生物化學(xué)實驗技術(shù)-PowerPointPresenta

1、生物化學(xué)實驗技術(shù)1生物化學(xué)實驗技術(shù)實 驗一、 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量 實 驗二 、紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量實 驗三 、血清-球蛋白的分離與純化實 驗四、堿性磷酸酶Km值測定實 驗五、胰島素和腎上腺素對血糖含量的影響實 驗六、 血漿脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析實 驗七、 SGPT活性測定實 驗八、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清LDH同工酶實 驗九 、RNA的分離與鑒定實 驗十 、DEAE 纖維素離子交換層析法分離蛋白質(zhì)實 驗十一、 質(zhì)粒的提取與鑒定2實驗一 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量 3【目的要求】掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度的原理。4【實驗器材】中試管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴

2、箱，721型分光光度計5【方法步驟】取中試管3支，按下表操作。試劑（ml） 標(biāo)準(zhǔn)管 樣品管 空白管 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)待測液蒸餾水雙縮脲試劑0.15.0 0.1 5.0 0.1 5.0 6各管混勻、放置37水浴中保溫20分鐘。用540nm比色，以空白管調(diào)零點，讀取各管光密度值。 7【注意事項】1正確使用微量加樣器。2取液要準(zhǔn)確。3. 做好標(biāo)記，不要將試管號弄混。 8【思考題】1分光光度計的使用及計算原理。9實 驗二紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量10【目的要求】了解分光光度法的基本原理；能較熟練使用紫外分光光度計。11【實驗器材】1紫外分光光度計。2微量加樣器。3蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）。 12【方法步

3、驟】1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：任選一種蛋白質(zhì)溶液，經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的含量后，用生理鹽水稀釋成濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取試管6只，按下表操作13管號 123456蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（ml） 生理鹽水（ml） 0.53.51.03.01.52.52.02.02.51.54.014混勻，以第六管調(diào)零點，280nm波長處比色。用光徑為1cm的石英杯測定各管吸光度，以各管的吸光度值為縱坐標(biāo)，計算各管內(nèi)蛋白質(zhì)的濃度，以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3標(biāo)本測定：用生理鹽水將待測蛋白質(zhì)樣品稀釋成大約1mg/ml溶液。取1.0ml樣加生理鹽水3.0ml混勻，按上述方法測其吸光度。15【結(jié)果與

4、分析】1根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白質(zhì)濃度。2也可利用經(jīng)驗公式計算蛋白質(zhì)含量；適當(dāng)稀釋蛋白質(zhì)溶液測其A280nm和A260nm處吸光度，再用經(jīng)驗公式直接計算蛋白質(zhì)濃度。如Lowry-Kalckar公式：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）1.45A2800.74A260。16【注意事項】1加量要準(zhǔn)確。2比色皿的正確應(yīng)用。3結(jié)果重復(fù)3次，取平均值。17【思考題】1為何要同時測定蛋白280nm和260nm處的光吸收值？18 （一） 血清-球蛋白的分離與純化實驗三191掌握蛋白質(zhì)分離純化的主要方法和原理；2熟悉鹽析和層析的基本操作；3 掌握離心機(jī)的正確使用方法?！緦嶒?zāi)康摹?0【儀器試劑】 試管、刻度吸管、吸耳球、膠頭

5、滴管、層析柱、反應(yīng)板；血清、PBS液、葡聚糖凝膠G-25、納氏試劑、飽和硫酸銨溶液。21 【實驗原理 】1.鹽析 ：是使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀的一種方法。（1）蛋白質(zhì)作為膠體在水中的穩(wěn)定存在的因素電荷(同種電荷相斥）水化膜（隔離）Pr+Pr+中性鹽破壞了這兩個穩(wěn)定性因素，使蛋白質(zhì)沉淀。22中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。沉淀蛋白質(zhì)的方法還有哪些？23（2）鹽析的影響因素蛋白質(zhì)的濃度 、鹽濃度、 pH值、溫

6、度等。 本實驗球蛋白在半飽和硫酸銨溶液中沉淀而清蛋白溶解，-球蛋白在33%濃度的硫酸銨溶液中沉淀。 242.層析： 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。253.檢測分離效果（1）納氏試劑：鹽存在時，NH4+ 與其反應(yīng)呈現(xiàn)黃色或橙色。（2）雙縮尿試劑檢測：蛋白質(zhì)與其呈現(xiàn)紅色或紫紅色。261鹽析 血清2ml放入離心管中，加入PBS2ml混勻逐滴加入飽和硫酸銨溶液4ml，邊加邊搖勻。靜置10分鐘后，離心3000 rpm 10分鐘，傾上清液（上清

7、中主要含清蛋白）。 【實驗操作】27 將離心管中的沉淀用1 ml PBS攪拌溶解，再逐滴加入飽和硫酸銨溶液0.5ml，邊加邊搖勻。靜置10分鐘后，離心3 000 rpm 10分鐘（注意離心機(jī)使用時需要配平并且離心時將蓋子蓋好）。傾上清液（上清中主要含、球蛋白），沉淀即為初步純化的-球蛋白。28 裝柱：將制好的葡聚糖凝膠混勻，傾入層析柱內(nèi)，靜止后分層，凝膠高度要在柱高的1/33/4之間。當(dāng)液面接近凝膠上表面時將出口膠管夾緊待用。 2.脫鹽：注意：裝柱要均勻，不要有氣泡和分層，凝膠面要平整 29（2）加樣：向裝有-球蛋白的離心管內(nèi)加入PBS 10滴，用玻璃棒攪拌使之溶解。再用乳頭吸管吸出-球蛋白液

8、，加到層析柱內(nèi)凝膠表面。待-球蛋白液全部進(jìn)入凝膠柱內(nèi)時，再用乳頭吸管小心加入PBS約1cm高，待大部分液體進(jìn)入凝膠柱后，再繼續(xù)加PBS直至洗脫完畢（加液時注意不要沖擊凝膠表面）。在整個洗脫過程中不能讓液面降至凝膠面以下。 30（3）收集：加樣同時可進(jìn)行收集，每管收集1ml。收集12 管后加緊螺旋夾?；厥漳z和尼龍布等。 檢測：準(zhǔn)備反應(yīng)板兩塊。將12管收集液各取1 滴分別放入反應(yīng)板的12個凹孔。一塊板的各孔內(nèi)加納氏試劑1滴，有NH4+ 者呈黃色至橙色。可用、號表示有無呈色或顏色深淺。再向另一塊板的各孔內(nèi)加雙縮脲試劑1滴，有蛋白者呈藍(lán)紫色。31【實驗結(jié)果】可用、號表示有無呈色或顏色深淺。將雙色脲反

9、應(yīng)呈色最深的一管收集液保留供下次實驗使用。利用醋酸纖維素薄膜電泳檢測本次實驗所提-球蛋白的純度。321使用離心機(jī)前注意配平；2裝柱要均勻，不要有氣泡和分層，凝膠面要平整；3凝膠高度要在柱高的1/33/4之間；4脫鹽時不能沖擊凝膠面，PBS液面不能降到凝膠面以下；5實驗后將凝膠中鹽洗脫干凈后回收再利用。【實驗注意事項】33【思考題】1.裝柱不均勻，凝膠面不平整對實驗結(jié)果有什么影響？2. 鹽析與變性的異同？3凝膠層析的原理？34（二） 血清-蛋白的鑒定 醋酸纖維素薄膜電泳351. 掌握電泳的基本原理；2. 熟悉醋酸纖維素薄膜電泳的方法和 應(yīng)用。 【實驗?zāi)康摹?6【儀器試劑】 電泳儀、點樣器、鑷子、

10、醋酸纖維素薄膜；巴比妥緩沖液、染色液、漂洗掖。37 【實驗原理 】1.蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在同一個PH 環(huán)境下，混合蛋白質(zhì)中各種成分帶電量不同、分子大小不同，在同一電場中泳動的速度不同，導(dǎo)致相同的時間遷移的距離不同而把它們分開。（1）分子越小，泳動速度越快（2）帶電量越多，泳動速度越快反之，越慢。382.本實驗分離全血清中各種蛋白質(zhì)成分，同時鑒定上次實驗提純結(jié)果。 點樣 2 1 清蛋白球蛋白391. 準(zhǔn)備與點樣：用巴比妥緩沖液將醋酸纖維素薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米處點樣，即上述實驗得到的-蛋白，另取薄膜一點全血清。 2. 電泳：點樣面朝下，點樣端靠近負(fù)極，電壓110V，通電40-45

11、min；3染色：2-5 min； 4. 脫色：直至背景漂凈為止?！緦嶒灢僮鳌?0【實驗結(jié)果】根據(jù)電泳區(qū)帶出現(xiàn)的位置和條數(shù)判斷是何種血清蛋白，如果只是一條-蛋白說明上個實驗分離純化的較好。411不要用手觸摸纖維素膜；2注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛 面；3點樣位置要在1.5厘米以內(nèi)，不要距邊緣 太近，不要重復(fù)點樣；4膜放進(jìn)電泳槽時，將點樣面向下，點樣端靠近陰極；【實驗注意事項】42【思考題】 如果電泳結(jié)果證實球蛋白的分離效果不理想，應(yīng)從哪些方面分析？43實 驗 四堿性磷酸酶Km值測定44【目的要求】了解酶促反應(yīng)的影響因素；掌握Km的意義和測定方法；了解底物濃度與酶活性的關(guān)系。45【實驗器材】1

12、可見分光光度計。2微量加樣器。30.025U/ml的酶液。46【方法步驟】1取干凈試管8支，按下表正確操作： 47試劑123456780.02M基質(zhì)液蒸餾水碳酸鹽緩沖液 0.11.31.50.21.21.50.31.11.50.41.01.50.60.81.50.80.61.51.41.51.41.5 混勻置37水浴保溫5分鐘 酚標(biāo)準(zhǔn)液 酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1 充分混勻置37水浴準(zhǔn)確保溫15分鐘 0.5鐵氰化鉀 2.02.02.02.02.02.02.02.048充分混勻后置室溫10min，510nm波長下進(jìn)行比色，以第8管做空白，測定各管的光密度?！窘Y(jié)果與分析】

13、1計算各管酶活性單位。 D測/D標(biāo)0.012計算各管S。 S加入S量/3.00.023進(jìn)一步計算出各管1/V和1/S。4將上述數(shù)據(jù)填入下表49以1/S為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，畫出各管的坐標(biāo)點，并將其連成直線，此直線與橫軸的相交點為-1/Km，由此可計算出該酶的Km。50【注意事項】1本實驗所用各種玻璃儀器必須洗凈烤干后備用。2各種試劑的加入量要準(zhǔn)確。3嚴(yán)格掌握加入酶液后的保溫時間，否則會影響其 產(chǎn)物量的準(zhǔn)確度 51【思考題】1為何可以酶活性單位代表酶促反應(yīng)速度？2酶促反應(yīng)的影響因素有哪些？3何為Km值？如何測定一個酶的Km值？52Folin-Wu法實驗五 胰島素和腎上腺素對血糖含量的影響53

14、1.掌握影響血糖含量的因素；2.熟悉測定血糖的原理和方法及臨床意義；3.熟悉動物取血的基本操作?！緦嶒?zāi)康摹?4【儀器試劑】 722型可見光分光光度計、血糖管、奧氏吸管、錐形瓶、注射器等；鎢酸鈉、濃硫酸、磷鉬酸、堿性銅等。用于吸抗凝血,中間為膨大的球體,減少血液和吸管壁的接觸面積,盡量避免融血.55 【實驗原理 】主要調(diào)節(jié)激素降低血糖：胰島素升高血糖：胰高血糖素(glucagon)、糖皮質(zhì)激素、腎上腺素1.體內(nèi)血糖水平主要依靠激素的調(diào)節(jié) 胰島素(insulin)： 體內(nèi)唯一降低血糖水平的激素 腎上腺素：主要在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 562.無蛋白血濾液的制備原理本實驗采用吳憲氏法測定血糖，要

15、求將血液制成無蛋白血濾液：?2RCOOHNH2+ H2WO4RCOOHNH2WO42此方法是生物堿沉淀蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)的方法還有哪些？573.利用吳憲氏法測定血糖的原理G + Cu2+OH-Cu2O+糖氧化物3Cu2O+3H3PO4.2MO3.12H2O6CuO +3H3PO4.2MO2O3.12H2O鉬藍(lán)通過測定鉬藍(lán)顏色的深淺計算葡萄糖的含量！581動物準(zhǔn)備 取正常家兔兩只，實驗前預(yù)先饑餓，稱體重（一般為23kg）。2取血 以耳緣靜脈取血，先去毛，用二甲苯擦拭兔耳， 使其血管充血，再用干棉球擦干，用粗針頭刺破靜脈放血，將血液收入抗凝管中（按10：1的比例將防凝劑放入試管，邊收集（量約3ml）

16、邊搖勻，以防凝固。 用干棉球壓迫血管止血?！緦嶒灢僮鳌?93注射激素后取血(1)取餓兔血后，其中一只兔腹部皮下注射胰島素，劑量按0.75u/kg體重計算，并記錄注射時間。一小時后再取血。取血后立即腹腔或皮下注射25%葡萄糖液10ml，以免家兔發(fā)生胰島素性休克而死亡。(2)另一只兔腹部皮下注射腎上腺素，劑量按0.4mg/kg體重計算，并記錄注射時間。半小時后再取血。60 用干燥的奧氏吸管吸防凝血1ml，擦去管尖外面的血液后，慢慢地放于干燥的錐形瓶中,然后吸硫酸8ml,慢慢地加入，隨加隨搖（不能有氣泡產(chǎn)生），此時溶液逐漸變?yōu)樯钭厣?，再沿錐形瓶壁加入鎢酸鈉1ml，隨加隨搖以充分沉淀蛋白質(zhì)，混勻后，放

17、置5分鐘，然后以2500rpm離心5分鐘，倒出上清夜待血糖測定用，此液即無蛋白血濾液。4.無蛋白血濾液的制備：615.血糖值的測定 取中試管五支，分別標(biāo)記，按下表操作 試 劑 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 胰前 胰后 腎前 腎后 無蛋白血濾液 0.5 0.5 0.5 0.5 G標(biāo)準(zhǔn)液 0.5 蒸餾水 0.5 堿性銅 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5混勻，置沸水浴中煮8分鐘，取出，放入冷水浴中冷卻。切勿搖動血糖管。各加入磷鉬酸試劑0.5ml，混勻，放置10分鐘，各加蒸餾水5ml，用420nm波長比色，以空白調(diào)零，讀取各管光密度.62【實驗結(jié)果計算】葡萄糖（mmol/L）=OD測定/OD標(biāo)準(zhǔn) 0.

18、5 10正常值：3.96.1mmol/L（人） 兔比人略低。C標(biāo)準(zhǔn)稀釋的倍數(shù)631. 制備無蛋白血濾液過程中，用奧氏吸管吸取全血，將吸管外壁的血液擦除干凈后插入蒸餾水底層，緩緩放出血液，再用上層液將內(nèi)壁的血液沖洗干凈。2. 加硫酸、鎢酸鈉時，要邊加邊搖勻。3. 沸水浴和冷水浴過程中，切勿搖動。 【實驗注意事項】64【思考題】1.為什么測定血糖時必須預(yù)先出去蛋白質(zhì)？2.為什么選用奧氏吸管吸取血液？3.為什么用操作中不要搖動血糖管？65胰島素 促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運進(jìn)入肝外細(xì)胞 ； 加速糖原合成，抑制糖原分解； 加快糖的有氧氧化； 抑制肝內(nèi)糖異生； 減少脂肪動員。 體內(nèi)唯一降低血糖水平的激素 胰島素的作用

19、機(jī)制:66實驗六 血漿脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析【目的要求】1.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理及方法。2.掌握血漿脂蛋白的分類。 67【實驗器材】1.儀器與材料： 玻璃片，5ml刻度吸量管， 濾紙片，打槽器，20l微量加樣器，電泳儀。2試劑： 蘇丹黑B染色液，巴比妥緩沖液，凝膠緩沖液，瓊脂糖凝膠。3樣品： 血清68【方法與步驟】1.制板:取玻璃片放到平整的桌面上，用刻度吸量管吸取溶化的瓊脂糖約2.52.8ml加到玻璃片上。2.挖槽：5分鐘后，在離凝膠板一端約1.5厘米處打一個101mm的小槽，用壓扁的針頭將槽內(nèi)凝膠清除，然后用濾紙片將槽內(nèi)的水吸干。69【方法與步驟】3.加樣:于瓊脂糖凝膠槽內(nèi)加入預(yù)染好

20、的血清20l。4.電泳:將加好樣品的瓊脂糖凝膠板置于電泳槽支架上，樣品端靠近陰極，再用雙層紗布搭橋，平衡35分鐘，然后通電，電壓為80100v，電泳時間為4060分鐘。70【結(jié)果與分析】 -脂蛋白位于最前，-脂蛋白位于最后，中間為前-脂蛋白，空腹血清無乳糜微粒，進(jìn)食后血清可出現(xiàn)乳糜微粒位于原點。 71【注意事項】1.制板要均勻。2.挖槽要整齊,不能太寬。3.電泳電壓要保持穩(wěn)定。72【思考題】1.瓊脂糖凝膠電泳的原理是什么？73實驗七 SGPT活性測定【目的要求】掌握SGPT活性測定的原理。熟悉SGPT活性測定的臨床意義。74【實驗器材】1儀器與材料 : 中試管3支，l毫升刻度吸管2支，5升刻度

21、吸管1支，100l微量加樣器，水浴箱，721型分光光度計。2試劑: 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液，SGPT基質(zhì)液，0.1MpH7.4磷酸鹽緩沖液，2、4-二硝基苯肼溶液，0.4mol/LnaOH溶液。3樣品: 血清75【方法與步驟】 取中試管3支，按下表操作。 標(biāo)準(zhǔn)管 樣品管 空白管 血清（ml） 0.1 0.1 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（ml） 0.1 SGPT基質(zhì)液（ml） 0.5 0.5 混勻后，37水浴箱30分鐘，76【方法與步驟】 標(biāo)準(zhǔn)管 樣品管 空白管2、4-二硝基苯肼（ml） 0.5 0.5 0.5SGPT基質(zhì)液（ml） 0.5 混勻后，37水浴箱30分鐘，0.4mol/LNaOH （ml） 5.0 5.0

22、 5.077【方法與步驟】將各管混勻后靜置10分鐘，然后用721型分光光度計500nm波長比色，以空白管調(diào)零，讀取光密度值，計算。SGPT =測定管光密度標(biāo)準(zhǔn)管光密度20 2.50.11178【結(jié)果與分析】正常值為2-40單位注：1個SGPT單位相當(dāng)于1ml血清37，30分鐘產(chǎn)生2.5ug丙酮酸。79【注意事項】1試劑量、保溫時間要準(zhǔn)確。2測定時間盡量短。80【思考題】1SGPT測定有何臨床意義?81聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清LDH同工酶實驗八82【目的要求】掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。 學(xué)習(xí)盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)，用于分離蛋白質(zhì)。83聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acr

23、ylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)?！緦嶒炘怼?4

24、聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；85(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。86凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。 表3.4 分子量范

25、圍與凝膠濃度的關(guān)系 分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋 白 質(zhì) 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.687聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。 目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。 88圖1 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)89乳酸脫氫酶（LDH）是葡萄糖酵解過程中很重要的一種酶，該酶催化丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化。LDH目前發(fā)現(xiàn)有五種同工酶。在堿性條件下，

26、五種LDH同工酶都帶負(fù)電荷，電泳時都向正極移動。由于各種同工酶的pI不同，在同一pH條件下帶電荷多少不同，電泳速度即不同，故可用電泳法將其分離。按電泳速度的快慢依次為ODLDH1、ODLDH2、ODLDH3、ODLDH4、ODLDH590將LDH同工酶電泳分離后進(jìn)行染色，以顯示各種同工酶的位置。其染色的原理是： 乳酸 丙酮酸 NAD+ NADH+H+ PMSH2 PMS NBT(無色) NBTH2(紫藍(lán)色) 91【實驗器材】儀器 與材料 真空泵、圓盤電泳槽、電泳儀、刻度吸管、微量加樣器、長頭注射器、燒杯等。試劑 30丙烯酰胺貯存液、催化劑1過硫酸銨、1TEMED緩沖液、電泳槽緩沖液、蔗糖、乳酸

27、鈉、輔酶I、PMS、NBT、7.5%醋酸溶液樣品 血清92【方法與步驟】1. 準(zhǔn)備玻璃管：準(zhǔn)備560mm玻璃管若干支，洗凈烤干，管下端套一密塞的橡皮套或瓶塞，垂直插入管架上。93試 劑用 量TEMED緩沖液 30%Acr-Bis溶液 蒸餾水 1.5ml 4ml 6ml 混勻真空抽氣5分鐘0.14%過硫酸銨 合 計6ml 17.5ml2. 配制凝膠：943. 裝管：用細(xì)長滴管或長頭注射器吸取凝膠裝入玻璃管中，高度距離管上口8mm為宜，檢查管內(nèi)無氣泡后，向膠面緩緩注入蒸餾水約4mm高度，在自然光下聚合約40分鐘，見水與膠之間有明顯界面出現(xiàn)，為膠已聚合。用濾紙條吸取凝膠上方水層，取下管底部的橡皮套管

28、，將凝膠管垂直插入電泳槽圓孔中并盡量使各管高度一致。95 4. 加樣：用微量加樣器每管加血清蔗糖稀釋液100ul，（血清1份，40%蔗糖6份，溴酚蘭少許混合而成）。用電極緩沖液將膠管頂端注滿，小心避免樣品混合。在上下槽中加入電極緩沖液，上槽應(yīng)漫過膠管上口。96 5. 電泳：接通電源，負(fù)極接上槽，正極接下槽，調(diào)電流2.5mA/管或調(diào)電壓200V，保持電壓穩(wěn)定。等染料遷移到距凝膠下口約5mm處時，停止電泳。時間約2小時。 976. 出膠：用長頭注射器吸滿水，將針頭小心插入凝膠與玻管壁之間，邊推水邊旋轉(zhuǎn)膠管，凝膠柱即可脫出。將每條膠柱放入小試管內(nèi)。7. 染色：管內(nèi)加染色液，放37水浴保溫待淡紫色區(qū)帶

29、出現(xiàn)（約30分鐘）。倒出染色液并用水洗去凝膠柱表面染色液，加入醋酸溶液以終止酶促反應(yīng)。 988.百分含量掃描測：將分離的LDH同工酶凝膠柱用薄層層析掃描儀在560nm波長處掃描，測出光密度，計算出各種LDH同工酶的百分含量。計算方法：總光密度：T=ODLDH1+ODLDH2+ODLDH3+ODLDH4+ODLDH599【結(jié)果與分析】 正常人血清LDH各同工酶活力百分比是：LDHl 33.4；LDH2 42.8；LDH3 18.5；LDH4 3.9；LDH5 l.4。不同方法測定值略有不同。100【注意事項】 所用器材必須清潔。特別是制備凝膠柱所用的玻璃管每次用后必須用洗液浸泡，再常規(guī)清洗，否則

30、凝膠剝離困難。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)性毒劑，對皮膚有刺激作用，應(yīng)避免直接接觸。電泳完畢后，上下槽電極緩沖液不可混合，因離子強度和pH值都已發(fā)生改變。101【思考題】LDH同工酶測定的臨床意義是什么 102實驗九 RNA的分離與鑒定103【目的要求】1掌握RNA分離純化的原理及操作方法2熟悉臺式離心機(jī)的使用3. 掌握RNA定量技術(shù)104【實驗器材】1、儀器與材料 離心機(jī)一臺,組織搗碎機(jī)一臺，手術(shù)器械1套，天平1臺。2、藥品 0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA勻漿緩沖液，氯仿-異戊醇混合液，RNA標(biāo)準(zhǔn)液，95冷乙醇，地衣酚，3、動物 家兔，體重2.50.5kg。 105

31、【方法步驟】1.選取健康家兔一只，斷頭處死，取其肝臟，稱取25g，放入組織搗碎機(jī)中，加入預(yù)冷的0.14mol/L NaCl-0.15mol/LEDTA勻漿緩沖液約130ml，高速研磨2分鐘，加緩沖液至200ml，即為肝勻漿。2. 分離核蛋白：肝勻漿4ml倒入試管中，3000rpm離心20min，上清倒入另一試管中為A管（RNP提取液），沉淀棄去。1063. A管中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，震蕩2分鐘，3000rpm離心15min，管內(nèi)液體分三層，上層為含有RNA的水溶液，吸取上層水溶液轉(zhuǎn)入B管中。4于B管加二倍體積的95冷乙醇，見乳白色RNA沉淀，混勻放置10min，3000rpm離心5

32、min，沉淀為純化RNA。1075RNA的溶解：沉淀中加入0.14 mol/L NaCl 2.0ml，攪拌溶解，2000rpm離心10min，上清液則為RNA水解液。4ml 肝勻漿(已加0.14mol/L NaCl)6RNA的測定：按表2操作。108混勻，沸水浴10分鐘，取出冷卻，以空白管調(diào)零，在670nm比色，讀取光密度值，計算。109【注意事項】1.在制備肝勻漿時，應(yīng)盡量在冰冷條件下進(jìn)行。2.各步驟操作應(yīng)力求準(zhǔn)確，盡量減少中途核酸的丟失，保證定量測定的準(zhǔn)確性。110【思考題】1.比較討論氯仿-異戊醇混合液， 95冷乙醇有何作用？2. 為什么實驗最后鑒定的是戊糖而不是其他的物質(zhì)，戊糖的含量可

33、以代替RNA的含量嗎？111實驗十DEAE 纖維素離子交換層析法分離蛋白質(zhì) 112【目的要求】 掌握DEAE 纖維素離子交換層析法的基本原理 掌握其實際操作過程，包括裝柱、洗脫、測定等步驟熟悉DEAE 纖維素離子交換劑的結(jié)構(gòu)及特點了解梯度洗脫的原理113【實驗器材】 儀器與材料 試管、燒杯、玻璃攪棒、層析柱、梯度洗脫儀等藥品 DEAE纖維素-22(纖維素DE22)、0.5mol/L HCL 、0.5mol/L NaOH 、0.01MNa2HP04 、0.5MNa2HP04 114【方法與步驟】 DEAE-22 纖維素處理 裝柱 安裝梯度發(fā)生器 加樣 洗脫 檢測 115DEAE-22 纖維素處理

34、 稱取DEAE-22纖維素2.5克先用40ml 0.5mol/L HCL浸泡30分鐘,加蒸餾水60ml反復(fù)洗滌,使上層液體沒有細(xì)的混懸物,然后倒入有100目尼龍滑布的漏斗中,用蒸餾水充分洗滌,直到流出液的pH4止再用40ml 0.5mol/L NaOH浸泡30分鐘,傾棄上清液,加蒸餾水100m1,攪拌后,倒入有細(xì)尼龍布的漏斗中,用蒸餾水充分洗滌,直到流出液的pH8時，濾去水分將上述纖維素放入燒杯中,加入0.01MNa2HP04 100 m1,浸泡并攪動，放置5分鐘，傾去上層液體,必要時再重復(fù)操作,直到溶液pH=8止116裝柱 用螺旋夾扭緊層析柱下端膠管，把層析柱夾在鐵支架上柱中加數(shù)毫升 0.0

35、1 MNa2HP04 液，然后打開出口，排出氣泡，待柱中液體只剩下約 1cm 高時關(guān)閉出口將處理好的DEAE纖維素混懸液用吸管連續(xù)移入層析柱內(nèi)，擰松下口的螺旋夾，使液體滴下全加到柱內(nèi)后，待液面接近纖維素頂上界面時，把出口螺旋擰緊117安裝梯度發(fā)生器 將梯度發(fā)生器兩筒間及出口膠管的螺旋夾都擰緊，向有出口側(cè)的筒內(nèi)加入0.01M Na2HP04液40 m1，另一筒內(nèi)加 0.5M Na2HP04液40 m1把此梯度發(fā)生器放到磁力攪拌器上，攪拌子放在出口側(cè)的盛液筒中，使梯度發(fā)生器出口細(xì)膠管內(nèi)充滿掖體，排出氣泡。扭緊螺旋夾，細(xì)膠管下端邊到層析柱上口的膠塞上的連接管上 118加樣 用吸管接近床面的位置上緩慢

36、加入血清 0.5 m1，打開下口讓液體緩慢流出，流速每分鐘5-10滴到全部血清恰好注入床面時，立即小心的加入 0.01M Na2HP04液0.5m1, 當(dāng)液面接近床面時，擰緊下口螺旋夾，并把下口的膠管連接到自動收集器的收集管上 119洗脫 擰松梯度發(fā)生器兩盛液筒間的螺旋夾，開動磁力攪拌器。將連接梯度發(fā)生器兩口的細(xì)膠管連接到層析柱上端膠塞連接管上， 使液體流入層析柱內(nèi)扭松層析下端膠管的螺旋夾，控制流速約50 滴 / 分，每收集管收集量約為 40 m1時換管，直到收集完為止120檢測 用紫外分光光度計測讀各管的 280nm 的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo) , 管號為橫坐標(biāo) , 用方格坐標(biāo)紙繪出血清蛋白層析譜觀察判斷結(jié)果 121【結(jié)果與分析】 不同管號中的蛋白質(zhì)溶液，吸光度各異，隨著管號增加，吸光度先逐漸升高然后逐漸降低這表明經(jīng)過DEAE 纖維素離子交換層析法蛋白質(zhì)被分離出來122【注意事項】 裝柱時要避免氣泡產(chǎn)生。加樣時不要攪動床面。 123【思考題】 DEAE 纖維素離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的基本原理。分析梯度洗脫的機(jī)制 124實驗十一、質(zhì)粒的提取與鑒定（設(shè)計性實驗）125 目的要求1.學(xué)生自己設(shè)計出提取質(zhì)粒的方案，寫出較完整的設(shè)計報告。2.質(zhì)粒