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文檔簡介

1、多種化療藥對凋亡按捺卵白Survivin在HL-60細胞中表達的影響吳耀輝,鄒萍,劉芳,張敏,陳建華【摘要】Survivin基因是細胞凋亡按捺卵白家屬的新成員,由于其具有在人類正常構(gòu)造不表達而在種種腫瘤構(gòu)造高表達的特性,因此有望成為腫瘤治療的選擇性靶點;有研究還表白survivin的表達與耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。本研究旨在通過查明HL-60細胞在多種化療藥物作用后RNA和卵白的改變,開端探究survivin和耐藥性之間的干系。用符合濃度的柔紅霉素(DNR)、米托蒽醌(IT)和三氧化二砷(As23)作用于HL-60細胞,隨后用RT-PR檢測給藥的第1天和第3天HL-60細胞中survivinRNA的表

2、達環(huán)境,用esternblt檢測survivin卵白的表達環(huán)境。效果表白:在賜與化療藥的第1天3組HL-60細胞中survivinRNA表達程度全部低落,此中DNR組落落了10%,IT組落落40%(P0.01),As23組落落了25%(P0.01)。在賜與化療藥的第3天,DNR和IT組的HL-60細胞中survivinRNA表達較第1天有顯著的升高,別離上升20%(P0.05)和65%(P0.01);但賜與As23組中的survivinRNA表達仍連續(xù)低落,僅為第1天的68%(P0.01)。esternblt檢測創(chuàng)造,賜與DNR和IT3天后的HL-60細胞中survivin卵白含量別離升高了1

3、4%和11%,而賜與As23組那么落落了82%。結(jié)論:在賜與化療藥后白血病細胞survivin表達先低落后升高的征象大概與化療中耐藥性的產(chǎn)生有關(guān),而三氧化二砷有著差異的作用機制,這在逆轉(zhuǎn)耐藥性上大概發(fā)揮緊張的作用?!娟P(guān)鍵詞】柔紅霉素AlteratinfExpressinfSurvivininHL-60ellsTreatedithhetherapeutiDrugsKeyrdsdaunyin;itxantrne;arsenitrixide;survivin;HL-60ell細胞凋亡受阻在腫瘤的產(chǎn)生、生長及腫瘤化療耐藥等方面占據(jù)緊張的職位。比年來的研究表白,細胞凋亡調(diào)治的改變大概是腫瘤化療耐藥產(chǎn)生的

4、緣故原由之一1。Survivin作為細胞凋亡按捺卵白(inhibitrfapptsisprtein,IAP)家屬的新成員,由于其具有在人類正常構(gòu)造不表達,而在人類種種腫瘤構(gòu)造高表達的特性2,有望成為腫瘤治療的選擇性靶點,引起了學者們的普及存眷?;熢谌缃袢耘f是治療白血病的重要要領(lǐng),但日益增多的耐藥性的出現(xiàn)嚴峻影響了治療的療效,而耐藥性產(chǎn)生氣制如今尚不非常明晰。我們通過研究多種化療藥物作用人急性髓性白血病細胞系HL-60后survivinRNA和卵白的變革,開端探究survivin和化療耐藥性之間的干系。質(zhì)料和要領(lǐng)質(zhì)料與試劑RPI1640造就液、新生牛血清、TRIZL試劑購自Gib公司,LV逆轉(zhuǎn)

5、錄酶、RNA按捺物為Prega公司產(chǎn)物,DNA聚合酶購自日本TaKaRa公司,兔抗人survivin多克隆抗體為Santaruz公司產(chǎn)物,辣根過氧化物酶標識表記標幟的羊抗兔IgG購自北京中山生物工程公司,-atin和survivin的引物由上海生物工程公司合成,人急性髓性白血病細胞株HL-60由華中科技大學同濟醫(yī)學院免疫教研室惠贈,柔紅霉素(daunyin,DNR)為法瑪西亞普強產(chǎn)物,米托蒽醌(itxantrne,IT)購自四川升和制藥,三氧化二砷(arsenitrixide,As23)為哈爾濱伊達制藥廠產(chǎn)物。細胞造就人急性髓系白血病細胞HL-60以含10%胎牛血清的RPI1640造就液,于3

6、75%2條件下造就。取對數(shù)生恒久HL-60細胞,按2105/l的濃度接種于6孔板,每孔5l,實行分為柔紅霉素(20ng/l)、米托蒽醌(5ng/l)和三氧化二砷(1l/L)及不加藥HL-604組,別離于加藥造就后第1和第3天網(wǎng)絡(luò)細胞備用。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響(RT-PR)檢測接納RT-PR技能別離檢測給藥和不給藥細胞中survivinRNA的表達。人survivin的PR引物為5-TAAGGAAGATT-3和5-TAATATGGAGAG-3,合成產(chǎn)物392bp;-atin為內(nèi)參照,引物5-TGTAGTTGTATAGGT-3和5-TTTAATGTAGAGA-3,合成產(chǎn)物247bp。RT-PR接納二

7、步法。用TRIZL試劑提取細胞的總RNA,紫外分光光度計檢測其濃度(盤算濃度的公式為:樣品的A260值40稀釋倍數(shù),單元是g/l)和純度(樣品的A260/A280比值),逆轉(zhuǎn)錄天生DNA。PR的總反響體系為50l,此中包羅DNA3l,10PR緩沖液5l,25l/Lgl210l,10l/LdNTP1.5l,Taq酶2U,survivin上、卑劣引物各25pl,-atin上、卑劣引物各25pl。反響條件為94預變性5分鐘,94變性30秒,58復性45秒,72延伸1分鐘,循環(huán)30次,末了72再延伸10分鐘。PR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳闡發(fā),紫外燈下不雅察、攝像,闡發(fā)效果。試驗重復3次,效果取均勻

8、值。esternblt闡發(fā)將預冷至4的裂解緩沖液參加到經(jīng)PBS漂洗的第3天網(wǎng)絡(luò)的造就細胞中,冰上作用20分鐘,12000g離心2分鐘后,上清液保存于20;測定卵白質(zhì)濃度,上樣,SDSPAGE凝膠電泳分散,通過電轉(zhuǎn)移法將卵白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,在含5%脫脂奶粉的TTBS中37關(guān)閉90分鐘,參加一抗(兔抗人survivin多克隆抗體,稀釋度為11000),4孵育留宿,參加二抗(辣根過氧化物酶標識表記標幟的羊抗兔IgG,稀釋度為11000),37作用40分鐘,化學熒光法(EL)顯色,不雅察效果。統(tǒng)計學闡發(fā)接納SPSS10.0軟件舉行數(shù)據(jù)處置懲罰,各組間比力接納方差闡發(fā),兩兩比力接納t查驗。效果Su

9、rvivin基因在HL-60細胞中的表達RT-PR檢測表現(xiàn),與未加藥的HL-60細胞比擬,賜與3種化療藥物作用1天后的HL-60細胞中survivin表達全部低落,此中柔紅霉素組中落落約10%,三氧化二砷組中落落25%(P0.01),米托蒽醌組中落落40%(P0.01);在第3天,柔紅霉素組和米托蒽醌組的HL-60細胞中survivin表達較第1天顯著升高,別離升高了20%(P0.05)和65%(P0.01),但給與三氧化二砷組的HL-60細胞中survivin表達仍連續(xù)低落,約為第1天表達量的68%(P0.01)(附表、圖1)。由此可見,賜與柔紅霉素和米托蒽醌后,HL-60細胞中surviv

10、inRNA表達先表示為低落,但隨著時間的延伸其表達又漸漸升高,而三氧化二砷那么能使HL-60細胞中survivin的含量連續(xù)低落。Table.ExpressinfthesurvivininHL-60ellsaftertreatingiththreekindsfhetherapeutidrugs略Survivin卵白的表達應用esternblt檢測Survivin卵白的表達表現(xiàn),處置懲罰1天后4組細胞survivin卵白的含量大抵雷同,無顯著區(qū)別。第3天,可見HL-60DNR組和HL-60IT組比比擬組survivin卵白含量別離升高了14%和11%,而HL-60As23組那么顯著低落,僅約為比

11、擬組的18%(圖2)。由此可見,DNR和IT能使HL-60細胞中survivin卵白含量升高,但As23那么會使survivin顯著低落。討論白血病是血液體系患者殞命率很高的一種疾病,患者5年保存率很低,化療耐藥是影響其療效的重要緣故原由之一。因此,落服腫瘤化療耐藥成為白血病治療的關(guān)鍵。傳統(tǒng)以為,白血病化療耐藥的機制大概包羅藥物代謝途徑改變、藥物作用靶目的修飾、DNA修復率上升、藥物誘導DNA損傷落落等。比年來研究表白,細胞凋亡調(diào)治的改變大概是腫瘤化療耐藥的緣故原由之一1。Survivin是1997年創(chuàng)造的IAP家屬新成員之一,Survivin普及表達于種種腫瘤構(gòu)造中,而在正常構(gòu)造不表達2。arter等3用RTPR的要領(lǐng)檢測18例AL含AL的種種范例患者,創(chuàng)造有16例患者表示為差異程度的survivin陽性。Adida等4同樣創(chuàng)造在125例AL患者中,有75例檢測到survivinRNA的表達,其陽性率高達60%。上述研究表白survivin與白血病有必然的干系。固然survivin按捺化療藥在內(nèi)的種種刺激因素所引起的細胞凋亡機制還不明晰,但如今研究以為,大概是通過多種途徑實現(xiàn)的:survivin能與激活的aspase-3和apase-7結(jié)合,制止由aspase激活劑或凋亡誘導劑誘導的細胞DEVD-leaving自盡酶的積聚從而制止細胞凋亡8;survivin還大概與化療時腫

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