蛋白質的復性

1、-+EOF毛細管電泳(din yn) 電泳+電滲流0tm (min)共三十六頁8共三十六頁-+EOF毛細管膠束電動(din dn)色譜共三十六頁蛋白質的復性(f xn)共三十六頁共三十六頁包含(bohn)體什么是包含體？ 包含體是指外源基因在宿主細胞中表達(biod)時，表達(biod)的蛋白質不僅不能分泌到細胞外，反而在細胞內聚集成沒有生物活性的直徑約0.1-3.0m的固體顆粒。這些基因表達產物的一級結構(即氨基酸序列)雖然正確，但其立體結構是錯誤的。共三十六頁共三十六頁 包含體的形成 包含體的形成比較復雜，有些機理還不清楚； 一般認為包含體的形成是蛋白質過量表達的結果。包含體的形成是部分折

2、疊的中間態(tài)之間疏水性相互作用的結果，主要原因是蛋白質本身具有易于聚集沉淀的性質，或表達產物周圍的物理環(huán)境（如溫度、離子組成）不適或缺少某些折疊輔助因子（如分子伴侶(bnl)）的作用。其形成是不可預測的。共三十六頁包含體的性質高密度的蛋白質聚集體主要為基因表達產物包含體內的表達產物具有(jyu)部分二級結構包含體對蛋白酶解不敏感以包含體形式表達重組蛋白質具有優(yōu)勢：書386頁共三十六頁蛋白質復性(f xn)1.包含(bohn)體的純化2.包含體的溶解3.包含體的復性共三十六頁 包含體的純化 - 采用密度梯度離心技術則可得到純度較高的包含體。如果得到的包含體含有較多的雜質，可用螯合劑、低濃度變性劑或

3、表面活性劑（TritonX-100）的溶液(rngy)進行洗滌，使污染的膜蛋白等雜質溶解，得到含雜質較少的包含體。共三十六頁 包含體的溶解 利用高濃度的強變性劑溶解包含體，如6-8mol/L鹽酸胍或8mol/L尿素，也可利用硫氰酸鹽或表面活性劑。對于含有二硫鍵的蛋白質，還需加入還原劑解離錯配的二硫鍵螯合劑清除(qngch)重金屬離子共三十六頁共三十六頁蛋白質復性(f xn)稀釋復性分子伴侶(bnl)輔助復性反膠束復性固相輔助復性共三十六頁稀釋(xsh)復性：直接稀釋復性透析復性流加復性 共三十六頁共三十六頁蛋白質復性(f xn)的影響因素 濃度 增加蛋白質的濃度有利于聚集的進行 溫度 蛋白質的

4、復性一般在室溫下進行，溫度過高（40） 蛋白質的聚集將十分嚴重 pH值 通常復性在弱堿性條件下（pH8）進行，但要注意避免 與蛋白的pI值相近 折疊促進劑 （輔助因子） L-Arg, PEG, 去污劑, 尿素(nio s)和鹽酸胍共三十六頁共三十六頁包含體產物(chnw)分離工藝（牛生長激素分離提?。┕踩摴踩摴踩摴踩摴踩摴踩摲肿影閭H輔助(fzh)復性共三十六頁分子(fnz)伴侶1978年Laskey等發(fā)現；1987年Ellis提出普遍意義分子伴侶；1993年Ellis對分子伴侶做了更為確切的定義：即分子伴侶是一類相互之間有關系的蛋白，它們的功能是幫助(bng

5、zh)其他含多肽結構的物質在體內進行正確的非共價的組裝，并且不是組裝完成的結構在發(fā)揮其正常的生物功能時的組成部分。共三十六頁共三十六頁分子伴侶在蛋白質正確折疊中的關鍵作用阻礙集聚折疊互補功能促進錯誤(cuw)折疊降解共三十六頁共三十六頁反膠團中的蛋白質復性(f xn)利用反膠團溶解(rngji)變性蛋白質，可將變性蛋白質分子彼此分隔開來，阻止分子間的相互作用，提高復性收率。存在問題：變性劑抑制蛋白質在反膠團相的溶解，故萃取率很低。共三十六頁共三十六頁共三十六頁共三十六頁展 望研究蛋白質變性復性機理，開發(fā)新的變性復性原理和技術，解決目前的技術關鍵。 完善現有技術，實現現有技術的實用化和規(guī)?；?。

6、根據(gnj)現有技術原理，擴大應用范圍。開發(fā)實用的設備共三十六頁預防(yfng)包含體形成的方法1. 形成分子伴侶2. 通過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達產物的可溶性. 為了使外源蛋白在E.coli細胞中可溶性，人們在培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面進行(jnxng)了多方面的探索。 3通過基因突變技術，在蛋白分子中產生氨基酸取代，來增加重組蛋白的可溶性。共三十六頁內容摘要-。這些基因表達產物的一級結構(即氨基酸序列)雖然正確，但其立體結構是錯誤的。一般認為包含體的形成是蛋白質過量表達的結果。對于含有二硫鍵的蛋白質，還需加入還原劑解離錯配的二硫鍵。增加蛋白質的濃度有利于聚集的進行。L-Arg, PEG, 去污劑, 尿素和鹽酸胍。完善現有技術，實現現有技術的實用化和規(guī)模化。1. 形成分子伴侶。2. 通過改變、優(yōu)化培養(yǎng)條件增加表達產物