第10章遺傳工程

1、第10章遺傳工程第一節(jié) 遺傳工程的概念遺傳工程(Genetic engineering):一般認(rèn)為,遺傳工程是按照人們預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖,將一種生物的遺傳物質(zhì)繞過有性周期導(dǎo)入另一種生物中去,使其獲得新的遺傳性狀,形成新的生物類型的遺傳操作。遺傳工程有狹義和廣義之分，廣義的遺傳工程包括細(xì)胞工程和基因工程；狹義的遺傳工程就是基因工程。第二節(jié) 動物細(xì)胞工程細(xì)胞工程：是利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，在細(xì)胞水平上進(jìn)行的遺傳操作。分為微生物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程和動物細(xì)胞工程。一、細(xì)胞融合二、動物克隆技術(shù)一、細(xì)胞融合 1、細(xì)胞融合：也稱體細(xì)胞雜交，是一種在同種或不同物種體細(xì)胞間，在融合劑存在的條件下，自然

2、的或人工的細(xì)胞水平的雜交過程，獲得的雜種細(xì)胞具有雙親的遺傳屬性。2、細(xì)胞融合過程：兩個(gè)細(xì)胞緊密接觸細(xì)胞膜合并細(xì)胞間出現(xiàn)通道或細(xì)胞橋細(xì)胞橋數(shù)增加擴(kuò)大通道面積兩細(xì)胞融合為一體。二、動物克隆技術(shù) 1997年英國科學(xué)家Wilmut克隆羊的成功標(biāo)志動物克隆技術(shù)新的里程碑?？寺〉幕靖拍睿嚎寺∫庵笩o性繁殖（系），可分為三個(gè)層次：基因、細(xì)胞、個(gè)體 個(gè)體克隆可分為植物克隆和動物克隆。 植物體幾乎所有的體細(xì)胞都能在體外培養(yǎng)成新的完整植株，單個(gè)性細(xì)胞（如花粉和未受精的子房培養(yǎng)）也能未經(jīng)兩性結(jié)合而發(fā)育成新植株。動物克隆技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷從胚胎細(xì)胞的克隆到體細(xì)胞克隆的過程。胚胎細(xì)胞克隆是指將胚胎細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞

3、中，由于胚胎細(xì)胞的全能性，它比較容易經(jīng)培養(yǎng)和移植獲得基因相同的個(gè)體。由于該技術(shù)產(chǎn)生的新個(gè)體并非是親代的自我復(fù)制，而是等同于多生了幾個(gè)雙胞胎，并未引起世人注意。體細(xì)胞克隆可達(dá)到親代個(gè)體的自我復(fù)制。 核移植技術(shù)動物克隆技術(shù)并不是象植物那樣從體細(xì)胞直接發(fā)育成新的個(gè)體，而是要將供體復(fù)制對象的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中才能實(shí)現(xiàn)。由于體細(xì)胞包含有全部的遺傳信息，從體細(xì)胞獲得完整的動物個(gè)體是完全可行的。動物體細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞，克隆羊“多莉”的誕生說明動物體細(xì)胞也具有全能性，因此它是真正意義上的動物克隆。動物克隆的基本過程 以克隆羊?yàn)槔?，動物克隆的基本過程如下圖 1動物資源的種質(zhì)保存包括地球上頻危動

4、物的挽救等。2生產(chǎn)移植器官，培育優(yōu)良品種，與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合研制生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因藥物。3克隆人。是全世界注目的焦點(diǎn)，有人設(shè)計(jì)了克隆人的技術(shù)路線 動物克隆的應(yīng)用： 動物克隆的危險(xiǎn)性：1克隆動物已出現(xiàn)廣泛的免疫缺陷或早期夭亡。2克隆動物過程中也極有可能產(chǎn)生遺傳性的變異（無性系變異），這在植物的克隆中已廣泛得到研究和驗(yàn)證，會發(fā)生染色體變異，基因組DNA擴(kuò)增和某些轉(zhuǎn)位因子的激活。3克隆人不但面臨社會、家庭倫理道德問題，也將面臨健康安全問題。第三節(jié) 基因工程利用轉(zhuǎn)基因手段對生物進(jìn)行人為改造的技術(shù)一、目的基因的獲得二、工具酶和載體三、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用一、目的基因的獲得（一）目的基因的獲得 1、從基因文庫

5、分離基因基因（組）文庫：某一生物的全部DNA序列的不同DNA片段所構(gòu)成的群體，即克隆某種生物全部基因（99%）的總和。包含外顯子和內(nèi)含子。cDNA文庫：由某一生物特定器官或特定發(fā)育階段的細(xì)胞內(nèi)總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)cDNA分子，其所構(gòu)建的重組DNA克隆群體，即具有表達(dá)功能外顯子序列的總和。2、化學(xué)合成基因3、PCR法PCR（polymerase chain reaction,聚合酶鏈反應(yīng))：體外有引物介導(dǎo)的特定DNA序列的酶擴(kuò)增。PCR技術(shù)的原理：利用DNA本身的特性，變性與復(fù)性,以達(dá)到擴(kuò)增DNA分子的目的。PCR反應(yīng)條件（反應(yīng)體系組成）：模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、緩沖液、滅

6、菌水、石蠟油。 PCR原理PCR原理二、工具酶、載體和宿主工具酶A. 剪切酶類有目的有選擇的把目的片段切開B. 連接酶類將目的片段和載體相連C. 其他工具酶修飾, 加工等作用限制性內(nèi)切酶II及其產(chǎn)生的3種不同末端5突出的粘性末端3突出的粘性末端平末端EcoR IEcoR VPst IPPPPPP同切酶和同粘酶同切酶: 識別相同的位點(diǎn), 但生成不同的末端.同粘酶: 識別不同的位點(diǎn), 但產(chǎn)生相同的粘性末端Sma I 5 . C C CG G G . 3 3 . G G GC C C . 5 Xma I 5 . C C CG G G . 3 3 . G G GC C C . 5 同切酶BamH I

7、5 . GG A T C C . 3 3 . C C T A GG . 5 Bgl II5 . AG A T C T . 3 3 . T C T A GA . 5 同粘酶Sau3A5 . G A T C . 3 3 . C T A G . 5 連接酶及其對底物的要求:T4 Ligase, Ecoli Ligase底物:自由5末端和自由3末端, 5末端帶磷酸基團(tuán)反應(yīng)條件：Mg+，ATP存在聚合酶(polymerase): DNA聚合酶I, klenow片段, Taq, Pfu, 末端轉(zhuǎn)移酶外切核酸酶(exonuclease): exo III, S1核酸酶, DNase I脫磷酸酶(dephos

8、phatase): 堿性磷酸酯酶CIP磷酸化酶,激酶(kinase)逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)RNase H, RNase A甲基化酶(methylase)其它工具酶載體及其構(gòu)成基本要素能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定傳代:復(fù)制起始點(diǎn)ori或自主復(fù)制序列ARS和著絲粒, 端粒方便插入外源片段: 單酶切位點(diǎn)選擇標(biāo)記: 藥物抗性報(bào)告基因: 插入篩選標(biāo)記易分離提取高產(chǎn)率（多拷貝）強(qiáng)啟動子多宿主常用載體 質(zhì)粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌體，噬粒(phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC特殊用途的載體表達(dá)型載體， 分泌型載體，穿梭載體宿主繁殖快, 易于培養(yǎng), 能夠

9、快速得到產(chǎn)物對所攜帶基因的表達(dá)產(chǎn)物具有較高耐受性, 具有克隆最多種基因的可能 突變率低, 能夠穩(wěn)定忠實(shí)的保存被克隆基因常用宿主大腸桿菌: 繁殖快, 易培養(yǎng), 易分離產(chǎn)物噬菌體: 轉(zhuǎn)化效率高, 易于保存酵母: 繁殖最快的真核生物, 適于有蛋白質(zhì)加工 的基因表達(dá)lacZ 三、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用 利用基因工程技術(shù)不但能得到大量的具有特殊功能的基因。而且可以讓這些特殊功能的基因生產(chǎn)出具有特殊功能的蛋白質(zhì)藥物，這是目前基因工程 領(lǐng)域中最活躍最有成果和極富商業(yè)價(jià)值的領(lǐng)域之一，究其原因： （1）蛋白質(zhì)和多肽是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，可用重組DNA技術(shù)進(jìn)行研究和生產(chǎn)。 （2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高

10、醫(yī)療價(jià)值的藥物，用常規(guī)分離的方法很難制取。一、利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物 目前有幾十種基因工程藥物，常用的有：干擾素、白細(xì)胞介素、乙肝疫苗、人胰島素和人生長激素等。 人類最早的商業(yè)化基因工程藥物是人胰島素和人生長激素，于80年代初投放市場，用大腸桿菌來生產(chǎn)，是基因工程 發(fā)展的里程碑。 胰島素是治療糖尿病的重要藥物，之前從豬或牛的胰腺中提取分離，含量少而且會有毒素。 人生長激素是治療侏儒癥，青少年增高和促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)的藥物，生長激素具有種屬特異性，從動物腦組織來源的生長激素不能用于人類，之前只能從剛死亡的人大腦垂體中分離純化，來源極有限；而且發(fā)現(xiàn)長期應(yīng)用會對人類有毒副作用。該方法用

11、于合成人胰島素 19-15二、用真核細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)基因工程藥物 雖然用大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)基因工程藥具有許多優(yōu)點(diǎn)，如成本低等，但由于原核系統(tǒng)表達(dá)的真核基因蛋白有時(shí)缺乏生物活性，其原因由于原核生物缺乏合適的轉(zhuǎn)譯后修飾機(jī)制。因此用真核細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)基因工程藥物已受到重視。 真核細(xì)胞反應(yīng)器： 外源基因在合適的載體帶動下轉(zhuǎn)染進(jìn)入體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞，通過大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)外源基因。幾種重要的基因工程藥物已可用真核細(xì)胞反應(yīng)器完成治療癌癥抗病毒預(yù)防病毒性肝炎治療血友病治療貧血癥治療心臟病促生長，增強(qiáng)免疫功能 酵母菌酵母菌哺乳動物細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞昆蟲細(xì)胞 干擾素乙肝疫苗集落刺激因子紅細(xì)胞生成素組織溶纖酶