多種化療藥對(duì)凋亡抑制蛋白Survivin在HL60細(xì)胞中表達(dá)的影響

1、多種化療藥對(duì)凋亡按捺卵白Survivin在HL-60細(xì)胞中表達(dá)的影響吳耀輝，鄒萍，劉芳，張敏，陳建華【摘要】Survivin基因是細(xì)胞凋亡按捺卵白家屬的新成員，由于其具有在人類正常構(gòu)造不表達(dá)而在種種腫瘤構(gòu)造高表達(dá)的特性，因此有望成為腫瘤治療的選擇性靶點(diǎn)；有研究還表白survivin的表達(dá)與耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。本研究旨在通過(guò)查明HL-60細(xì)胞在多種化療藥物作用后RNA和卵白的改變，開(kāi)端探究survivin和耐藥性之間的干系。用符合濃度的柔紅霉素(DNR)、米托蒽醌(IT)和三氧化二砷(As23)作用于HL-60細(xì)胞，隨后用RT-PR檢測(cè)給藥的第1天和第3天HL-60細(xì)胞中survivinRNA的表

2、達(dá)環(huán)境，用esternblt檢測(cè)survivin卵白的表達(dá)環(huán)境。效果表白：在賜與化療藥的第1天3組HL-60細(xì)胞中survivinRNA表達(dá)程度全部低落，此中DNR組落落了10%，IT組落落40%(P0.01)，As23組落落了25%(P0.01)。在賜與化療藥的第3天，DNR和IT組的HL-60細(xì)胞中survivinRNA表達(dá)較第1天有顯著的升高，別離上升20%(P0.05)和65%(P0.01)；但賜與As23組中的survivinRNA表達(dá)仍連續(xù)低落，僅為第1天的68%(P0.01)。esternblt檢測(cè)創(chuàng)造，賜與DNR和IT3天后的HL-60細(xì)胞中survivin卵白含量別離升高了1

3、4%和11%，而賜與As23組那么落落了82%。結(jié)論：在賜與化療藥后白血病細(xì)胞survivin表達(dá)先低落后升高的征象大概與化療中耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)，而三氧化二砷有著差異的作用機(jī)制，這在逆轉(zhuǎn)耐藥性上大概發(fā)揮緊張的作用?！娟P(guān)鍵詞】柔紅霉素AlteratinfExpressinfSurvivininHL-60ellsTreatedithhetherapeutiDrugsKeyrdsdaunyin;itxantrne;arsenitrixide;survivin;HL-60ell細(xì)胞凋亡受阻在腫瘤的產(chǎn)生、生長(zhǎng)及腫瘤化療耐藥等方面占據(jù)緊張的職位。比年來(lái)的研究表白，細(xì)胞凋亡調(diào)治的改變大概是腫瘤化療耐藥產(chǎn)生的

4、緣故原由之一1。Survivin作為細(xì)胞凋亡按捺卵白(inhibitrfapptsisprtein，IAP)家屬的新成員，由于其具有在人類正常構(gòu)造不表達(dá)，而在人類種種腫瘤構(gòu)造高表達(dá)的特性2，有望成為腫瘤治療的選擇性靶點(diǎn)，引起了學(xué)者們的普及存眷?；熢谌缃袢耘f是治療白血病的重要要領(lǐng)，但日益增多的耐藥性的出現(xiàn)嚴(yán)峻影響了治療的療效，而耐藥性產(chǎn)生氣制如今尚不非常明晰。我們通過(guò)研究多種化療藥物作用人急性髓性白血病細(xì)胞系HL-60后survivinRNA和卵白的變革，開(kāi)端探究survivin和化療耐藥性之間的干系。質(zhì)料和要領(lǐng)質(zhì)料與試劑RPI1640造就液、新生牛血清、TRIZL試劑購(gòu)自Gib公司，LV逆轉(zhuǎn)

5、錄酶、RNA按捺物為Prega公司產(chǎn)物，DNA聚合酶購(gòu)自日本TaKaRa公司，兔抗人survivin多克隆抗體為Santaruz公司產(chǎn)物，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的羊抗兔IgG購(gòu)自北京中山生物工程公司，-atin和survivin的引物由上海生物工程公司合成，人急性髓性白血病細(xì)胞株HL-60由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫教研室惠贈(zèng)，柔紅霉素(daunyin，DNR)為法瑪西亞普強(qiáng)產(chǎn)物，米托蒽醌(itxantrne，IT)購(gòu)自四川升和制藥，三氧化二砷(arsenitrixide，As23)為哈爾濱伊達(dá)制藥廠產(chǎn)物。細(xì)胞造就人急性髓系白血病細(xì)胞HL-60以含10%胎牛血清的RPI1640造就液，于3

6、75%2條件下造就。取對(duì)數(shù)生恒久HL-60細(xì)胞，按2105/l的濃度接種于6孔板，每孔5l，實(shí)行分為柔紅霉素(20ng/l)、米托蒽醌(5ng/l)和三氧化二砷(1l/L)及不加藥HL-604組，別離于加藥造就后第1和第3天網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞備用。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響(RT-PR)檢測(cè)接納RT-PR技能別離檢測(cè)給藥和不給藥細(xì)胞中survivinRNA的表達(dá)。人survivin的PR引物為5-TAAGGAAGATT-3和5-TAATATGGAGAG-3，合成產(chǎn)物392bp;-atin為內(nèi)參照，引物5-TGTAGTTGTATAGGT-3和5-TTTAATGTAGAGA-3，合成產(chǎn)物247bp。RT-PR接納二

7、步法。用TRIZL試劑提取細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度(盤(pán)算濃度的公式為：樣品的A260值40稀釋倍數(shù)，單元是g/l)和純度(樣品的A260/A280比值)，逆轉(zhuǎn)錄天生DNA。PR的總反響體系為50l，此中包羅DNA3l，10PR緩沖液5l，25l/Lgl210l，10l/LdNTP1.5l，Taq酶2U，survivin上、卑劣引物各25pl，-atin上、卑劣引物各25pl。反響條件為94預(yù)變性5分鐘，94變性30秒，58復(fù)性45秒，72延伸1分鐘，循環(huán)30次，末了72再延伸10分鐘。PR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳闡發(fā)，紫外燈下不雅察、攝像，闡發(fā)效果。試驗(yàn)重復(fù)3次，效果取均勻

8、值。esternblt闡發(fā)將預(yù)冷至4的裂解緩沖液參加到經(jīng)PBS漂洗的第3天網(wǎng)絡(luò)的造就細(xì)胞中，冰上作用20分鐘，12000g離心2分鐘后，上清液保存于20；測(cè)定卵白質(zhì)濃度，上樣，SDSPAGE凝膠電泳分散，通過(guò)電轉(zhuǎn)移法將卵白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，在含5%脫脂奶粉的TTBS中37關(guān)閉90分鐘，參加一抗(兔抗人survivin多克隆抗體，稀釋度為11000)，4孵育留宿，參加二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的羊抗兔IgG，稀釋度為11000)，37作用40分鐘，化學(xué)熒光法(EL)顯色，不雅察效果。統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)接納SPSS10.0軟件舉行數(shù)據(jù)處置懲罰，各組間比力接納方差闡發(fā)，兩兩比力接納t查驗(yàn)。效果Su

9、rvivin基因在HL-60細(xì)胞中的表達(dá)RT-PR檢測(cè)表現(xiàn)，與未加藥的HL-60細(xì)胞比擬，賜與3種化療藥物作用1天后的HL-60細(xì)胞中survivin表達(dá)全部低落，此中柔紅霉素組中落落約10%，三氧化二砷組中落落25%(P0.01)，米托蒽醌組中落落40%(P0.01)；在第3天，柔紅霉素組和米托蒽醌組的HL-60細(xì)胞中survivin表達(dá)較第1天顯著升高，別離升高了20%(P0.05)和65%(P0.01)，但給與三氧化二砷組的HL-60細(xì)胞中survivin表達(dá)仍連續(xù)低落，約為第1天表達(dá)量的68%(P0.01)(附表、圖1)。由此可見(jiàn)，賜與柔紅霉素和米托蒽醌后，HL-60細(xì)胞中surviv

10、inRNA表達(dá)先表示為低落，但隨著時(shí)間的延伸其表達(dá)又漸漸升高，而三氧化二砷那么能使HL-60細(xì)胞中survivin的含量連續(xù)低落。Table.ExpressinfthesurvivininHL-60ellsaftertreatingiththreekindsfhetherapeutidrugs略Survivin卵白的表達(dá)應(yīng)用esternblt檢測(cè)Survivin卵白的表達(dá)表現(xiàn)，處置懲罰1天后4組細(xì)胞survivin卵白的含量大抵雷同，無(wú)顯著區(qū)別。第3天，可見(jiàn)HL-60DNR組和HL-60IT組比比擬組survivin卵白含量別離升高了14%和11%，而HL-60As23組那么顯著低落，僅約為比

11、擬組的18%(圖2)。由此可見(jiàn)，DNR和IT能使HL-60細(xì)胞中survivin卵白含量升高，但As23那么會(huì)使survivin顯著低落。討論白血病是血液體系患者殞命率很高的一種疾病，患者5年保存率很低，化療耐藥是影響其療效的重要緣故原由之一。因此，落服腫瘤化療耐藥成為白血病治療的關(guān)鍵。傳統(tǒng)以為，白血病化療耐藥的機(jī)制大概包羅藥物代謝途徑改變、藥物作用靶目的修飾、DNA修復(fù)率上升、藥物誘導(dǎo)DNA損傷落落等。比年來(lái)研究表白，細(xì)胞凋亡調(diào)治的改變大概是腫瘤化療耐藥的緣故原由之一1。Survivin是1997年創(chuàng)造的IAP家屬新成員之一，Survivin普及表達(dá)于種種腫瘤構(gòu)造中，而在正常構(gòu)造不表達(dá)2。arter等3用RTPR的要領(lǐng)檢測(cè)18例AL含AL的種種范例患者，創(chuàng)造有16例患者表示為差異程度的survivin陽(yáng)性。Adida等4同樣創(chuàng)造在125例AL患者中，有75例檢測(cè)到survivinRNA的表達(dá)，其陽(yáng)性率高達(dá)60%。上述研究表白survivin與白血病有必然的干系。固然survivin按捺化療藥在內(nèi)的種種刺激因素所引起的細(xì)胞凋亡機(jī)制還不明晰，但如今研究以為，大概是通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)的：survivin能與激活的aspase-3和apase-7結(jié)合，制止由aspase激活劑或凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞DEVD-leaving自盡酶的積聚從而制止細(xì)胞凋亡8；survivin還大概與化療時(shí)腫