Elisa實驗藥品步驟及相關(guān)材料資料講解

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。Elisa實驗藥品步驟及相關(guān)材料-本實驗室Elisa所需試劑器材1.試劑(1)包被緩沖液碳酸鹽緩沖液(PH9.60.05M)：Na2CO31.59gNaHCO32.93g加蒸餾水至1000ml作用：稀釋抗原（菌懸浮液）(2)洗滌緩沖液PBST(PH7.40.15M)：KH2PO40.2gNa2HPO412H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2gTween-200.050.5ml加蒸餾水至1000ml作用：洗滌(3)緩沖液PBS(PH7.40.15M)：KH2PO40.2gNa2HPO412H2O2.

2、9gNaCl8.0gKCl0.2g加蒸餾水至1000ml作用：制備封閉液(4)封閉液：牛血清白蛋白(BSA)0.1g，加緩沖液（PBS）至100ml或PBS加2BSA作用：封閉空隙(5)稀釋液：PBST加1牛血清白蛋白(BSA)作用：稀釋抗體及酶標抗體(5)HRP羊抗兔IgG一酶標抗體作用：結(jié)合抗體(6)底物緩沖液磷酸鹽檸檬酸(PH5.5):0.2MNa2HPO4(28.4g/L)25.7ml0.1M檸檬酸(19.2g/L)24.3ml蒸餾水50ml作用：制備TMB(7)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml底物緩沖液(PH5.5)10ml0.75H2O23

3、2l作用：顯色(8)終止液(2MH2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98)21.7ml作用：終止反應2.器材:聚苯乙烯塑料板(酶標板)96孔抗原制備：以平板劃線法將供試菌菌接種于普通營養(yǎng)瓊瓊脂培養(yǎng)基上，28培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)；5000rmin-1離心10min，棄上清；加入1%的甲醛于37滅活24h，通過菌落涂布法檢測滅活效果；5000rmin-1離心10min，棄上清，用麥氏比濁法，配制出濃度約為1109cellsmL-1的菌懸液作為免疫抗原?？寡逯苽洌嚎寡宀荒苤苯佑糜诎?，應先提取IgG。大量工作表明，只用硫酸銨沉淀就可以得到足夠純

4、度及高活性的IgG蛋白。其基本步驟如下：(1)取抗血清0.2ml；(2)加生理鹽水（0.85NaCl）0.3ml，混勻；(3)逐滴加入飽和(NH4)2SO40.5ml，充分振蕩混勻，4靜置1h；(4)10000rpm/min離心20min，棄上清；(5)加0.5ml生理鹽水重懸浮，混勻；(6)0.25ml飽和(NH4)2SO4，充分振蕩混勻，4靜置1h；(7)10000rpm/min離心20min，棄上清；(8)重復58步驟一次；(9)加生理鹽水0.5ml重懸浮，混勻；(10)生理鹽水中透析1224h；(11)在0.2MpH9.0硼酸緩沖液透析1224h；(12)分裝，即將使用時4保存，備用-

5、20保存。為最大限度保持抗體活性，整個過程應在4下進行。對于凍干抗血清或長時間保存的血清，將生理鹽水透析改為3MKCNS透析，促使聚合的多聚體解聚。硫酸銨法純化血清IgG粗品:取1份血清加入1份生理鹽水進行稀釋,邊攪拌邊加入2倍原血清體積的飽合硫酸銨,室溫放置30min,7000r/min離心30min;沉淀溶于原血清體積的生理鹽水中,加入1倍體積的飽合硫酸銨,室溫放置30min,重復第二步,將沉淀溶于1/10原血清體積的生理鹽水溶液中,在0.0175mol/LpH6.3PB緩沖液中透析至無NH4+為止。免疫血清效價的測定：采用試管凝集法測定抗血清的效價。ELISA檢測流程：用pH9.6的0.

6、05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋抗原，加入96孔聚苯乙烯酶標反應板孔內(nèi)，每孔100L，60烘干，用PBST緩沖液（注滿孔）洗滌3次；每孔加入300L2BSA-PBST封閉液，37封閉1h，PBST緩沖液洗滌3次；每孔加入100L適當稀釋的陽性血清和陰性血清，37反應1h，PBST緩沖液洗滌3次；每孔加入100L的羊抗兔IgG-HRP酶標抗體，37反應1h；PBST緩沖液洗滌3次；加新配制的TMB-H2O2底物溶液（臨用15分鐘內(nèi)），每孔100L，37避光反應20min；以50L2molL-1H2SO4終止反應；15分鐘內(nèi)用酶標檢測儀讀取OD450值，以判定結(jié)果?？乖罴寻粷舛群兔庖哐遄钸m稀釋

7、度的確定：棋盤法：將1x109CFUmL的菌體懸液梯度稀釋至lxl05CFUmL，使抗血清做1:2000、1：5000、110000、115000、120000稀釋。酶標抗體做1：1000稀釋，每個稀釋度包被3個孔，進行間接ELISA測定。以能產(chǎn)生OD450值為1.0左右，且PN值最大的為抗原抗體最佳稀釋度。酶標二抗最適稀釋倍數(shù)確定：在確定的抗原抗體最佳工作濃度下，將酶標二抗稀釋為1：l000、l：2000、l：5000、l：10000、1：200005個稀釋比試驗，依據(jù)其OD450值在1.0左右的選擇為最佳二抗稀釋比，且PN值最大為最佳稀釋度。硼酸緩沖液一般PH6.779.24A液：0.2m

8、ol/L硼酸0.05mol/LNaCl配方：硼酸:1.2368g，NaCl0.2925g,加蒸餾水至100mlB液：0.05mol/L硼酸鈉配方：硼酸鈉1.907g,加蒸餾水至100ml不同的PH值配方如下：PHA(ml)B(ml)PHA(ml)B(ml)6.779.70.38.415.54.57.099.40.68.515.05.57.369.01.08.604.56.07.608.51.58.694.06.07.788.02.08.843.07.07.947.52.58.982.08.08.087.03.09.111.09.08.206.53.59.24010.08.316.04.0透析袋

9、使用前處理：1.把透析袋剪成適當長度（10-20cm）的小段。2.在大體積的2%(W/V)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA(pH8.0)中將透析袋煮沸10分鐘。3.用蒸餾水徹底清洗透析袋。4.放在1mmol/LEDTA(pH8.0)中將之煮沸10分鐘。5.冷卻后，存放于4度，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時起取用透析袋是必須戴手套。6.用前在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出，將之清洗干凈。透析膜(前處理方法如下)：1.戴手套把透析膜剪成適當長度，浸在蒸餾水中15min泡軟。2.浸入10mM碳酸氫鈉中，并加熱至80，一邊攪拌至少30min。3.換到10mMNa2EDTA中浸泡30min，以新鮮的ED

10、TA同樣方法處理三次。4.再用80蒸餾水洗30min，然后換到20%酒精中，放在4冰箱中保存。方法一：1、把透析袋剪成適當長度（10-20cm）的小段。2、在大體積（500mL）的2%（W/V）的碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA.2Na(pH=8.0)中將透析袋煮沸10min。3、用蒸餾水徹底清洗透析袋。4、放在500mL的1mmol/LEDTA.2Na(pH=8.0)中將之煮沸10min。5、冷卻后，置于30或者50%的酒精中，放于4冰箱，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。從此時起取用透析袋必須戴手套。6、在使用前要用蒸餾水將透析袋里外加以清洗干凈。說明：透析液的配置：10gNaHCO3+18

11、6.6mgEDTA.2Na+500mL蒸餾水1mmol/LEDTA.2Na：即373.2mg/L方法二：可用沸水煮5至10分鐘，再用蒸餾水洗凈，即可使用。方法三：可先用50乙醇煮沸1小時，再依次用50乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA（pH=8.0）溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。說明：1.EDTA煮主要是為了除去生產(chǎn)時附著在透析袋上的金屬離子。2.透析袋的截留分子量3000kd。使用后的透析袋保存方法：1.用生理鹽水浸泡以去掉蛋白，并用蒸餾水清洗干凈，然后置于50乙醇中保存即可；2.用完以后,要徹底洗干凈,透析袋也可以保存在0.1%疊氮鈉（可防止微生物生長）里；0.

12、05%-0.1%疊氮鈉，或者1mMEDTA，或者50甘油中4度保存，公司的人建議前兩種保存比較好！3.使用后的透析袋洗凈后可存于4蒸餾水或者30%乙醇中，確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。若長時間不用，可加少量NaN2，以防長菌。從此時起取用透析袋必須戴手套。洗凈涼干的透析袋彎折時易裂口，用時必須仔細檢查，不漏時方可重復使用。實驗操作：1、取空白酶標板，于每孔中加入純化蛋白溶液100L，于振蕩器上震蕩混勻，用封口膜封蓋酶標板，室溫包被過夜。2、取下封口膜，棄去酶標板內(nèi)溶液，用洗劑液（1PBST）洗劑酶標板5次，最后一次吸干。每孔加入1%BSA封閉液100L，37封閉1h。3、取下封口膜，棄去酶標板內(nèi)

13、溶液，用洗劑液（1PBST）洗劑酶標板5次，最后一次吸干。每孔加入一抗血清100L，37封閉1h。4、取下封口膜，棄去酶標板內(nèi)溶液，用洗劑液（1PBST）洗劑酶標板5次，最后一次吸干。每孔加入酶標二抗兔抗羊IgG-HRP100L，37封閉1h。5、取下封口膜，棄去酶標板內(nèi)溶液，用洗劑液（1PBST）洗劑酶標板5次，最后一次吸干。每孔加底物A50L和底物B50L，震蕩混勻，室溫顯色1015min。6、每孔加入終止液50L，立刻在酶標儀450nm波長下讀取OD值。加樣孔OD值檢測血清其他血清陰性血清或未免血清（只加稀釋液或未免血清、酶標二抗，底物顯色液A、B及終止液）酶空白孔（只加酶標二抗，底物顯

14、色液A、B及終止液）底物空白孔（只加底物顯色液A、B及終止液）純空白孔（只加終止液）抗血清的純化(Purificationofantiserum)抗血清純化的目的是盡量除去抗血清中與目的抗體不相關(guān)的成分，以防止抗體外的其他血清成分對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。因此只能根據(jù)不同目的的要求，從抗血清中除去容易干擾的有關(guān)成分，或提取相應的免疫球蛋白。抗血清純化的方法主要有粗提法和精制法兩個過程。粗提法主要常用硫酸銨鹽析法，精制法分非特異性和特異性兩種類型。非特異性方法如葡聚糖凝膠過濾法、離子交換層析法，其方法均系基于蛋白質(zhì)分子的物理性質(zhì)。特異性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗體的特異性反應。一、鹽析法(Sa

15、ltfractionation)【實驗原理】蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中相對溶解度不同，血清球蛋白在一定濃度鹽溶液中易于沉淀，而白蛋白則不易沉淀，據(jù)此可將二者分離?！局饕噭┡c器材】1.飽和硫酸銨溶液取500ml蒸餾水加熱至7080，將400g硫酸銨溶于其中，攪拌20min，冷卻。待硫酸銨結(jié)晶沉于瓶底，其上清即為飽和硫酸銨。在使用前用28%氨水調(diào)pH7.0。2.兔血清(含抗體)。3.透析袋、離心機等?！静僮鞣椒ā?.用55%飽和硫酸銨提取血清中、球蛋白血清1份加生理鹽水1份混勻,然后逐滴加入飽和硫酸銨2份中,邊加邊攪拌,防止形成團塊降低沉淀物的特異性.混勻后靜置30min或置4冰箱過夜。低溫高速

16、10000/min離心10min，將上清液(含白蛋白)棄去，取沉淀物(含球蛋白)溶于少量生理鹽水中。2.用33%飽和硫酸銨提取球蛋白將上述提取物生理鹽水溶液2份加1份飽和硫酸銨。然后再10000/min離心，其余操作同上。3.按同樣方法用33%飽和硫酸銨再提取1次。4.將提取物裝入透析袋，在生理鹽水中透析，以除去其中所含的硫酸銨。放-20冰箱保存?！窘Y(jié)果判斷】用雙向免疫擴散法和免疫電泳法檢測抗體活性、效價和純度。【注意事項】1.用于鹽析的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鹽等，最常用的是硫酸銨，因為硫酸銨飽和溶液所含鹽濃度很高，溶解度受溫度影響小，一般不引起蛋白質(zhì)變性，但不純的硫酸銨

17、含重金屬，會影響蛋白質(zhì)生物活性，故應用分析純試劑。2.中性鹽濃度不同濃度硫酸銨，當達到20%飽和度時，可沉淀血漿中纖維蛋白原，增加飽和度至28%33%，可使優(yōu)球蛋白析出，當飽和度大于50%則可析出白蛋白。3.pH當溶液pH調(diào)至蛋白質(zhì)的等電點，使所帶陽電荷與陰電荷相等時，易使蛋白析出。球蛋白等電點為pH58。4.蛋白質(zhì)濃度如血清蛋白的濃度自0.5%遞增至3%時，所需中性鹽飽和度的最低極限度可從29%遞減至24%，但當?shù)鞍踪|(zhì)濃度增高后，蛋白質(zhì)的共沉作用也增加，影響蛋白質(zhì)純化，故當溶液內(nèi)蛋白質(zhì)濃度過高，可做適當稀釋，一般認為2.5%3.0%的蛋白濃度較好。5.溫度鹽析蛋白時溫度要求并不嚴格，一般在室

18、溫(25)比在0時更易析出，除非鹽析對溫度敏感的蛋白質(zhì)(如抗體)要求在4進行。6.透析除鹽透析液內(nèi)NH4+的檢測可用納氏試劑，如產(chǎn)生黃色沉淀證明NH4+的存在?！緫门c評價】經(jīng)鹽析法提取的蛋白質(zhì)為粗提的免疫球蛋白，若要獲得純化的免疫球蛋白，必須經(jīng)凝膠過濾或離子交換層析提純。【思考題】1.鹽析法粗提免疫球蛋白的原理是什么？2.鹽析法粗提免疫球蛋白有哪些注意事項？二、凝膠過濾法(Gelfiltration)【實驗原理】利用具有分子篩效應的多孔網(wǎng)狀凝膠做為介質(zhì)，可分離提純分子量不同的大分子物質(zhì)。在凝膠過濾過程中，分子量大的物質(zhì)因不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間空隙先流出凝膠柱外；分子量小的物質(zhì)因能進入

19、凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢而最后流出柱外，這樣就能將分子量不同的物質(zhì)分離?！局饕噭┡c器材】1.待提純樣品。2.SephadexG-200。3.2.5100mm層析柱。4.洗脫液0.01mol/LpH7.27.4PBS(含0.14mol/LNaCl)。5.751紫外分光光度計?！静僮鞣椒ā?.處理凝膠將SephadexG-200用蒸餾水竟充分膨脹后進行浮選。2.裝柱在層析柱底部鋪加一層尼龍紗，然后將洗脫液和凝膠粒子沿插入柱底的玻璃棒緩緩傾注于層析柱內(nèi)。3.加樣在凝膠柱表面再加一層尼龍紗，沿管壁緩緩加入樣品，所加樣品體積不超過凝膠柱的10%。4.洗脫洗脫液洗脫，流速20ml/h。待樣品洗脫下來(

20、用20%磺基水楊酸檢測)即用試管分段收集。5.檢測在紫外分光光度計上測定各管樣品的A280nm值?！窘Y(jié)果判斷】以A280nm值為縱軸，收集管次序為橫軸，繪出各洗脫峰，并分別收集各峰的洗脫液，再分別進行蛋白質(zhì)定量與性質(zhì)和純度的鑒定。用已知標準抗體，采用雙向瓊脂擴散試驗、免疫電泳法鑒定蛋白質(zhì)性質(zhì)和純度?！咀⒁馐马棥?.膨脹凝膠時，需將凝膠干粉慢慢加入到盛有10倍水的燒杯內(nèi)，邊加邊用玻璃棒輕輕攪動，待被浸泡膨脹的凝膠粒沉下，傾去上層水份及內(nèi)含的細顆粒，換蒸餾水數(shù)次，浸泡過程攪動要溫和輕慢，以免損壞凝膠顆粒，裝柱前一定要達到充分膨脹并換洗脫緩沖液(PBS)再平衡，換PBS23次，待裝柱用。2.一般常用

21、的洗脫緩沖液pH和離子強度以能使樣品穩(wěn)定為原則。血清蛋白成分的分離純化，多采用pH6.98.0之間磷酸鹽緩沖液或pH8.0Tris-HCl緩沖液。3.樣品洗脫結(jié)束后，凝膠即已再生。依次裝柱可反復使用多次。凝膠懸液加防腐劑后于4冰箱內(nèi)可保存數(shù)月?！緫门c評價】凝膠過濾法廣泛應用于生物高分子的蛋白質(zhì)、酶、核算等的分離和提純；凝膠過濾法還可用來測定蛋白質(zhì)分子量，需取已知分子量樣品作為標準對照；血清中存在異常免疫球蛋白，經(jīng)凝膠過濾得到與正常人不同的峰形?！舅伎碱}】凝膠過濾法純化抗體的原理是什么？三、離子交換層析法(Ionexchangechromatography)【實驗原理】離子交換層析是從血清包括

22、抗血清中分離純化IgG的重要方法。它是利用帶電離子的纖維素(如DEAE纖維素)，吸附帶相反電荷的蛋白質(zhì)，又因各種蛋白質(zhì)的等電點不盡相同，在一定pH條件下，所帶電荷量不等，與纖維素結(jié)合的能力有別。當用pH7.4磷酸緩沖液(PB)洗脫時，人血清蛋白中IgG所帶電荷最少，與纖維素結(jié)合最差，故最先被洗脫下來，從而可達到分離純化目的。【主要試劑與器材】1.蒸餾水、0.5mol/LNaOH、0.01mol/LpH7.4PBS、20%三氯醋酸。2.混合正常人血清、DEAE纖維素。3.層析柱、燒杯、pH試紙?！静僮鞣椒ā?.用蒸餾水浸泡適量DEAE纖維素過夜，除去飄浮物，再用0.5mol/LNaOH浸泡30m

23、in，反復用蒸餾水洗，可用2000r/min離心或布氏漏斗抽濾分離，直到洗至約pH7.4，用0.01mol/LpH7.4PBS再洗一次后裝柱。2.用相同的PBS平衡至pH7.4，當柱上端的PB液凹面與纖維素相切時，加入一定量的血清，待血清滲入柱內(nèi)與柱面相切時，立即沿管壁加少量洗脫液至形成1cm液層后，用0.01mol/LPBS洗脫，控制流速為1ml/min。3.分管收集,每管吸取少量洗脫液，加20%三氯醋酸測蛋白，合并、保留蛋白含量較高的洗脫液。4.將含IgG的洗脫液裝入透析袋內(nèi)，用蔗糖或大分子聚乙二醇包埋過夜，水份析出，袋內(nèi)IgG被濃縮。IgG可短期保存于4冰箱中備用?！窘Y(jié)果判斷】用單向免疫擴散試驗測定濃縮液IgG含量，用抗人全血清作免疫電泳測定純度，如純化成功，應只在IgG部位出現(xiàn)沉淀線?！咀⒁馐马棥?.纖維素裝柱時，不能出現(xiàn)斷層、氣泡，柱面要平整。2.緩沖液平衡要充分。3.加血清量不宜過多?！緫门c評價】該方法是目前最廣泛應用的高分子物質(zhì)提純方法之一?？侷gG或特異性IgG均可用本法純化。