惡性實體瘤患者自體CIK細胞的體外擴增及初步臨床應(yīng)用

1、惡性實體瘤患者自體CIK細胞的體外擴增及初步臨床應(yīng)用惡性實體瘤患者自體CIK細胞的體外擴增及初步臨床應(yīng)用姓名：李燦班級：國貿(mào)1101學號：20111548【摘要】目的觀察惡性實體瘤患者外周血來源的細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞（CIK）在自體血漿中的增殖特性，回輸治療的安全性及近期療效。方法用淋巴細胞分離液分離獲取40例惡性實體瘤患者外周血單個核細胞，無血清培養(yǎng)基中添加rhIFN-卜Anti-CD3mAb和rhIL-2聯(lián)合誘導(dǎo)單個核細胞為CIK細胞。在培養(yǎng)第13天進行細胞計數(shù)，通過流式細胞術(shù)檢測細胞免疫表型，并將細胞進行自體回輸。結(jié)果40例惡性實體瘤患者回輸自體CIK細胞后，PR6例，MR13例，SD9

2、例，PD12例，治療總有效率為45%,臨床獲益率67.5%o多數(shù)患者一般情況明顯改善；治療后T細胞亞群中CD3+、CD4+細胞及CD4+心D8+比值及NK細胞計數(shù)較治療前顯著升高。治療過程中出現(xiàn)8例低熱，2例高熱，未觀察到其它明顯的毒副作用。結(jié)論惡性實體瘤患者自體血漿擴增CIK細胞，回輸治療安全有效，且無明顯的毒副作【關(guān)鍵詞】細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞；免疫治療；惡性腫瘤近年對惡性腫瘤的綜合治療方案在臨床上已得到廣泛認同。其中，細胞過繼免疫治療是將具有強大殺瘤活性的免疫細胞在體外擴增后回輸給患者的治療方法，已成為繼手術(shù)、放療、化療后對腫瘤患者進行綜合治療的重要手段之一。CIK細胞是在體外應(yīng)用多種細

3、胞因子和CD3mAb刺激誘導(dǎo)惡性腫瘤患者外周血單個核細胞而獲取的異質(zhì)細胞群，兼有T細胞強大的殺瘤活性和NK細胞的非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制的殺瘤特點，故又稱為NKT樣細胞。本研究通過在體外擴增40例惡性實體瘤患者外周血來源的CIK細胞，并進行自體回輸，探索惡性實體瘤患者自體CIK細胞臨床應(yīng)用的安全性及近期療效，為自體CIK細胞過繼免疫治療在臨床的推廣應(yīng)用積累一些有益經(jīng)驗。材料與方法臨床資料40例均為山東省千佛山醫(yī)院2007年1月至2008年12月住院的惡性實體瘤患者，所有病例均經(jīng)病理或細胞學檢查確診，分期nIV期。其中，男性22例，女性18例，年齡為3474歲。大腸癌8例，乳腺癌8例

4、，肺癌6例，肝癌6例，胃癌4例，腎透明細胞癌3例，口腔鱗癌2例，前列腺癌2例,卵巢癌1例。Kamofsky評分60分，預(yù)計生存期大于3個月，治療前心、肝、腎功能及血常規(guī)大致正常。末次化療時間距本次治療間隔1月以上，并排除心、肺、肝、腎功能不全者及對生物制品敏感者。所有患者或家屬均已簽署DC-CIK細胞治療知情同意書，并報醫(yī)院倫理委員會批準。并接受DC-CIK細胞治療。于2008年2月至2008年12月接受自體CIK細胞治療共1療程。1.2主要材料GT-T551無血清培養(yǎng)基（日本TAKARABIO公司），鼠抗人抗CD3單抗（古巴C12MABS.A公司）,DMEM培養(yǎng)基、Ficoll液、HEPES

5、液及PBS緩沖液（均為美國SIGMA公司），基因重組人干擾素Y（IFN-Y）（上海生物制品所），重組人白細胞介素2（IL-2）（山東泉港藥業(yè)有限公司），重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-4（購自廈門特保生物工程股份公司），本研究使用的雙色熒光抗體均是FITC和PE標記的鼠抗人單克隆抗體，包括CD3、CD4、CD8、CD56、CD80等（晶美生物工程有限公司）。流式細胞儀FACSCalibur（美國BD公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），正置及倒置顯微鏡（日本Olympus公司），體細胞治療實驗室為GMP實驗室，細胞培養(yǎng)操作在百級超凈工作臺進行。3CIK細胞的培養(yǎng)

6、細胞分離無菌條件下采集的正常人抗凝外周全血經(jīng)淋巴細胞分離液梯度離心獲取單個核細胞（PBMC,再用淋巴細胞分離液（Ficoll）分離后經(jīng)Hanks液洗滌3次,收集純度在90%（上的PBMCCIK細胞體外培養(yǎng)和擴增PBM（gHanks液洗滌3次，用GT-T551無血清培養(yǎng)基配成完全培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度1x106/ml,加至25cm細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37G5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h,吸出上清液及非粘附細胞另置75cm3細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入無血清培養(yǎng)基。第一天加入rh-干擾素r1000U/ml,第二天加入抗CD彈抗50ug/ml,IL-1a100U/ml,IL-21000U/ml,連續(xù)培養(yǎng)3d,更換含有上述

7、因子的培養(yǎng)液1次，連續(xù)培養(yǎng)14天。細胞回輸收集第1416d的DC-CIK細胞，細胞總數(shù)大于1X1010個，洗滌3次后，行細菌學、支原體及內(nèi)毒素等檢測無異常，將細胞溶于生理鹽水250ml，靜脈滴注,2小時內(nèi)回輸患者體內(nèi)。同時，自回輸前1天開始連續(xù)給予IL-2100萬U/天，肌注，1次/天，共5天。1.4臨床療效指標觀測患者一般情況、生活質(zhì)量的改善KPS平分；T細胞亞群和NK細胞計數(shù)檢測：在DC-CIK細胞回輸前及回輸后1月進行T細胞亞群和NK細胞計數(shù)測定，用堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶標注（APAAP測定；腫瘤標記物如CEACA125AFP等檢測；影像學指標：治療前及治療后1個月行胸、腹及盆部CT或

8、PETCT（正電子發(fā)射計算機斷層顯像儀）檢查復(fù)查對比評價療效；血常規(guī)、生化等常規(guī)檢查及不良反應(yīng)隨時觀察檢測。評定按WH翼體瘤的近期療效標7B分為完全緩解（CFR、部分緩解（PB、穩(wěn)定（SD、進展（PD4級。生活質(zhì)量變化：記錄患者癥狀和體征變化，用Kamofsky計分法判斷治療前及治療后的變化，凡在治療后療程開始前計分提高10分或10分以上者為改善，二下降10分或10分以上者為惡化，提高或下降10分者為穩(wěn)定?？偺岣呗蕿楦纳?穩(wěn)定。治療結(jié)束1月進行療效評價。學處理實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以.士s表不米用t或F檢驗。率的比較米用2檢驗，P0.05為差異有顯著性。結(jié)果1CIK細

9、胞的增殖情況CIK細胞在10%自體血漿中得到大量擴增。在倒置顯微鏡下，CIK細胞形態(tài)似外周血淋巴細胞，但體積稍大。在培養(yǎng)第13天，細胞數(shù)量有所減少。從第45天細胞開始增殖，可觀察到細胞體積增大，胞質(zhì)少、胞核大、圓。有時可觀察到細胞分離相和集落樣細胞團。在培養(yǎng)第7天，細胞數(shù)量明顯增多，細胞團更大，懸浮在培養(yǎng)液中（圖1）。在培養(yǎng)第13天，CIK細胞數(shù)量可達到原始細胞數(shù)的（30.05.2）倍。2.2療效觀察40例惡性實體瘤患者自體CIK細胞治療1療程后，CR0例，PR6例，MR12例，SD9例，PD13例。治療有效率（CR+PR+M昉45%臨床獲益率（CR+PR+MR+S）D為67.5%,見表1。4

10、0例患者的一般情況除3例未見明顯變化外，其余37例均有不同程度好轉(zhuǎn)，其中23例（57.5%）出現(xiàn)食欲和體力改善，17例（42.5%）出現(xiàn)睡眠改善，11例（27.5%）出現(xiàn)癌性疼痛減輕，7例（17.5%）出現(xiàn)體重增加。見表1表1CIK細胞治療40例惡性實體瘤的療效觀察臨床診斷例數(shù)CRPRMRSDPD大腸癌801223乳腺癌802303肺癌601221肝癌600204胃癌400220腎癌301110口腔鱗癌301010前列腺癌200110卵巢癌1000013治療前后免疫指標的變化經(jīng)CIK細胞治療1個療程后1月，患者T細胞亞群中CD8+H1(PV0.05),CD3+CD4鈿胞及CD4+/CD8+比值

11、及NK細胞計數(shù)較治療前顯著升高。見表2。表2CIK細胞治療前后惡性腫瘤患者免疫指標變化（n=40,土s）項目治療前治療后PCD3+59.827.3467.42+8.860.011CD4+28.245.6338.31+6.010.01CD8+30.37+8.8326.467.550.05CD4+/CD8+0.94+0.531.75+0.620.01NK13.47+4.2218.39+3.100.054CIK細胞回輸?shù)陌踩约安涣挤磻?yīng)在CIK細胞回輸治療期間，觀察到的不良反應(yīng)主要是畏寒、發(fā)熱。有8例患者體溫在37.037.9;有2例患者體溫在38.0C38.9C。常出現(xiàn)在回輸細胞后26h。持續(xù)35

12、h后，多數(shù)患者不經(jīng)處理可自行緩解，少數(shù)患者給予解熱鎮(zhèn)痛藥退熱。另外，有少數(shù)患者出現(xiàn)乏力、肌肉酸痛等類感冒癥狀。未觀察到低血壓、過敏及肺水腫等嚴重毒副反應(yīng)。治療前后肝、腎功能檢測均無明顯改變。所有患者均未出現(xiàn)移植物抗宿主反應(yīng)性疾病。討論腫瘤的生物治療是繼手術(shù)、放療、化療之后的第四種治療腫瘤的模式，過繼細胞免疫治療作為最有效的免疫治療措施之一，通過給患者提供現(xiàn)成的免疫力達到抑制和殺傷癌細胞，清除手術(shù)、化療、放療后微小殘留病灶及提高患者生存質(zhì)量，已成為目前治療惡性腫瘤的重要輔助治療方法。國內(nèi)外的研究證實CIK細胞是一類體外增殖能力強、殺瘤活性高，對多重耐藥腫瘤細胞敏感的廣譜抗瘤免疫活性細胞。我們觀察

13、到40例惡性實體瘤患者回輸自體CIK細胞后，6例部分緩解；13例好轉(zhuǎn)；9例病情穩(wěn)定；12例進展。治療總有效率為45%臨床獲益率67.5%。在治療過程中有8例病人出現(xiàn)畏寒、低熱,2例高熱，少數(shù)患者有乏力、肌肉酸痛等類感冒癥狀，未觀察到其它明顯的毒副作用這可能與回輸?shù)腃IK細胞在體內(nèi)繼續(xù)分泌IL-2、IFN-T、IL-6、GM-CSFTNF等多種具有抗腫瘤效應(yīng)的細胞因子有關(guān)。CIK細胞是一類以CD3+CD16+CD56+主的異質(zhì)細胞群。國內(nèi)外的研究表明，細胞因子IFN-丫、IL-1、Anti-CD3mAbIL-2、IL-7、IL-12、IL-15等的不同組合可誘導(dǎo)單個核細胞為CIK細胞10。本研究

14、在含10%自體血漿的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中添加rhIFN-丫、rhIL-2和Anti-CD3mAb聯(lián)合誘導(dǎo)惡性實體瘤患者外周血來源的單個核細胞生成CIK細胞。在健康狀況下，外周血CIK細胞大約為1%-5%而我們的結(jié)果提示，在培養(yǎng)第13天，CIK細胞數(shù)量增加(30.05.2)倍。CD3并口CD3+CD16+CD56+I擴增至1J(93.06.1)%和到(25.812.2)%,構(gòu)成CIK細胞發(fā)揮強大殺瘤效應(yīng)的基礎(chǔ)。在研究中發(fā)現(xiàn)CIK細胞的數(shù)量和純度在個體間的差異較大，可能與外周血原始T細胞的數(shù)量及機體免疫抑制狀態(tài)有關(guān)?；颊呓?jīng)治療后臨床癥狀如倦怠乏力、失眠、食欲不振等均有十分明顯的改善，采用

15、Karnofsky評定法和治療前后體重的改變兩項指標評估了患者的生存質(zhì)量，治療后Karnfsky評分平均提高15分左右,體重較前增加1.5kg。表明，經(jīng)系統(tǒng)綜合治療后患者生存質(zhì)量有了明顯好轉(zhuǎn)。自體CIK細胞治療可以明顯提高CD3T細胞和NK細胞的比例(P0.01),緩解CD4/CD8勺免疫倒置(P0.01),增強患者的細胞免疫功能，這對于經(jīng)常規(guī)治療后免疫功能極其低下的腫瘤患者來說具有重要意義。明經(jīng)CIK細胞治療，大多數(shù)患者的生活質(zhì)量明顯改善。目前這這些患者病情穩(wěn)定，但自體CIK治療的遠期療效及其對患者生存期的影響，仍需長期連續(xù)隨訪.附：典型病例患者，男，90歲，因反復(fù)咳嗽、喘息20年，多次收住

16、我院保健科。2006年6月CT發(fā)現(xiàn)肺癌(右肺后段肺癌，肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，采取體細胞治療6次，2008年8月份復(fù)查CT,肺內(nèi)腫塊明顯的縮小(80%。2008年12月復(fù)查發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)占位消失，縱隔占位明顯的縮小。【參考文獻】1HOFFMANTDM,GITLITZBJ,BELLDEGRUNAetal.AdoptivecellulartherapyJ.SeminOncol,2000,27(2):221-233.2秦福麗.CIK細胞的特點及臨床應(yīng)用.國外醫(yī)學腫瘤學分冊,2004,31(11):824-826.3喬曉娟.CIK細胞抗腫瘤的研究進展.醫(yī)學綜述雜志,2004,12(10):711-713.4LINNYC,LAULC,HUIKM.Generationofcytokine-inducedkillercellsfromleukaemicsampleswithinvitrocytotoxicityagainstautologousandallogeneicleukaemicblastsJ.BrJHaematol,2002,116(1):78-86.5MARTENA,RENOTHS,VONLILIENFELDTOAL陵,tal.Enhancedlyticactivityofcytokine-in