出來單獨培養(yǎng)，使之繁衍成一個新的細胞群體的技術(shù)結(jié)果獲得純系細胞（遺傳單一，表現(xiàn)相似）最基本要求保證所建成的克隆來源于單個細胞提高細胞克隆形成率的措施選擇適宜的培養(yǎng)基添加血清以滋養(yǎng)細胞支持生長激素刺激使用CO2培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)PH用途從普通細胞系中分離出缺乏特殊基因的突變細胞系，來研究某些蛋白質(zhì)的功能只有對培養(yǎng)環(huán)境有較大適應范圍和具有較強獨立生存能力的細胞，才容易做細胞克隆。如：無限細胞系動物的克隆繁殖動物細胞全能性的表現(xiàn)程度動物難以克隆的根本原因細胞核移植實驗和

6、動物的克隆繁殖細胞核移植實驗“多莉”的克隆過程“多莉”克隆成功的原因和理論意義動物克隆的意義動物細胞全能性的表現(xiàn)程度同一動物不同時期和不同部位的細胞，全能性表達程度不同全能細胞多能細胞特化細胞專能細胞具有全能性，具有使后代細胞形成完整個體的潛能。如：受精卵及早期胚胎細胞只具有分化出多種組織細胞的潛能。如：多能造血干細胞只能分化為一種細胞。如：單能造血干細胞和表皮生發(fā)層細胞不再分化為其他細胞。如成熟的紅細胞1、低等動物細胞的全能性一般比較容易體現(xiàn)2、特化細胞的細胞核中仍然具有完整的基因組，仍具有全能性注意：動物難以克隆的根本原因細胞高度分化導致基因組中基因的活動很不完全個體發(fā)育的細胞基因調(diào)控合成

7、專一性調(diào)控蛋白質(zhì)有些基因開放或活動加強部分基因關(guān)閉基因選擇性表達使關(guān)閉基因恢復表達能力的思路給予或消除細胞能調(diào)控基因表達的物質(zhì)并具有適宜營養(yǎng)條件卵細胞中可能具備讓所有基因恢復表達的條件細胞核移植實驗利用一個細胞的細胞核（供體核）來取代另一細胞中的細胞核，形成一個重建的“合子”（重組細胞）的過程方法顯微注射和高效細胞融合方法將體細胞核或胚胎細胞核移植大去核卵細胞中，是使這些細胞核恢復全能性表達的基本途徑用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物類型（以哺乳動物的克隆為例）胚胎細胞核移植（易成功）體細胞核移植（難度高）胚胎克隆體細胞胎克隆1981年，克隆鼠2019年，克隆羊“多莉”“多莉”的克隆過程20

8、19年 蘇格蘭羅斯林研究所 維爾穆特過程蘇格蘭黑面母羊白色芬蘭母羊取卵細胞取乳腺細胞營養(yǎng)限制性培養(yǎng)取出細胞核（2N）去除細胞核（N）去核卵細胞體外胚胎培養(yǎng)分裂至8細胞胚體另一蘇格蘭黑面母羊胚胎移植妊娠、分娩“多莉”核DNA與白色芬蘭母羊相同核移植入去核卵細胞“多莉”克隆成功的原因和意義成功的原因（哺乳動物體細胞克隆最復雜）核中原有調(diào)節(jié)蛋白不斷分解（營養(yǎng)限制性培養(yǎng)）并被卵細胞質(zhì)中蛋白質(zhì)替換，至第3次卵裂時基本替換完成重組卵細胞最初分裂時僅復制DNA，而不進行基因轉(zhuǎn)錄，導致原有的基因抑制的調(diào)節(jié)蛋白不能繼續(xù)合成卵細胞中的蛋白質(zhì)將DNA表達過程重新編排，胚細胞開始表達自己的基因理論意義高度分化的細胞經(jīng)

9、過一定技術(shù)處理，也可回復到類似受精卵時期的功能（分化了的動物細胞核具有全能性）細胞質(zhì)具有調(diào)控細胞核發(fā)育的作用（卵細胞的細胞質(zhì)可以為核的全能性表達提供條件）動物克隆的意義為遺傳疾病的治療提供新途徑能夠快速、高效繁殖動物有利于瀕危動物的保存和基因保護有利于對轉(zhuǎn)基因動物的擴增和繁殖動物細胞融合和單克隆抗體的制備動物細胞融合技術(shù)和原理單克隆抗體的制備原理和過程單克隆抗體應用單克隆抗體概念和制備思路單克隆抗體的制備過程雜交瘤技術(shù)制備單抗的優(yōu)點可以從特異抗原成分比例極少的抗原混合物中獲得單抗單抗的應用作為特異探針（單抗診斷盒），研究相應抗原蛋白的結(jié)構(gòu)、細胞學分布及其功能練習動物細胞融合技術(shù)和原理概念兩個或

10、多個動物細胞融合成一個細胞的現(xiàn)象。誘導融合的方法：滅活的仙臺病毒、聚乙二醇、電刺激可以發(fā)生在基因型相同或不同的細胞之間發(fā)生在基因型不同的細胞之間的融合叫細胞雜交融合的特點應用進行基因定位；通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體原理細胞膜的流動性動物細胞融合和雜交一般不能培養(yǎng)成雜交個體因為細胞雜交中染色體容易丟失滅活仙臺病毒誘導體細胞融合滅活病毒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接形成雜種細胞病毒顆粒單克隆抗體和制備原理用單個雜交瘤細胞經(jīng)過無性繁殖（克?。┬纬杉毎?，這樣的細胞群就能產(chǎn)生出化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體，這種抗體稱為單克隆抗體抗體由效應B淋巴細胞合成，但體內(nèi)效應B淋巴細胞種類多，合成

11、的抗體為混合抗體效應B淋巴細胞不能連續(xù)增殖，無法長期體外培養(yǎng)并不斷獲得抗體原理骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)條件下能無限增殖，而B淋巴細胞能產(chǎn)生抗體。由這兩種細胞融合得到的雜交瘤細胞具有雙親的遺傳物質(zhì)，因此它既能無限增殖，又能產(chǎn)生特定抗體，從而可以獲得大量單克隆抗體概念雜交瘤技術(shù)單克隆抗體的制備過程給小鼠注射特定抗原漿細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)提取 擴大 培養(yǎng)單抗融合篩選培養(yǎng)篩選從營養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提取正常小鼠的免疫處理動物細胞融合雜交瘤細胞的篩選與培養(yǎng)單抗的提取雜交瘤細胞的篩選第一次篩選：選出雜交瘤細胞（多種）第二次篩選：選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞（B、

12、 BB、 B瘤、 瘤瘤、 瘤）課堂練習【答案：A】【答案：D】動物細胞培養(yǎng)與植物細胞培養(yǎng)的重要區(qū)別在于 A.培養(yǎng)基不同 B.動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行 C.動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能 D.動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培養(yǎng)成植株2.一只羊的卵細胞核被另一只羊的體細胞核置換后，這個卵細胞經(jīng)過多次分裂，再植入第三只羊的子宮內(nèi)發(fā)育，結(jié)果產(chǎn)下一只羊羔。這種克隆技術(shù)具有多種用途，但是不能 A.有選擇地繁殖某一性別的家畜 B.用于保存物種 C.繁殖家畜中的優(yōu)秀個體 D.改變動物的基因型3. 如果用動物的細胞進行克隆實驗應該選擇的細胞核不能是 A.乳腺細胞的 B.卵細胞的 C.胃腺細

13、胞的 D.囊胚時期的胚胎細胞的4. 美國杜克大學醫(yī)療中心的一個研究小組利用成年豬的動脈血管細胞和模擬胚胎環(huán)境的新型生物反應器，成功地在實驗室里培育出新的動脈血管。這種血管的外形和功能都與真的血管一樣，這一研究成果是生物組織培養(yǎng)領(lǐng)域的重大進展。下列關(guān)于以上技術(shù)的敘述中,不正確的是 A屬于“克隆” B可能要利用去核卵細胞 C關(guān)鍵是激發(fā)血管細胞的全能性 D關(guān)鍵是激發(fā)血管細胞發(fā)育成血管的潛能【答案：C】【答案：B】5. 1952-1953年，美國科學家斯提瓦用胡蘿卜根的懸浮培養(yǎng)細胞進行人工培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)單個細胞能像受精卵發(fā)育成胚一樣的途徑，發(fā)育成完整植株。2019年英國維爾穆特等人從白面母綿羊體內(nèi)取出乳腺

14、上皮細胞靜息培養(yǎng)，然后把它的核移入黑面母綿羊去核的卵細胞中形成重組細胞，并將重組細胞培養(yǎng)成胚胎，將胚胎植入另一母羊的子宮內(nèi)后獲得了克隆羊多利。閱讀這段材料后，回答下列問題：（1）文中的懸浮培養(yǎng)細胞和乳腺上皮細胞均為_。（2）斯提瓦的實驗證明了_維爾穆特的實驗證明了_。從細胞結(jié)構(gòu)和遺傳角度分析，兩位科學家實驗結(jié)論的得出，根本原因在于：_（3）斯提瓦和維爾穆特實驗的差別在于：體細胞植物細胞具有全能性植物體細胞直接就可發(fā)育成植株，而動物細胞核全能性的證實需借助于卵細胞。動物細胞核具有全能性細胞核中具有個體發(fā)育的全套基因單抗練習1.科學家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，得到雜交細胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細胞融合的是 A.經(jīng)過免疫的B淋巴細胞 B.沒經(jīng)過免疫的B淋巴細胞 C.經(jīng)過免疫的T淋巴細胞 D.沒經(jīng)過免疫的T淋巴細胞2.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導融合后，要用特定的培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞。在這種培養(yǎng)基上不能生存、增殖的是 B淋巴細胞 小鼠骨髓瘤細胞 B淋巴細胞自身融合細胞 小鼠骨瘤細胞自身融合細胞 雜交瘤細胞 A B C D【答案：A】【答案：D】3.下圖為某同學根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設計的生產(chǎn)破傷風桿菌抗體的實