DNA和RNA提取方法及原理和提取方法及原理DNA提取專題DNA提取專題第一部分演示教學(xué)

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。DNA和RNA提取方法及原理和提取方法及原理DNA提取專題DNA提取專題第一部分-DNA和RNA提取方法及原理和提取方法及原理DNA提取專題DNA提取專題第一部分：第一部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介第二部分：第二部分：DNA提取常見問題分析及對策提取常見問題分析及對策前言DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物是遺傳信息的載體，是遺傳信息的載體信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象。信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象。為了進(jìn)行測序、雜交和基因的表達(dá)，獲得高分子了進(jìn)行測序、雜交和基因的表達(dá)，量和高純度

2、的DNA是非常重要的前提。是非常重要的前提。量和高純度的是非常重要的前提DNA提取原則DNA提取原則保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性純化后不應(yīng)存在對酶有抑制作用的物質(zhì)排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取的幾種方法DNA提取的幾種方法染色體DNA的提取染色體DNA的提取DNACTAB法法SDS法SDS法其它DNA提取的幾種方法DNA提取的幾種方法非染色體DNA的提取的提取非染色體質(zhì)粒DNA的提取的提取質(zhì)粒?堿裂解法?煮沸法線粒體、葉綠體線粒體、葉綠體DNA的提取的提取?差速離心結(jié)合差速離心結(jié)合SDS裂解法裂解法基因組DNACTAB法基因組DNACT

3、AB法CTAB法原理（植物提取經(jīng)典方法）法原理植物DNA提取經(jīng)典方法提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基（，溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，），是一種陽離子去污劑溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑）是可溶的，抽提，去除蛋白、多糖、抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。出來。溶液在低于15時(shí)會形成沉淀析出，注：CTAB溶液在低于時(shí)會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的溶

4、液在低于植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15。基因組DNACTAB法基因組DNACTAB法CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合2+或Mn2+離子，抑制螯合Mg離子，抑制DNase活性；活性；螯合活性NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；提供一個(gè)高鹽環(huán)境，DNP充分溶解存在于液相中；充分溶解，CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；溶解細(xì)胞膜-巰基乙醇是抗

5、氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，巰基乙醇是抗氧化劑CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方提取緩沖液的改進(jìn)配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，物質(zhì)，有效去除多酚，減少中酚的污染；物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，中酚的污染同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。有效去除多糖?；蚪MDNACTAB法基因組DNACTAB法CTAB法流程圖法流程圖植物材料裂解液酒精沉淀液氮研磨抽提離心洗滌DNA溶液溶液細(xì)胞裂解上層溶液干燥溶解基因組DNASDS法基因組

6、DNASDS法SDS法原理法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能裂解細(xì)是一種陰離子去垢劑，在高溫（是一種陰離子去垢劑使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖或濃度并降低溫度（提高鹽濃度并降低溫度冰?。╇s質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的用酚/氯仿抽提上清液中的用酚氯仿抽提，DNA?；蚪MDNASDS法基因組DNASDS法SDS法流程圖以動物組織為例）SDS法流程圖（以動物組織為例）動物組織抽提離心洗滌

7、組織勻漿上層溶液干燥溶解細(xì)胞裂解酒精沉淀DNA溶液溶液基因組DNA基因組DNA其它方法根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：生物方式：酶法基因組DNA基因組DNA其它方法根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：吸附材料結(jié)合法：吸附材料結(jié)合法：?硅質(zhì)材料高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。pH值結(jié)合核酸pH值洗脫快捷高效?？旖莞咝?。陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低

8、pH值洗脫。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。pH值結(jié)合核酸pH值洗脫適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁珠磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。從而達(dá)到分離目的?；蚪MDNA基因組DNA其它方法濃鹽法：濃鹽法：利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離和在鹽溶液中溶解度不同，利用在鹽溶液中溶解度不同有機(jī)溶劑抽提法：有機(jī)溶劑抽提法：有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用密度梯度離心法：密度梯度離心法：利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得

9、多，且染色體DNA為染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多DNA而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共DNA溶液時(shí)DNA容易發(fā)生變性價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉DNA而復(fù)

10、性的超螺旋質(zhì)粒DNADNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相從而可通過離心將兩者分開。中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA堿裂解法堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體上清液沉淀溶液I充分重懸溶液充分重懸抽提干燥溶解溶液II裂解溶液裂解酒精沉淀質(zhì)粒DNA溶液溶液質(zhì)粒溶液III中和溶液中和離心洗滌質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多DNA而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合

11、環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共DNA溶液時(shí)DNA容易發(fā)生變性價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉DNA而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNADNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相從而可通過離心將兩者分開。中，從而可通過離心將兩者分開。細(xì)胞器DNA細(xì)胞器DNA差速離心法線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半

12、自主性細(xì)胞器，線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋它們的比重和大小一定比重和大小一定，白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。種組分分級分離出來。差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。從而得以分離

13、。內(nèi)容第一部分：第一部分：DNA提取方法簡介提取方法簡介第二部分：DNA提取及常見問題分析第二部分：提取及常見問題分析DNA提取的基本步驟DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜III.核酸分離、III.核酸分離、純化核酸分離IV.沉淀或吸附核酸，IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸V.核酸溶解在適量緩沖液或水中V.核酸溶解在適量緩沖液或水中材料準(zhǔn)備基因組DNA的提取基因組DNA的提取DNA最好使用新鮮材料，最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要時(shí)提取血液基因組選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞

14、）選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長，組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長，否則會造成DNA降解否則會造成降解含病毒的液體材料DNA含量較含病毒的液體材料DNA含量較DNA少，提取前先富集質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取DNA使用處于對數(shù)期的新鮮菌體老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）細(xì)胞裂解基因組DNA的提取基因組DNA的提取DNA材料應(yīng)適量，

15、過多會影響裂解，材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低量少，導(dǎo)致量少針對不同材料，針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：解預(yù)處理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶K蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取DNA菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時(shí)間不要過長（分鐘分鐘），變性的時(shí)間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時(shí)間也不宜過長，復(fù)性時(shí)間也不宜過長，否則會有基因

16、組DNA的污染有基因組的污染G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先酵母質(zhì)粒的提取，用酶法或機(jī)械法處理，用酶法或機(jī)械法處理，以破壁?核酸分離、核酸分離、純化基因組DNA的提取基因組DNA的提取DNA質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取DNA采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提時(shí)采用吸附材料吸附的方式分離供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（氯仿抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，氯仿）采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時(shí)，離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對不同材料的特點(diǎn)，針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法核酸分離、核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性

17、（SDS、異硫氰酸胍等）使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離、核酸分離、純化多糖的去除：多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體1/2積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可(1/2體積以與多糖的羥基作用，以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。代替乙醇沉淀DNADNA：DNA液中加入用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500LDNA液中

18、加入冰浴20min20min。200l20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分離、核酸分離、純化多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等抗壞血酸、半胱氨酸、加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它加入易與酚類結(jié)合的試劑：PVP、PEG(聚乙二醇)聚乙二醇們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNADNA的結(jié)合們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除：鹽離子的去除：7070的乙醇洗滌核酸沉淀、核酸沉淀、溶解基因組DNA的提取基因組D

19、NA的提取DNA質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取DNA當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的體積的NaOAc（pH5.2，3M），有），有沉淀時(shí)加入體積的（，），利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，沉淀后應(yīng)用的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）晾干若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解若長期儲存建議使用緩沖液溶解?TE中的中的EDTA能螯和2+或Mn2+離子，抑制能螯和Mg離子，抑制DNase中的能螯和pH值為，可防止值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解

20、值為發(fā)生酸解基因組DNA的檢測基因組DNA的檢測提取的基因組DNA片段在片段在20kb30kb之間提取的基因組片段在之間高質(zhì)量的基因組DNA帶型單一無拖尾現(xiàn)象帶型高質(zhì)量的基因組DNA濃度及純度的檢測A260=1約50?g/mL雙鏈濃度及純度的檢測雙鏈DNA；A260/280約為1.8約為DNA提取常見問題DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。樣品不純，PCR反應(yīng)問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。原因1.2.3.4.DNA中含有蛋白、多DNA中含有蛋白、中含有蛋白糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前在溶解前，DNA在溶解前，有酒精殘留，精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解

21、反應(yīng)DNA中殘留有金屬離DNA中殘留有金屬離子RNA的存留有RNA的存留1.對策2.3.4.重新純化DNA，重新純化DNA，過吸附DNA柱去除蛋白、多糖、柱去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNADNA，重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加7070增加70乙醇洗滌的次數(shù)（次數(shù)（2-3次）加入RNase降解RNARNase降解加入RNase降解RNADNA提取常見問題DNA提取常見問題問題二：DNA降解降解。問題二：DNA降解。原因1.2.3.4.5.1.2.3.材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸對酶的活性提取過程操作過于劇策DNA被機(jī)械打斷烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融4.5.盡

22、量取新鮮材料，盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料DNA時(shí)的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量，的含量，細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌DNA分裝保存于緩沖液中分裝保存于緩沖液中，將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融DNA提取常見問題DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少提取量少。問題三：DNA提取量少。原因1.2.3.4.1.2.實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗滌時(shí)DNA丟失洗滌時(shí)DNA丟失DNA對策3.4.

23、盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）料動植物要?jiǎng)驖{研磨充分；動植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁。或機(jī)械方式破壁。高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長（對于動時(shí)間適當(dāng)延長（物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PKPK的用物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）。增加吸附的時(shí)間，增加吸附的時(shí)間，或低溫沉淀小心操作RNA提取專題RNA提取專題第一部分：第一部分：RNA提取方法簡介提取方法簡介第二部分：RNA提取及常見問題分析第二部分：提取及常見問題分析分離提純RNA的目的分離提純RNA的目的分析不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)狀況獲得新基因研究基因的拼接分析相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物RNA的不穩(wěn)定性RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘

24、基的2和位置帶有羥基位置帶有羥基，由于核糖殘基的和3位置帶有羥基，RNA易易于被RNA酶切割水解于被酶切割水解RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)酶含量豐富，酶含量豐富活性，活性，不易失活提取RNA的注意事項(xiàng)提取RNA的注意事項(xiàng)經(jīng)常更換新手套。經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw和實(shí)驗(yàn)室用品上可能有RNase，會導(dǎo)致RNase污染。，會導(dǎo)致污染。污染使用滅過菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。使用滅過菌的塑料制品和槍頭避免交叉污染。應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在應(yīng)使用不含的塑料和玻璃器皿。的塑料和玻璃器皿150烘烤4小時(shí)，塑料器皿可在烘烤小時(shí)塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡小時(shí)，中

25、浸泡10中浸泡分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。常用RNA酶抑制劑常用RNA酶抑制劑焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)）：酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強(qiáng)烈但不徹底的合使蛋白質(zhì)變性，強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。酶抑制劑異硫氰酸胍：目前是最有效的酶抑制劑，異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時(shí)也使酶抑制劑RNA酶失活。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對酶失活。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，酶失活RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。酶有強(qiáng)烈的變性作用。

26、酶有強(qiáng)烈的變性作用氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制酶的活性。酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)酶的活性RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來酶的蛋白抑制劑（）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來酶的蛋白抑制劑）：的酸性糖蛋白。酶的一種非競爭性抑制劑，的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和是酶的一種非競爭性抑制劑多種RNA酶結(jié)合，使其失活。酶結(jié)合，使其失活。多種酶結(jié)合其它：酶也有一定抑制作用。

27、其它：SDS、尿素、硅藻土等對、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。酶也有一定抑制作用RNA提取專題RNA提取專題第一部分：第一部分：RNA提取方法簡介提取方法簡介第二部分：RNA提取及常見問題分析第二部分：提取及常見問題分析RNA提取的步驟RNA提取的步驟材料的裂解異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)月桂肌氨酸合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸合物變性，釋放，酶。苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，及蛋白沉淀到有機(jī)相。使DNA及蛋白沉淀到有機(jī)相。及蛋白沉淀到有機(jī)相雜質(zhì)的去除RNA的吸附或沉淀的吸附

28、或沉淀硅質(zhì)材料的吸附或用異丙醇沉淀濃縮RNA?；蛴卯惐汲恋頋饪s。處理的水溶解RNA經(jīng)DEPC處理的水溶解材料準(zhǔn)備及裂解RNA的提取的提取盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位，盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位，現(xiàn)取現(xiàn)提?，F(xiàn)取現(xiàn)提。組培細(xì)胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組組培細(xì)胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，織選取雜質(zhì)少的部位,細(xì)菌和酵母需要?jiǎng)驖{處理?？椷x取雜質(zhì)少的部位細(xì)菌和酵母需要?jiǎng)驖{處理。對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，對不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的RNA樣品儲存液中保存。樣品儲存液中保存

29、。專門的樣品儲存液中保存液氮研磨時(shí)不要使液氮揮發(fā)凈，隨時(shí)補(bǔ)充；液氮研磨時(shí)不要使液氮揮發(fā)凈，隨時(shí)補(bǔ)充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。底而迅速地勻漿。雜質(zhì)的抽提RNA的提取的提取采用有機(jī)（采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻氯仿）離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間，使蛋白質(zhì)、多糖和離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間，使蛋白質(zhì)、DNA分布到中間層和有機(jī)相中RNA留在水相中分布到中間層和有機(jī)相中，DNA分布到中間層和有機(jī)相中，RNA留在水相中對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，對脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，可以再次用有機(jī)溶劑抽提RNA的沉淀和溶解的沉淀和溶解RNA的提取的提取含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖RNA的水相過吸附柱，的水相過吸附柱等雜質(zhì)或使用異