HRM在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用教學文案

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。HRM在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用-高分辨率熔解曲線（HRM）在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用Xxx上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院摘要飽和熒光染料、未標記探針與實時熒光PCR結(jié)合產(chǎn)生的高分辨率熔解曲線(HRM)是一種新的實時定量技術(shù),在檢測速度、靈敏度和準確性上具有突出的優(yōu)點，在水產(chǎn)領(lǐng)域中，國際上已有人將其應(yīng)用于基因突變掃描、基因分型和品種鑒定。關(guān)鍵詞高分辨率熔解曲線，水產(chǎn)，基因突變掃描，基因分型，品種鑒定1.引言高分辨率熔解曲線分析技術(shù)（HighResolutionMelting，HRM），是由美國猶他大學保健科學中心病理學部C

2、arlWittwer實驗室與美國Idaho公司于2003年共同合作開發(fā)出來的最初應(yīng)用于SNP(singlenucleotidepolymorphism,單核苷酸多態(tài)性)檢測分析的一項新技術(shù)，并于2006成功生產(chǎn)出世界上第一臺商品化的HRM儀器HR-11,2。HRM技術(shù)因其速度快，操作簡便，高通量，靈敏性、特異性高，對樣品無污染等優(yōu)點而被迅速的應(yīng)用在生命科學、醫(yī)學、農(nóng)學、畜牧業(yè)等領(lǐng)域的研究工作中。2.HRM的原理及操作流程2.1HRM的原理HRM技術(shù)主要是根據(jù)核酸分子熔解溫度和熔解形狀的不同來區(qū)分樣品。在PCR反應(yīng)時引入飽和的熒光染料LCGreenplus，熒光染料在PCR擴增的過程中被嵌入到D

3、NA雙鏈中。當嵌有染料的DNA分子解鏈的時候，儀器對熒光信號進行采集，繪制出DNA分子的熔解曲線。DNA分子的熔解曲線與DNA分子的GC含量，GC分布，片段長度等理化性質(zhì)有關(guān)，不同的樣品由于堿基作用力的不同呈現(xiàn)出不同的熔解曲線形狀及熔解溫度(Tm值)3。以二倍體細胞為例，當純合子樣品通過PCR擴增，經(jīng)過變性復性后，仍然是純合子，如圖1（Tube1和Tube2）。而雜合子PCR擴增完，經(jīng)過變性復性后，樣品中會形成部分的含有非沃森-克里克配對的雙鏈分子存在，如圖1（Tube3）。Tube1Tube2Tube3WildtypeHomozygoteHeterozygote圖1LightScanner突

4、變檢測原理雜合子樣品相對純合子樣品來說，雙鏈不夠穩(wěn)定，表現(xiàn)在解鏈溫度上就會有微小的差別。如果采用高分辨率的儀器進行檢測，并用專門的軟件進行分析，微小的差別就會被檢測出來，從而成功的篩選出純合子與雜合子，如圖2。圖2雜合子樣品的熔解曲線為四種不同雙鏈的熔解曲線的疊加的結(jié)果在雙鏈體的溶解曲線檢測時需要添加合適的染料，常規(guī)Real-timePCR利用SYBRGreen染料標記DNA雙鏈,但是SYBRGreen是一種大分子即不飽和染料,在DNA雙鏈解鏈的過程中，SYBRGreen分子會發(fā)生重排，從已解鏈DNA片段上脫離下來的染料分子又與尚未解鏈的雙鏈DNA結(jié)合，造成結(jié)果失真，并且嵌合到產(chǎn)物中的染料如果

5、在擴增過程中不能及時脫落，還會抑制PCR反應(yīng)4。HRM采用新型的飽和染料如LCGreen,不僅沒有飽和染料的缺點,而且更易于檢測單堿基突變、小片段插入或缺失5,6,如圖3。圖3非飽和染料SybrGreen在DNA雙鏈熔解時會發(fā)生位置的遷移，飽和染料LCGreen在DNA雙鏈熔解時則直接從雙鏈上脫落下來2.2HRM的操作流程HRM的操作流程如下：（1）添加熒光染料進行PCR反應(yīng)，擴增目標區(qū)域；（2）對PCR產(chǎn)物進行熱變性，采集數(shù)據(jù)；（3）通過專業(yè)數(shù)據(jù)分析軟件分析，獲取樣品的SNP信息7。目前，研究突變以及SNP的研究方法主要有DHPLC、SSCP、DGCE、MS、測序等，所有這些方法都需要樣品通

6、過凝膠或者其他基質(zhì)來分離，其中一些方法還需要額外的酶處理或者化學處理，在這些步驟中PCR產(chǎn)物直接暴露在環(huán)境當中，都會增加在后續(xù)處理中受污染的風險。在用HRM方法進行分析時,樣本經(jīng)PCR擴增后直接進行HRM,PCR產(chǎn)物無需再轉(zhuǎn)入其他分析裝置,而直接在同一個PCR管內(nèi)進行分析,實現(xiàn)了真正的閉管操作，如圖4。圖4進行突變掃描的幾種常用方法的流程圖比較3.HRM在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用3.1基因突變掃描與基因分型高分辨率熔解曲線分析在封閉的體系中進行,不僅降低了污染風險、節(jié)省了時間,而且PCR后不需要對PCR產(chǎn)物進行處理與分離，可以不受堿基突變位點和種類的局限，既可以對已知突變進行分析，又可以對未知突變進行

7、篩查、掃描。另外，HRM分析是目前僅次于SNP芯片的中高通量SNP分型技術(shù)8。YuHaiyang等9首先用測序法研究東方牡蠣絲氨酸蛋白酶抑制基因的多態(tài)性及其抗病性關(guān)聯(lián)，在cvSl-1基因的273aabp編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了12個SNPs，同時用高分辨率熔解曲線分析了東方牡蠣一個家系的cvSl-1基因的SNP198，表現(xiàn)為明顯分離的三種基因型，發(fā)現(xiàn)抗病系的C等位基因的頻率明顯比敏感系的高。SmithBL.等10用小片段+內(nèi)標探針和未標記探針，對箭魚（Xiphiasgladius）種群的乳酸脫氫酶（ldh-A），肌球蛋白輕鏈-2（mlc-2），酸性核糖體磷蛋白P0（ARP）和鈣調(diào)蛋白（CaM）中的核基因進

8、行基因分型。結(jié)果表明，HRM是一個研究野生種群基因分型的強大工具。3.2品種鑒定HRM可以應(yīng)用于微生物品種、物種快速鑒定以及動植物品種鑒定。McGlauflinMT.等11利用高分辨率熔解曲線（HRM）發(fā)現(xiàn)了11個新的鑒別虹鱒和切喉鱒的SNPs。發(fā)現(xiàn)HRM能準確地識別DNA序列的核苷酸變化。4.HRM的缺陷對PCR反應(yīng)、熔解儀器、熒光染料要求較高由于雙鏈DNA的熔解動力學受到很多因素的影響,比如DNA模板質(zhì)量、鎂離子含量、緩沖液組成等,所以HRM要求DNA樣品由同一種方法提取,經(jīng)純化使DNA樣品濃度一致。對引物及擴增片段要求高,常需反復實驗,驗證是否適用于HRM。熔解儀器要求非常高的溫度精密度

9、和溫度均一性。熒光染料不影響PCR反應(yīng)且能飽和結(jié)合雙鏈DNA。突變掃描不能精確區(qū)分擴增片段中的不同雜合突變有時不同的雜合突變導致相似的熔解曲線,需進一步經(jīng)混樣法區(qū)分,或小片段法、非標記探針法、Snapback探針法進行基因分型提高分辨率。HRM對于大片斷插入或缺失不敏感此時需采用定量PCR先評估基因含量。PCR擴增產(chǎn)物的長度受到限制隨著擴增片段的增加,其敏感性及特異性降低。5.展望高分辨率熔解曲線在基因分型、突變掃描與序列匹配研究中非常簡便,近幾年來在醫(yī)學領(lǐng)域中發(fā)展迅速。飽和熒光染料的普及、未標記探針與實時定量PCR的結(jié)合,使得該技術(shù)無論在速度、靈敏度、準確性,還是在經(jīng)濟上都很符合檢測要求。高

10、分辨率熔解曲線技術(shù)不僅將在醫(yī)學領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用,還會廣泛應(yīng)用于動物基因檢測、植物病理、微生物分型和食品安全檢測等方面。相信將來也會廣泛地應(yīng)用到水產(chǎn)領(lǐng)域中。參考文獻GundryCN,VandersteenJG,ReedGH,etal.Ampliconmeltinganalysiswithlabeledprimers:aclosedtubemethodfordifferentiatinghomozygotesandheterozygotesJ.ClinChem,2003,49(3):396-406.WittwerCT,ReedGH,GundryCN,etal.Highresolutiongenoty

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