蛋白的分離純化

1、一、蛋白質(zhì)的分離純化(chn hu)概述共六十五頁與蛋白質(zhì)分離純化(chn hu)相關(guān)的理化特性分子大小分子形狀帶電特性溶解特性與配體特異性結(jié)合不同吸附性質(zhì)(xngzh)變性和復(fù)性哪些技術(shù)、原理共六十五頁分子大小(dxio) 重點大?。旱鞍踪|(zhì)的分子大小主要取決于蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目及每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。常用方法(fngf)透析超濾凝膠過濾離心共六十五頁分子(fnz)形狀 重點形狀：蛋白質(zhì)在離心通過溶液、膜、凝膠顆?；螂娪灸z中的小孔運動(yndng)時，都會受到它的形狀的影響。方法密度梯度離心電泳 分子篩層析（三格寫，兩格不寫）共六十五頁電荷(dinh)原理：蛋白質(zhì)的凈電荷取決于氨基酸殘基所

2、帶正、負(fù)電荷總和。方法(fngf)電泳離子交換層析共六十五頁溶解度原理：由于蛋白質(zhì)分子表面親水性和疏水性帶電基團(tuán)不同，因此在溶劑(rngj)中的溶解度不同。方法：鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點沉淀法共六十五頁配體特異性結(jié)合(jih) 重點 原理：將具有親和結(jié)合的兩個分子中的一個固定在不溶性基質(zhì)上，來分離另一個分子。分類免疫親和層析生物(shngw)親和層析金屬螯合親和層析擬生物親和層析共六十五頁吸附(xf)性質(zhì)原理(yunl)：根據(jù)次級鍵相互作用。方法：吸附層析共六十五頁變性(binxng)和復(fù)性原理：蛋白質(zhì)在一定的理化條件下失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及部分理化特性等稱為(chn wi)變性。

3、當(dāng)變性條件去除后恢復(fù)原有的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能即為復(fù)性。方法：尿素變性復(fù)性從包涵體中純化原核表達(dá)蛋白共六十五頁二、蛋白質(zhì)的分離(fnl)純化共六十五頁細(xì)胞破碎蛋白溶解酸、堿醇去垢劑尿素粗 提沉淀相分離分子篩精 提各種色譜電泳分離差速離心研磨超聲滲透壓酶保 存預(yù)處理（沉淀）原材料的獲取濃縮(nn su)保存狀態(tài)保存條件保存期限分離(fnl)純化流程純化共六十五頁分離純化流程(lichng)預(yù)處理（沉淀、粗分離）-純化（離子交換）共六十五頁機(jī)械方法(fngf)：攪拌、振動研磨壓濾超聲勻漿非機(jī)械方法(fngf)：干燥滲透壓凍融酶細(xì)胞破碎共六十五頁體積(tj)離子強(qiáng)度 pH溫度蛋白質(zhì)的穩(wěn)定蛋白(dnb

4、i)的溶解共六十五頁蛋白質(zhì)的粗分離(fnl)使用(shyng)蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實驗材料后，蛋白提取液中目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡單的方法使目標(biāo)蛋白質(zhì)濃縮，同時去除大量的雜質(zhì)，這些純化方法就屬于蛋白質(zhì)的粗分級。硫酸銨分級沉淀、有機(jī)溶劑分級沉淀、超速離心、等電點沉淀(重點)、透析、超過濾、蛋白質(zhì)結(jié)晶等。共六十五頁蛋白質(zhì)的純化(chn hu)粗分離(fnl)只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離(fnl)純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進(jìn)一步純化，這就是蛋白質(zhì)細(xì)分級。常用的實驗技術(shù)：層析（離子交換等）和電泳共六十五頁1. 離子交換(l z jio h

5、un)層析固相支持物：纖維素、瓊脂糖、葡聚糖等高分子聚合物帶電基團(tuán)(j tun)：羧甲基、二乙基氨基等平衡離子：H+, Na+, Cl-, OH- 共六十五頁基本操作過程(guchng)樣品制備(zhbi)，裝柱與平衡上樣（樣品溶解于A液中）洗脫：穿透峰，洗脫峰收集、鑒定共六十五頁離子交換層析有兩種洗脫(x tu)方式分步洗脫：用間斷地遞增的不同離子強(qiáng)度的流動相分次洗脫樣品蛋白的方法；梯度洗脫：連續(xù)改變流動相離子強(qiáng)度的方法。目前隨著層析的自動化，梯度洗脫成為大多數(shù)情況下的首選(shu xun)方案。共六十五頁2. 凝膠過濾(gul)層析利用分子量不同的蛋白質(zhì)，通過凝膠分子篩時速度不同來分離蛋白

6、質(zhì)的方法(fngf)。常用的凝膠有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Superdex等。共六十五頁3. 親和層析以樣品的生物活性為依據(jù)的分離方法。生物分子的特點是有專一的活性，如酶與底物的結(jié)合，抗原與抗體，激素與受體，糖與凝集素等。將上述作用體系的一方(y fn)連接到層析基質(zhì)上，使之固定化，就有可能分離純化專一作用的另一方(y fn)。共六十五頁各種( zhn)用于抗體識別的標(biāo)記His-tag (6-8 Histidine)鎳離子-6個組蛋白T7-tag (MASMTGGQQMG)HSV-tag (QPELAPEDPED)S-tag (KETAAKFERQHMDS)V

7、SV-G-tag (TTDIEMNRLGK)HA-tag (YPYDVPDYA)Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)共六十五頁免疫親和層析：將蛋白質(zhì)抗體偶聯(lián)到免疫親和柱可用于抗原(kngyun)蛋白的純化；凝集素親和層析：凝集素是一大類能專一性和糖類和糖復(fù)合物結(jié)合的蛋白質(zhì)，固定化凝集素可用于糖蛋白純化；染料親和層析：有多種染料可與各種類型的酶結(jié)合，又不受酶的作用，可用于多種蛋白的分離。親和層析中的三大通用(tngyng)技術(shù)共六十五頁電泳(din yn)（electrophoresis）帶電粒子在電場中向與自身電荷相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳(din

8、 yn)。蛋白質(zhì)在電場中泳動時，受到電場力和摩擦力兩種方向相反的力的作用蛋白質(zhì)因帶電、大小和形狀不同而在直流電場中泳動速度不同。共六十五頁常用(chn yn)蛋白質(zhì)電泳技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等電聚焦(jjio)電泳（ Isoelectric focusing- IEF）雙向電泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）共六十五頁聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（bis）經(jīng)共聚合而成，此過程(guchng)在TEMED和過硫酸銨催化下聚合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠的孔徑可在較寬范圍內(nèi)變化，

9、以迎合不同的分離需要。共六十五頁根據(jù)凝膠的均勻性（孔徑、pH）可分為連續(xù)與不連續(xù)兩類；根據(jù)是否加蛋白質(zhì)變性劑，可分為變性與非變性兩類；根據(jù)是否加還原劑2-巰基乙醇或DTT，可分為還原與非還原兩類；還可根據(jù)電泳裝置的不同(b tn)，分為圓盤電泳和平板電泳。PAGE的分類(fn li)共六十五頁不連續(xù)平板PAGE，是使用 最廣泛(gungfn)的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)，它由濃縮膠與分離膠兩部分組成。不連續(xù)PAGE有很高的分辨力，因為它有以下三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)不連續(xù)(linx)PAGE共六十五頁染色法：考馬斯亮藍(lán)染色法（多種類型可選）、銀染法；活性檢測法：適用于Native PAGE，其

10、中蛋白質(zhì)保持天然活性，可用酶學(xué)方法檢測；免疫(miny)印跡法：用特異性抗體檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)。PAGE的檢測(jin c)方法共六十五頁2. 等電聚焦(jjio)電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點進(jìn)行分離的一種技術(shù)?；驹恚豪脙尚噪娊赓|(zhì)載體形成一個連續(xù)(linx)而穩(wěn)定的線性pH梯度，使pH從正極到負(fù)極逐漸增加。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點的pH位置帶電，因此在電場中可以移動；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動到pH等于pI位點，其靜電荷為0，在電場中不再移動，據(jù)此可將不同pI的蛋白質(zhì)分離。共六十五頁優(yōu)點樣品加樣位置和體積不受限制；分辨率高于其它(qt)類型電泳；可測定pI值；缺點樣品在pI區(qū)域易沉淀，為增加樣品溶解度，可以在

11、膠中加入尿素，但導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活；樣品前處理麻煩。等電聚焦(jjio)的優(yōu)缺點共六十五頁3. 雙向電泳（概念(ginin)、原理、作用、用途）將等電聚焦技術(shù)與SDS技術(shù)組合起來的新技術(shù)，是目前分離(fnl)蛋白質(zhì)混合物最強(qiáng)大的技術(shù)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)?；静襟E：第一相等電聚焦后，在等電聚焦的垂直的方向進(jìn)行第二相SDS。雙向凝膠電泳的原理：第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。共六十五頁應(yīng)用凝膠中蛋白的檢測圖像采集(cij)和分析蛋白鑒定分離蛋白質(zhì)組所有蛋白共六十五頁（1） IEF等電聚焦(jjio)電

12、泳（2）SDS（3）染色(rns)脫色pH 3 - - - - - 10共六十五頁圖像(t xin)分析在用雙向電泳進(jìn)行差別表達(dá)蛋白質(zhì)組分析時，需要利用軟件對產(chǎn)生的2D膠進(jìn)行差別分析，以尋找(xnzho)差別表達(dá)蛋白。常用的軟件如安瑪西亞公司的Image Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析軟件。共六十五頁蛋白質(zhì)的濃縮(nn su)超濾法冷凍干燥法沉淀法共六十五頁三、蛋白質(zhì)的鑒定(jindng)1. 蛋白質(zhì)的含量測定2. 蛋白質(zhì)分子量的測定3. 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)共六十五頁蛋白質(zhì)的含量(hnling)測定目前蛋白質(zhì)的直接定量分析技術(shù)只能測定樣品的總

13、蛋白含量；目前沒有任何(rnh)方法能直接分析樣品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是凱氏定氮法， Lowry Folin法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外分光光度法等。共六十五頁3. 蛋白質(zhì)分子量的測定SDS測定分子量凝膠過濾(gul)層析法測定分子量質(zhì)譜法共六十五頁1. SDS測定(cdng)分子量基本原理：SDS可以破壞蛋白質(zhì)中的疏水鍵和氫鍵，并按一定比例(bl)（1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS）和蛋白質(zhì)組成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶的負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身的電荷量，并與蛋白質(zhì)的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質(zhì)二硫鍵，使蛋白質(zhì)呈橢圓棒形，其軸長與分子量成正比。共六十五頁2. 凝膠過濾(g

14、ul)層析法測定分子量蛋白質(zhì)在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve，與其分子量的關(guān)系如下式所示： lg MrK1K2 Ve在實驗中，只要測得幾種(j zhn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物的Ve，并以它們的lg Mr對Ve作圖得一直線，再測出樣品的Ve，即可從圖中得到樣品的分子量。共六十五頁SDS與凝膠過濾法是互補(bǔ)(h b)的凝膠過濾法測得的是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)（如果它有的話）的分子量；SDS測得的是蛋白質(zhì)亞基的分子量；在有2-巰基乙醇（或DTT）存在時，SDS可測得蛋白質(zhì)每條多肽鏈的分子量。綜合應(yīng)用這兩種方法，可得到(d do)待測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的許多信息。共六十五頁質(zhì)譜法是最精確(jngqu)的分子量測定方法質(zhì)譜（

15、 Mass Spectrometry，MS）是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比（m/z）的大小順序排列的圖譜(tp)。測定蛋白質(zhì)分子量的精確度為0.010.1。共六十五頁4. 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù) ( 重點(zhngdin) 必須掌握）共六十五頁印跡(yn j)法的基本原理印跡（blotting）是生物大分子物質(zhì)如核酸或蛋白質(zhì)通過(tnggu)不同途徑轉(zhuǎn)移到固相載體上的過程。與凝膠相比，固相載體容易和各種探針發(fā)生化學(xué)或免疫學(xué)反應(yīng)。共六十五頁目前(mqin)常用的印跡法： Southern blot 檢測DNA Northern blot 檢測RNA Western blot 檢測蛋白質(zhì) 重點共六

16、十五頁蛋白質(zhì)印跡(yn j)的用途用于檢測樣品中是否有特定蛋白(dnbi)的存在，并進(jìn)行半定量分析。共六十五頁Western blotting原理(yunl)圖示共六十五頁原理(yunl)（問度娘）Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影

17、以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)(jsh)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。共六十五頁共六十五頁基本(jbn)操作步驟樣品的制備細(xì)胞(xbo)裂解物的SDS蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移目的蛋白的檢測共六十五頁印跡法最常用的固體材料有硝酸纖維素（NC）膜和PVDF膜。為減少非特異性干擾，需對固相載體進(jìn)行處理，即用一種與待測物不反應(yīng)的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸、吐溫20等封閉載體上印跡以外的剩余(shngy)吸附點（該過程稱為封閉），使探針僅與印跡物起反應(yīng)，且不吸附到載體上。共六十五頁膜種類(zhngli)硝酸(xio sun)纖維素NC膜PVDF膜尼龍膜共六十五頁膜的特點(tdin) 共六十五頁轉(zhuǎn)膜方

18、法(fngf) 重點半干法 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣(yyng)加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。濕法 將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。 共六十五頁電轉(zhuǎn)儀共六十五頁轉(zhuǎn)膜后檢測(jin c)麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)(chxin)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。共六十五頁探針是用化學(xué)方法將能與待研究(ynji)蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)如抗體，與某些標(biāo)示物如酶、同位素或熒光物質(zhì)、半抗原等結(jié)合形成的復(fù)合物。蛋白質(zhì)印跡最常用的探針是酶聯(lián)抗體（HRP酶或AP酶）。共六十五頁兩種常用檢測(jin c)酶系統(tǒng)的比較共六十五頁內(nèi)參(ni cn)的選擇原因：校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差(wch) 種類：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 共六十五頁化學(xué)顯色法 : 方便、便宜、有毒、靈敏度較低、費抗體、反應(yīng)慢、線性窄、不易保存、不能重新剝離檢測化學(xué)發(fā)光法 : 靈敏、快速、節(jié)省抗體、線性寬、無害、特異性高、可重新剝離檢測同位素法 : 靈敏度高、不安全、環(huán)境污染(hunjng wrn)、半衰期短熒光底物法： Krypton 熒光底物共六十五頁抗體(kngt)的