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文檔簡介
1、 PAGE PAGE 2實驗(shyn)一 蛋白質(zhì)含量測定法實驗(shyn)目的掌握(zhngw)考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定蛋白質(zhì)含量的方法掌握紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的方法一考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)實驗原理器材與試劑器材722型和753型可見光分光光度計漩渦混合器試管16支試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,用牛血清清蛋白(BSA),配制成1.03mg/ml和0.103mg/ml。考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑:稱100mg考馬斯亮藍(lán),溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85% 的磷酸,用水稀釋至1升。實驗方法標(biāo)準(zhǔn)方法取10支試管,分別編號后按 表1-1 劑量依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白
2、(或未知蛋白)、去離子水和考馬斯亮藍(lán)染料。每支試管加完后,立即在漩渦混合器上混合。加完染料20min后,使用722分光光度計(靈敏度4),塑料比色皿,在595nm處測量吸光度A595。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo),用A595為縱坐標(biāo),進(jìn)行直線擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測得的未知樣品的A595,查表即可求得未知樣品的蛋白質(zhì)含量。微量法取10支試管,分別編號后按 表1-3 劑量依次加入稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(或未知蛋白)、去離子水和考馬斯亮藍(lán)染料。其他步驟同上,不過使用753分光光度計(狹縫4)。SDS干擾實驗取5支試管,分別編號后按表1-5劑量依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白、SDS、去離子水和考馬斯亮藍(lán)染料。每
3、支試管加完后,立即在漩渦混合器上混合。加完染料20min后,使用753分光光度計(狹縫4),塑料比色皿,在595nm處測量吸光度A595。 PAGE 14實驗(shyn)數(shù)據(jù)與結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)方法(fngf)的數(shù)據(jù)和圖表1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)法實驗表格管號12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(1.03mg/ml)00.010.020.040.060.080.10未知蛋白質(zhì)(約0.5mg/ml)0.040.080.10蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.060.020考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0對應(yīng)的吸光度A595
4、0.2000.3110.3620.4830.6240.7520.8450.3870.5010.572根據(jù)表1,以A595為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量/(g)為橫坐標(biāo),作圖1。圖1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)法根據(jù)線性擬合(n h)公式y(tǒng)=6.1884x+0.2287計算所測溶液的蛋白質(zhì)的含量分別是8號管0.637mg/ml,9號管0.5547 mg/ml,10號管0.550 mg/ml。因為8號管測出結(jié)果誤差(wch)太大,取9和10管的平均值,所以,未知溶液的蛋白質(zhì)含量為0.5524 mg/ml。微量法的數(shù)據(jù)(shj)和圖表2 考馬斯亮藍(lán)微量法實驗表格管號12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(0.103mg/ml
5、)00.10.20.40.60.81.0未知蛋白質(zhì)(約0.5mg/ml)0.40.81.0蒸餾水1.00.90.80.60.40.200.60.20考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0對應(yīng)的吸光度A59500.0880.1840.2920.4110.5420.6310.1710.2890.362根據(jù)表2,以A595為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量/(g)為橫坐標(biāo),作圖2。圖2 考馬斯亮藍(lán)微量法根據(jù)(gnj)線性擬合公式y(tǒng)=6.0579x+0.0305計算稀釋10倍后的未知溶液(rngy)的蛋白質(zhì)含量分別是8號管0.05798 mg/ml,9號管0.0533
6、4 mg/ml,10號管0.05472 mg/ml。取平均值再乘10倍,得未知溶液的蛋白質(zhì)含量為0.5534 mg/ml。SDS干擾(gnro)數(shù)據(jù)和圖表3 考馬斯亮藍(lán)SDS干擾實驗表格管號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(1.03mg/ml)0.10.10.10.10.10.1SDS (1mg/ml)00.10.20.40.60.8蒸餾水0.90.80.70.50.30.1考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.03.03.03.03.03.0對應(yīng)的吸光度A5950.4230.3360.2750.2000.2130.198根據(jù)表3,以A595為縱坐標(biāo),SDS濃度為橫坐標(biāo),作圖3。圖3 考馬斯亮藍(lán)SDS干擾實驗由上
7、圖可以看出,十二(sh r)烷基硫酸鈉(SDS)對考馬斯亮藍(lán)法測蛋白質(zhì)含量有干擾,同是0.103mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)蛋白與3.0ml考馬斯亮藍(lán),但隨著SDS濃度的增加,其混合液的595nm處的吸收峰逐漸降低(jingd),而后有一小段回升,最后趨于漸近線。二紫外吸收法實驗原理280nm的光吸收法:蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處有最大吸收。215nm與225nm的吸收差法:蛋白質(zhì)因為含量低而不能使用280nm的光吸收測定時,可用215nm與225nm吸收值之差,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。肽鍵測定法:蛋白質(zhì)溶液在238處的光吸收強(qiáng)弱,與肽鍵的多少成正
8、比。可以測238nm處吸收值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。器材與試劑(一) 器材1SPECORD200分光光度計2漩渦混合器3試管12支(二) 試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,用牛血清清蛋白(BSA),配制成1.03mg/ml。 實驗數(shù)據(jù)與結(jié)果分析(一)紫外280nm吸收法數(shù)據(jù)和圖表4 紫外280nm光吸收法管號123456BSA (1.03mg/ml)體積01.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00BSA濃度(mg/ml)00.2060.4120.6180.8241.03A28000.1580.2700.3790.5140.645根據(jù)表4,以A280為縱坐標(biāo),SBA
9、濃度為橫坐標(biāo),作圖4。圖4 紫外280nm光吸收法根據(jù)直線(zhxin)擬和方程y=0.6105x+0.0132求解(qi ji)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(牛血清清蛋白)與文獻(xiàn)(wnxin)值6.3比較接近。紫外215nm與225nm的吸收差法的數(shù)據(jù)和圖表5 紫外215nm與225nm的吸收差法管號123456未知BSA (1.03mg/ml)體積00.10.20.30.40.5H2O5.04.94.84.74.64.5BSA濃度(g/ml)020.641.261.882.4103A21500.2870.4590.7941.0901.4010.574A22500.1650.2640.4390.6210.80
10、30.286吸收差00.1220.1950.3550.4690.5980.288根據(jù)表5,以吸收差為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),作圖5。圖5 215nm與225nm吸收(xshu)差法把未知蛋白質(zhì)溶液(rngy)稀釋10倍后測得的吸收差0.288帶入上圖直線(zhxin)擬和方程y=0.0058x-0.0095得稀釋10倍后的蛋白質(zhì)濃度為51.83g/ml,則原未知濃度溶液的蛋白質(zhì)含量為0.518mg/ml。(三) 肽鍵測定法數(shù)據(jù)和圖表6 肽鍵吸收法管號123456未知BSA (1.03mg/ml)體積00.51.01.52.02.5H2O5.04.54.03.53.02.5BSA濃度 (g/
11、ml)0103206309412515A28000.1900.3010.5410.7350.9210.441根據(jù)表6,以A238為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),作圖4。圖6 肽鍵(ti jin)測定法把未知蛋白質(zhì)溶液(rngy)稀釋1倍后測得238nm的吸收值為0.441,帶入上圖直線(zhxin)擬和方程y=0.0018x-0.0125得稀釋1倍后的蛋白質(zhì)濃度為251.94g/ml,則原未知濃度溶液的蛋白質(zhì)含量為0.503mg/ml。結(jié)論: 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)法測得未知溶液中蛋白質(zhì)含量為0.5524mg/ml, 用微量法測得未知溶液中蛋白質(zhì)含量為0.5534mg/ml,最終結(jié)果相差不大,但是標(biāo)準(zhǔn)法
12、所測的三個數(shù)據(jù)明顯比微量法測得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差大,這說明微量法比標(biāo)準(zhǔn)法實驗穩(wěn)定性高,準(zhǔn)確性高。 干擾考馬斯亮藍(lán)方法的物質(zhì)中,我們主要對SDS的干擾情況作了分析:總體上,當(dāng)溶液中存在一定量的SDS后所測得的吸光度比正常值相對減小。但是隨著SDS濃度的增加,吸光度的減小量沒有呈現(xiàn)出很明顯的規(guī)律。從SDS與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理來看,SDS可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每兩個氨基酸結(jié)合一個SDS分子,這時各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。由于SDS 的存在,阻礙了染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的結(jié)合,使得吸光
13、度減小。由于SDS與染料分子對蛋白質(zhì)的競爭結(jié)合,使得顯色減弱,吸光度值降低,因此在曲線前段呈下降趨勢;但由于SDS破壞氫鍵,使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更加伸展,一些原來包裹在結(jié)構(gòu)中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出來,所以會有少量的吸光度回升;但最終SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合達(dá)到所處溶液條件下的“飽和”時,過量的SDS就不起作用了,曲線是最后為平緩段。 要去除(q ch)SDS的干擾,可以利用它與K+結(jié)合生成沉淀的性質(zhì)(xngzh)將其去除。K+對考馬斯亮藍(lán)方法不產(chǎn)生(chnshng)干擾。 紫外280nm吸收法中,從文獻(xiàn)中查得牛血清清蛋白的。實驗得出相對誤差為:紫外吸收差法和肽鍵測定法所測的未知溶液蛋白含
14、量分別為0.518mg/ml 和0.503mg/ml,與考馬斯亮藍(lán)法的結(jié)果有差距,這與兩個方法用蛋白質(zhì)分子中不同的物質(zhì)的測量值近似代替蛋白質(zhì)含量有關(guān)??捡R斯亮藍(lán)染料主要與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合,測吸收峰;而紫外吸收法是測酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有的共軛雙鍵。 思考與討論1.用考馬斯亮藍(lán)法G-250測定蛋白質(zhì)含量有何特點,操作過程中應(yīng)注意什么?答:Bradford 法的優(yōu)點是(1)靈敏度高,其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1g。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化很大。(2)測定快
15、速、簡便、只需要加一種試劑。完成一個樣品的測定,只需要5min左右,顏色在5min至20min之間穩(wěn)定性也很好。(3)干擾物質(zhì)相對其它方法少。缺點是(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。(2)仍有些物質(zhì)干擾此法測定:去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1mol/L的NaOH。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性。 操作注意事項:不可使用石英比色皿,可用塑料或者玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗,以洗去染色。塑料比色皿決不可以用乙醇或丙酮長時間浸泡。2.考馬斯亮藍(lán)G-250和R-250各有何
16、特點,在電泳染色方面有何異同?(詳見講義參考文獻(xiàn)12.)答:考馬斯亮藍(lán)G-250和R-250的結(jié)構(gòu)式不同,配方不同,染色方法也適合于不同性質(zhì)的蛋白??捡R斯亮藍(lán)R-250即三苯基甲烷(triphenylmethane)。每個分子含有兩個-SO3H,偏酸性,與蛋白質(zhì)的堿性集團(tuán)結(jié)合。在一定pH時,染料蛋白復(fù)合物可以被完全解聚。與不同蛋白結(jié)合呈現(xiàn)基本相同的顏色,并且在比較寬的范圍內(nèi)(15-20g),掃描峰的面積與蛋白量有線性關(guān)系。通常用先固定,再進(jìn)行染色和脫色的方法??捡R斯亮藍(lán)G-250即二甲花青亮藍(lán)(Xylene Cyanine Brillian Blue)其染色方法經(jīng)常是對蛋白質(zhì)同時進(jìn)行固定和染色
17、。這種方法的特點是快而簡便,有時甚至不需脫色。但靈敏度略遜于R-250。同時考馬斯亮藍(lán)G-250對小肽染色效果很好。3.試述幾種(j zhn)主要干擾物質(zhì)對考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白測定法測定結(jié)果的影響(yngxing)及其作用機(jī)理。答:SDS的存在會使相同條件下的吸光度值減小,其作用機(jī)理為:斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每兩個氨基酸結(jié)合一個SDS分子,這時各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。由于SDS與染料分子與蛋白質(zhì)的競爭結(jié)合,會使顯色減弱(jinru),所以吸光度值減小。Tris,乙酸,2-巰基
18、乙醇,蔗糖,甘油,EDTA及微量的去污劑如TritonX-100,玻璃去污劑有少量顏色干擾,用適當(dāng)?shù)木彌_液對照很容易除掉。4.試求紫外吸收法的靈敏度(即濃度每變化0.1mg/ml時相應(yīng)吸光度值的變化量)。答:未知蛋白濃度c(mg/ml)與吸光度A280的關(guān)系如下:所以,靈敏度為:。同理,肽鍵測定法的靈敏度為:;吸收差法的靈敏度()為:。5.解釋百分吸光系數(shù),說明其在生化實驗中的應(yīng)用,并試述為何不同蛋白質(zhì)的百分吸光系數(shù)會有很大差別?答:蛋白質(zhì)溶液濃度為,光徑為1cm,在波長下測得的吸光度值稱為這種蛋白質(zhì)的百分吸光系數(shù)(或比吸收系數(shù))。記為:。在生化實驗中,可以只進(jìn)行相同波長、相同光徑下樣品蛋白質(zhì)的吸光度測量,通過公式:,計算未知蛋白濃度。由于吸收紫外光是蛋白質(zhì)分子中共軛雙鍵的特性,而不同蛋白質(zhì)中所含有的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的量不同(這些氨基酸中含有苯環(huán),是共軛雙鍵的來源),所以,不同蛋白質(zhì)的百分吸光系數(shù)不同。6.說明各種蛋白質(zhì)含量測定法中哪幾種可以測出蛋白質(zhì)的絕對含量,哪幾種只能測定其相對含量,為什么?答
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