細(xì)胞凋亡分析課件

1、細(xì)胞凋亡outline1.細(xì)胞凋亡簡介 2.細(xì)胞凋亡檢測方法3.死亡受體通路4.線粒體通路細(xì)胞凋亡簡介細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的概念細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義細(xì)胞凋亡的形態(tài)及生化變化細(xì)胞凋亡的分子機制細(xì)胞凋亡與疾病細(xì)胞凋亡的檢測方法一、細(xì)胞凋亡的概念和特征1.什么是細(xì)胞凋亡？ Apoptosis的概念來自于希臘語，原意是指樹葉或花瓣的脫落、凋零，而細(xì)胞發(fā)生凋亡時，就像樹葉或花的自然凋落一樣，凋亡的細(xì)胞散在于正常組織細(xì)胞中，不影響其他細(xì)胞的正常功能。 其生物學(xué)意義在于強調(diào)這種細(xì)胞的死亡方式是自然的生理學(xué)過程，是受基因調(diào)控的主動的生理性細(xì)胞自殺行為。 一、細(xì)胞凋亡的概念2.細(xì)胞凋亡的過程 1.凋亡的起始：細(xì)胞表

2、面特化結(jié)構(gòu)消失、核糖體逐漸與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫離、染色質(zhì)固縮 2.凋亡小體的形成：和染色質(zhì)斷裂成片段，被反折的細(xì)胞質(zhì)膜包圍，形成凋亡小體 3.凋亡小體被吞噬，凋亡細(xì)胞的殘余物質(zhì)被消化后重新利用 細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞質(zhì)膜始終保持完整，細(xì)胞內(nèi)含物不發(fā)生細(xì)胞外泄露，不引發(fā)機體的炎癥反應(yīng)。一、細(xì)胞凋亡的概念3. 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別細(xì)胞壞死（necrosis）：細(xì)胞受到劇烈的物理、化學(xué)刺激或嚴(yán)重的病理性刺激后，引起的細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡是“主動的自殺”行為，而細(xì)胞壞死是“被動的自殺”行為！細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別特點細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死形態(tài)學(xué)方面： 細(xì)胞體積萎縮，與周圍細(xì)胞分離腫脹 細(xì)胞膜膜發(fā)泡，通透性正常，PS

3、外翻完整性破壞，通透性增加 細(xì)胞器完整損傷 細(xì)胞核先固縮，后降解溶解 溶酶體完整裂解 線粒體濃縮，跨膜電位受損，cytoC釋放腫脹，破壞，能量生成受損生物化學(xué)方面： DNA核小體間剪切非特征性剪切 蛋白質(zhì)Caspase活化非特征性降解 組織分布單個細(xì)胞細(xì)胞群體 結(jié)局被吞噬細(xì)胞吞噬，不引起炎癥反應(yīng)釋放細(xì)胞碎片，引起炎癥反應(yīng)二、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義細(xì)胞凋亡現(xiàn)象普遍存在于人類和多種動植物種，是多細(xì)胞生物體個體正常發(fā)育、維持成體組織結(jié)構(gòu)不可缺少的部分，貫穿于生物全部的生命活動中。生理狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡病理狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡1.1 在發(fā)育過程中清除多余的細(xì)胞手指的形成1.2 清除已經(jīng)完成功能的細(xì)胞蝌蚪發(fā)育成

4、蛙1.3 清除發(fā)育不正常的細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞體神經(jīng)細(xì)胞軸突靶細(xì)胞靶細(xì)胞釋放的生長因子凋亡的神經(jīng)細(xì)胞二、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義2. 病理狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡DNA損傷：射線、細(xì)胞毒抗癌藥等；錯誤折疊蛋白的積累：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫；病毒感染：HIV；唾液管阻塞導(dǎo)致實質(zhì)器官萎縮：胰腺、腎等。三、細(xì)胞凋亡的形態(tài)及生化變化1.形態(tài)學(xué)特征： 胞膜完整，外形發(fā)泡狀，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞器緊聚。染色體緊縮呈月牙狀，凝聚在核膜周圍。形成膜包的凋亡小體(apoptotic body)，被附近的細(xì)胞或巨噬細(xì)胞(M)吞噬消化清除。細(xì)胞凋亡可發(fā)生在正常細(xì)胞群中的單個細(xì)胞。2.生化特征：胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高。細(xì)胞內(nèi)活性氧增多。質(zhì)膜通透性變大。D

5、NA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段。型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和需鈣蛋白酶（Calpain）、半胱天冬蛋白酶（caspases）活性升高。磷脂酰絲氨酸（PS）外翻。四、細(xì)胞凋亡的分子機制細(xì)胞凋亡的起始階段由兩條信號通路介導(dǎo)：內(nèi)源性（線粒體）凋亡通路The Intrinsic (Mitochondrial) Pathway of Apoptosis外源性（死亡受體）凋亡通路The Extrinsic (Death Receptor-Initiated) Pathway of Apoptosis 五、細(xì)胞凋亡與疾病細(xì)胞凋亡是機體維持自身穩(wěn)定的一種生理機制。機體

6、通過細(xì)胞凋亡清除損傷、衰老與突變的細(xì)胞，維持生理平衡。某些致病因子可使細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控失常，致使細(xì)胞凋亡減弱或增強，從而破壞了機體細(xì)胞的自穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。凋亡過低導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生：腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。凋亡過度導(dǎo)致機體免疫功能喪失或引發(fā)相關(guān)的疾?。荷窠?jīng)退行性疾病、AIDS病和心血管病等。腫瘤的發(fā)生環(huán)境中的DNA損傷物質(zhì)正常細(xì)胞癌基因活化抑癌基因失活凋亡相關(guān)基因改變增殖失調(diào)凋亡減少腫瘤發(fā)生六、細(xì)胞凋亡的檢測方法檢測細(xì)胞凋亡的方法很多，可歸納為三類：（一）形態(tài)學(xué)方法（二）生化特征檢測（三）流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡檢測方法細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征1形態(tài)學(xué)變化 形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的變化是

7、多階段的，細(xì)胞凋亡往往涉及單個細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180bp-200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體，無內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1） 未染

8、色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2） 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。Hoechst是與

9、DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為25mg/ml。DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 1mg/ml。結(jié)果評判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；b期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1)。3 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)

10、許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微

11、鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。三、線粒體膜勢能的檢測線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rho

12、damine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。方法：將正常培養(yǎng)的細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37C平衡30min，流式細(xì)胞計檢測細(xì)胞的熒光強度。注

13、意事項1 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。2 與染料達到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。2生物化學(xué)變化（1）DNA的片段化 細(xì)胞凋亡的一個顯著特點是細(xì)胞染色體的DNA降解，這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的DNA片段約為180-200bp的整倍數(shù)，而這正好是纏繞組蛋白寡聚體的長度，提示染色體DNA恰好是在核小體與核小體的連接部位被切斷，產(chǎn)生不同長度的寡聚核小體片段。 實驗證明，這種DNA的有控降解是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用的結(jié)果，該酶在核小體連接部位切斷染色體DNA，這種降解表現(xiàn)在

14、瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜。2） 大分子合成 細(xì)胞凋亡的生化改變不僅僅是DNA的有控降解，在細(xì)胞凋亡的過程中往往還有新的基因的表達和某些生物大分子的合成作為調(diào)控因子。四、DNA片斷化檢測細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50300kbp長的DNA大片段, 或180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。方法：細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很

15、少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。2 凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計分析方法：收集細(xì)胞，70%冷乙醇（in PBS）4C固定過夜，PBS洗滌，1000rpm10min RNase A（0.5mg/ml）37C消化30min PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min，F(xiàn)ACScan分析DNA亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化。五、Caspase-3活性的檢測Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號

16、傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。方法：收集細(xì)胞PBS洗滌抽提細(xì)胞裂解液蛋白定量SDS電泳硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移5%脫脂奶粉封閉，室

17、溫1.52h或4C過夜Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)12h或4C過夜TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，510min/次HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)12h TBS-T洗3次， 510min/次?ECL顯影或NBT/BCIP顯色。熒光分光光度計分析原理： 活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點，設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspa

18、se-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。方法：收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞，PBS洗滌，制備細(xì)胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37C反應(yīng)1h，熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發(fā)光波長380nm，發(fā)射光波長為430-460nm）。六、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達和細(xì)胞定位分析TFAR19（PDCD5）是促進細(xì)胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細(xì)胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化，持續(xù)較長

19、時間，在凋亡小體中仍然可見。凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。死亡受體通路細(xì)胞凋亡死亡受體通路1.通過胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶caspases的細(xì)胞凋亡通路,稱為死亡受體通路。2. 參與基因包括腫瘤壞死因子TNF-、白細(xì)胞介素（IL） 、造血集落刺激因子及某些激素類、腺苷酸類似物等。3.最終激活凋亡酶caspases

20、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TNF-1.當(dāng)Fas被激活后， Fas間因為DD的趨同性而聚集成三聚體，F(xiàn)ADD一方面可以結(jié)合在三聚體的DD上，另一方面又可以在DED的趨同性作用下和TNFR1及caspase8結(jié)合在一起，活化的caspase8再激活下游的caspase，完成級聯(lián)反應(yīng)，通過水解作用使細(xì)胞蛋白大量解體，啟動細(xì)胞凋亡。2. TNF-可通過激活Fas或TNFR1，使細(xì)胞產(chǎn)生活性氧中間產(chǎn)物（ROI，過氧化氫，氨基化合物等）， ROI含量過高直接使DNA發(fā)生斷裂，促進NF-k的活化，啟動死亡基因的表達。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡1.糖皮質(zhì)激素可以是細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活鈣離子或鎂離子依賴性核酸酶，使核

21、小體連接部分的DNA發(fā)生斷裂。2.升高的鈣離子濃度也能激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，促進細(xì)胞質(zhì)蛋白與細(xì)胞膜蛋白間的交聯(lián)，增強包膜的抗溶解能力，使細(xì)胞膜完整性得以維持，因此也沒有發(fā)生炎癥反應(yīng)。（一)凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn)：包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜活化，細(xì)胞皺縮，凋亡小體。激活蛋白激酶破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能 (二）破壞細(xì)胞抗凋亡因素（1）激活蛋白激酶： including FAK, PKC, and Raf1. FAK disrupt cell adhesion for the apoptotic cell.（2）破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)actin, and gelsilin.

22、Cleavage and inactivation of these proteins lead to changes in cell shape. Caspase的效應(yīng)機制死亡受體家族死亡受體外源性，死亡受體凋亡通路配體/受體結(jié)合起始者caspase-8自激活執(zhí)行者caspase激活凋亡細(xì)胞凋亡線粒體通路一段視頻Apoptosis and Signal Transduction - DnaTubecom /video/5714/Apoptosis-and-Signal-Transduction線粒體是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器，是動物細(xì)胞生成ATP的主要地點。線粒體基質(zhì)的三羧酸循環(huán)酶系通過底物脫氫氧化生成NADH。NADH通過線粒體內(nèi)膜呼吸鏈氧化。與此同時，導(dǎo)致跨膜質(zhì)子移位形成跨膜質(zhì)子梯度和/或跨膜電位。線粒體內(nèi)膜上的ATP合成酶利用跨膜質(zhì)子梯度能量合成ATP。合成的ATP通過線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體與細(xì)胞質(zhì)中ADP交換進入細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞的各種需能過程。線粒體跨膜電位線粒體跨膜電位的耗散與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系近年來陸續(xù)有報道說明線粒體跨膜電位的耗散，會使細(xì)胞進入不可逆的凋亡過程。線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內(nèi)膜的通透性轉(zhuǎn)變，這是由于生成了通透性轉(zhuǎn)變孔道（PT孔道），PT孔道是由多個蛋白質(zhì)組成的，位于線粒體內(nèi)膜與外膜接觸位點。P