《生物化學(xué)》本科課件第14章+核酸物理化學(xué)性質(zhì)

1、第14章 核酸物理化學(xué)性質(zhì)一、核酸的水解 酸、堿、酶水解作用于磷酸二酯鍵和糖苷鍵DNA/RNA對(duì)酸/堿的耐受程度有差別糖苷鍵比磷酸酯鍵更易被酸水解；嘌呤堿比嘧啶堿的糖苷鍵對(duì)酸更不穩(wěn)定；對(duì)酸最不穩(wěn)定的：嘌呤與脫氧核糖間糖苷鍵（一）酸水解DNA:pH2.8、100加熱1h，或pH1.6，37 對(duì)水透析可除去嘌呤堿形成無嘌呤酸（apurinic acid，APA）（二）堿水解RNA磷酸酯鍵被水解生成2/3 -核苷酸DNA則不受影響脫氧核糖無2OH，不能形成堿水解中間產(chǎn)物DNA在1mol/LNaOH中加熱至1004h，可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。（三）酶水解磷酸二酯鍵1、酶分類 根據(jù)底物分為： DN

2、ase、RNase 根據(jù)作用方式：核酸外切酶 從一端（3/5）逐個(gè)水解核酸內(nèi)切酶 從中間開始在某個(gè)位點(diǎn)切斷按照作用的化學(xué)鍵 磷酸二酯酶（phosphodiesterase） 斷3-OH形成的酯鍵 5-磷酸核苷 斷5-OH形成的酯鍵 3-磷酸核苷 磷酸單酯酶（phosphomonoesterase） 切去核酸分子末端磷酸基 及核苷酸的磷酸基其它：對(duì)底物二級(jí)結(jié)構(gòu)的專一性 雙鏈酶：作用于雙鏈核酸 單鏈酶：作用于單鏈核酸+PyPyPyPyPyPyPuPuPPPPPPPPPP2H2O2、RNase （1）牛胰核糖核酸酶（RNase ）作用：嘧啶核苷3磷酸與其它核苷酸連鍵 專一性極高的內(nèi)切酶產(chǎn)物： 3嘧啶

3、核苷酸/其結(jié)尾的寡核苷酸PPPPPPP2H2OPP+OHOHPPPPPGAGAAAGGCUUC （2）核糖核酸酶T1 （RNase T1）作用：3鳥苷酸與相鄰核苷酸5OH連鍵產(chǎn)物：3鳥苷酸或以其為末端的寡核苷酸（3）核糖核酸酶T2 （RNase T2 ） 作用位點(diǎn)為Ap殘基 可將tRNA完全降解為3腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸DNase：牛胰脫氧核糖核酸酶 Mg2+激活、檸檬酸鹽抑制 切斷雙鏈或單鏈DNA 以5磷酸為末端的寡聚核苷酸 DNase ：牛脾脫氧核糖核酸酶 Na+激活；Mg2+抑制 3磷酸為末端的寡聚核苷酸，平均長(zhǎng)度為6核苷酸。3、DNase鏈球菌脫氧核糖核苷酸酶： 內(nèi)切酶，作用于DNA，

4、Mg2+激活 產(chǎn)物為5磷酸為末端的碎片，長(zhǎng)度不一。限制性內(nèi)切酶(細(xì)菌) 主要降解外源DNA 具嚴(yán)格的堿基序列專一性是基因工程最重要的工具酶。 EcoR命名原則 E：大腸桿菌E.coli屬名 co：種名的頭兩個(gè)字母 R：大腸桿菌的菌株 ：該細(xì)菌中已分離出的這類酶的編號(hào)例如EcoR I ，需Mg離子，不需ATP，專一性強(qiáng)，能識(shí)別DNA鏈上6個(gè)堿基組成的回文序列，交錯(cuò)切割，形成粘性末端產(chǎn)物。GAATTC CTTAAG GCTTAAAATTC G限制性內(nèi)切酶通常與甲基化酶成對(duì)存在：具有相同的底物專一性，識(shí)別相同堿基序列。 甲基供體：S腺苷甲硫氨酸 甲基受體：DNA上的A與C甲基化使細(xì)菌自身的DNA帶上

5、標(biāo)記,限制性內(nèi)切酶專用于降解外來入侵的異種DNA 非特異性的糖苷酶 堿基特異N糖苷酶水解糖苷鍵4、N糖苷酶二、核酸的酸堿性質(zhì)具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)能發(fā)生酮式/烯醇式、氨式/亞氨式互變嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性 _主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻(xiàn)1、堿基的解離二 胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結(jié)合到N7上腺嘌呤中，質(zhì)子結(jié)合于N1上2、核苷的解離戊糖可增強(qiáng)堿基的酸性解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離3.核苷酸的解離磷酸基使核苷酸具有很強(qiáng)的酸性DNA等電點(diǎn)為44.5；RNA等電點(diǎn)為22.5三、核酸的紫外吸收 堿基含有共軛雙鍵最大吸收峰260nm左右 可用紫外分光光度計(jì)加以定量和定性。OD260的應(yīng)用

6、：1.判斷核酸樣品的純度DNA純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品: OD260/OD280 = 2.0含雜蛋白及苯酚，降低2. 純DNA或RNA的紫外分光定量 OD260=1.0相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA40g/ml單鏈DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸有些核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度來表示，摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。 ：摩爾吸光系數(shù) A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯內(nèi)徑天然DNA的(P）一般為6600 RNA的(P）一般為77007800核酸的(P）值較所含核苷酸單體的(P）要低40%45%；單鏈多核苷酸的(P）值比雙螺旋結(jié)構(gòu)多核苷酸(P）值要高。所以

7、在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大約25%，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。在DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減?。p色效應(yīng)）判斷DNA是否變性四、核酸的變性、復(fù)性與雜交(一) 核酸的變性（denaturation） 1、DNA的變性： 在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。 某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力， 使核酸分子高級(jí)結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及 生物活性發(fā)生改變。 不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變2、變性的實(shí)質(zhì)降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯鍵的斷裂DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂 高溫（一般75） 熱變性 強(qiáng)酸、堿 酸堿變性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAG

8、E中DNA ）3、變性因素 OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸堿滴定曲線改變生物活性喪失4、變性后理化性質(zhì)變化RNA變性：從螺旋到線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒有DNA明顯完全變性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA 2540%、RNA 約1.1%實(shí)質(zhì)：堿基暴露由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)象稱增色效應(yīng)DNA變性5、DNA熱變性的特征變性過程是“躍變式”的，而非漸變解鏈曲線：連續(xù)加熱DNA，以溫度對(duì)A260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。指增色效應(yīng)達(dá)50%時(shí)的溫度一般DNA Tm 值在85 - 90 C之間 Tm：DNA變性時(shí)，OD260達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度

9、稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度(Tm)。大小與G+C含量成正比。（1）DNA的均一性：（2）GC含量： 經(jīng)驗(yàn)公式： XG+C（Tm69.3）2.44（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度： Tm值大小與下列因素有關(guān)：均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA的均一性 。測(cè)定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44P509圖5-19 圖14-5 Tm值與GC含量的關(guān)系不易用稀電解質(zhì)保存DNA(二)核酸的復(fù)性（renaturation）變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈重新締合成雙鏈復(fù)性。復(fù)性的程度、速率與復(fù)性條件有關(guān)：熱變性DNA驟然冷卻（淬火）不可能復(fù)性將變性DNA緩慢冷卻（

10、退火）可以復(fù)性熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing) 。DNA復(fù)性分子量越大復(fù)性越難；濃度越大，復(fù)性越容易；DNA復(fù)性也與它本身組成和結(jié)構(gòu)有關(guān) （具有很多重復(fù)序列DNA，復(fù)性快）。減色效應(yīng)（低色效應(yīng)）復(fù)性時(shí)紫外吸收減少的現(xiàn)象用Cot1/2表示復(fù)性的速度Co：代表變性DNA復(fù)性時(shí)的初始濃度 t：復(fù)性時(shí)間Cot1/2復(fù)性一半所需時(shí)間與DNA濃度的乘積單位：mol s/L(三) 核酸的雜交熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)；與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。形成的新分子稱為雜交DNA分子。 DNA單鏈與互補(bǔ)RNA鏈間也

11、可發(fā)生雜交探針（probe）：帶有同位素標(biāo)記或生物標(biāo)記的核酸片段。核酸分子雜交的應(yīng)用：研究DNA分子中某一種基因的位置檢測(cè)兩種核酸分子間的序列相似性檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ) Southern雜交 Northern雜交 Western雜交1、 Southern BlottingDNA樣品 酶切 電泳 堿變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影變性（NaOH 0.5mol/L）轉(zhuǎn)膜（NC膜，尼龍膜）固定（80，4-6h）雜交（高鹽濃度，68，幾小時(shí)）Southern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。2、 Northern

12、 Blotting研究對(duì)象是RNA，探針一般是DNA?？俁NA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、 Western Blotting抗原與抗體的雜交研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。測(cè)試題1.多核苷酸之間的連接方式是A. 2, 3磷酸二酯鍵 B. 3,5磷酸二酯鍵C. 2 ,5磷酸二酯鍵 D. 糖苷鍵 E. 氫鍵2. DNA合成需要的原料是A. ATP,CTP,GTP,TTP B. ATP,CTP,GTP,UTPC dATP,dCTP,dGTP,dTTP D dATP,dCTP,dGTP,dUTP E dAMP,dCMP,dGMP,dTMP 3. 關(guān)于Watson and

13、 Crick 的DNA雙螺旋模型，那種說法是錯(cuò)誤的A. 組成雙螺旋的兩條DNA 鏈反向平行B. 堿基對(duì)位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)C. 維系雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力主要是堿基堆積力 D. DNA 雙鏈?zhǔn)亲笫致菪?.B; 2,C, 3,D4. DNA和RNA共有的成分是A. D 核糖 B. D 2-脫氧核糖 C. 鳥嘌呤 D. 尿嘧啶 E. 胸腺嘧啶5. DNA和RNA徹底水解后的產(chǎn)物是A. 戊糖相同，部分堿基不同 B. 堿基相同，戊糖不同C. 戊糖相同，堿基不同D. 部分堿基不同，戊糖不同E. 堿基相同，部分戊糖不同6. 核酸具有紫外吸收能力的原因是A. 嘌呤和嘧啶環(huán)中有共軛雙鍵B. 嘌呤和嘧啶中有酮基C. 嘌

14、呤和嘧啶中有氨基 D. 嘌呤和嘧啶連接了核糖 E. 嘌呤和嘧啶連接了磷酸基團(tuán)4. C; 5. D; 6. A7. 組成核酸的基本單位是A. 嘌呤堿與嘧啶堿 B. 核糖與脫氧核糖 C. 核苷 D. 核苷 酸 E. 寡核苷 酸 8. 在核酸結(jié)構(gòu)中含量較穩(wěn)定的元素是A. C B. H C. O D. N E. P9. tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)為A. 雙螺旋 B. 超螺旋 C. 線形 D. 三葉草形 E. 倒“L”形 10. 堿基互補(bǔ)配對(duì)形成的鍵是 維持堿基對(duì)之間堆積力的是 核苷酸之間的連接鍵是 核酸分子中紫外吸收較強(qiáng)的鍵是 不利于維持雙螺旋穩(wěn)定的力是 A. 氫鍵 B. 磷酸二酯鍵 C. 范德華力 D. 堿基中的共軛雙鍵 E. 靜電斥力7. D；8.P；9.D；10.A,C,B,D,E11. 假尿嘧啶核苷酸的糖苷鍵是A. C-C 鍵