拉米夫啶耐藥及實驗室檢測

1、慢性乙肝診斷與治療中的分子指標(biāo)1乙型肝炎病毒感染的現(xiàn)狀全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒，中國有1.2億人感染，其中每年約有1-2%會出現(xiàn)肝硬化或肝癌而死亡2HBV病毒顆粒感染肝細(xì)胞及DNA復(fù)制過程3慢性乙肝的診斷HBsAg持續(xù)陽性6個月以上HBV-DNA高于105拷貝/毫升ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高4慢性乙肝的分類HBeAg陽性乙肝：HBsAg、HBeAg陽性； HBV-DNA高于105拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高HBeAg陰性乙肝：HBsAg、anti-HBe陽性； HBV-DNA高于104拷貝/毫升；ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高5診斷慢性乙肝的指標(biāo)生化指標(biāo)：ALT免疫學(xué)指標(biāo)：HBsAg

2、（攜帶指標(biāo)）、HBeAg（活動指標(biāo)）病毒學(xué)指標(biāo)：HBV-DNAHBeAg陰性乙肝缺乏病毒活動的免疫學(xué)指標(biāo)，前S1可以彌補這一缺憾，提供HBeAg陰性乙肝患者病毒活動的免疫學(xué)指標(biāo)6HBV-DNA檢測的基本要求雖然國內(nèi)HBV-DNA檢測都用實時熒光PCR法，但不同廠家的產(chǎn)品定量標(biāo)準(zhǔn)的賦值有差異，從而導(dǎo)致定量結(jié)果的差異，而準(zhǔn)確的定量結(jié)果直接影響到對病人的診斷以及治療方案的選擇復(fù)星HBV-DNA試劑是國內(nèi)唯一一個經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品溯源的產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)品直接用國家標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)，從而保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，能夠為慢性乙肝患者的診斷和治療提供更為客觀的依據(jù)7慢性乙肝治療的長期目標(biāo)防止發(fā)展成為肝硬化或肝細(xì)胞癌在臨床上，往往以

3、比較現(xiàn)實的短期目標(biāo)來代替長期目標(biāo)8慢性乙肝治療的短期目標(biāo)病毒抑制：表現(xiàn)為HBeAg血清轉(zhuǎn)換和HBV-DNA陰轉(zhuǎn)肝損傷程度降低：表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶恢復(fù)正常完全清除病毒：表現(xiàn)為HBsAg消失，HBsAb出現(xiàn)，血清和肝細(xì)胞中檢測不到HBV-DNA從目前水平來看，不可能完全清除病毒9治療慢性乙肝的藥物免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、PEG干擾素、胸腺肽核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋等10拉米夫定治療與轉(zhuǎn)氨酶濃度拉米夫定治療一年后的HBeAg陰轉(zhuǎn)率和HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率： ALT濃度低于2倍正常值高限：5% ALT濃度介于2-5倍正常值高限：26% ALT濃度高于5倍正常值高限：64%11HBV-DNA定量檢測

4、的臨床應(yīng)用慢性乙肝診斷治療監(jiān)測和療效評價跟蹤隨訪預(yù)后判斷12HBV-DNA定量 慢性乙肝的診斷HBsAg陽性六個月以上ALT持續(xù)升高或反復(fù)升高HBV-DNA大于105拷貝/毫升（HBeAg陽性）或104拷貝/毫升（HBeAg陰性）13HBV-DNA定量 抗病毒治療的條件ALT高于2ULN（正常值上限）HBV-DNA大于105拷貝/毫升（HBeAg陽性）或104拷貝/毫升（HBeAg陰性）ATL持續(xù)正常的患者可暫不進(jìn)行治療，每隔3-6個月隨訪肝功能、血清病毒學(xué)標(biāo)志物和進(jìn)行肝細(xì)胞肝癌監(jiān)測 ALT水平在1-2倍ULN之間，需根據(jù)具體情況(如肝活檢結(jié)果等)， 在告知患者治療的利與弊、了解患者配合程度的

5、前提下，決定是否實施治療。無論治療與否均應(yīng)密切隨訪，為治療提供更為科學(xué)的根據(jù)14HBV-DNA定量 慢性乙肝的治療監(jiān)測治療前檢測患者的基線水平（ALT、HBV-DNA）治療開始后前三個月每月一次、以后每三個月一次檢測ALT、HBV-DNA，對于HBeAg陽性患者，還需檢測HBeAg如果治療期間HBV-DNA水平降低兩個數(shù)量級，可以認(rèn)為治療有效15HBV-DNA定量 療效評價（1）生化學(xué)應(yīng)答：完全應(yīng)答：2次監(jiān)測ALT均復(fù)常(間隔1個月)；無應(yīng)答：ALT未恢復(fù)正常。值得注意的是評價生化學(xué)應(yīng)答時應(yīng)排除其他藥物或疾病對ALT升高或下降的影響 16HBV-DNA定量 療效評價（2）病毒學(xué)應(yīng)答：完全應(yīng)答按

6、所采用的HBV DNA檢測方法說明書上提供的實驗敏感性和檢測范圍確定，臨床上一般認(rèn)為采用國際公認(rèn)的檢測方法或敏感性相當(dāng)?shù)臋z測方法檢測HBV DNA定量105拷貝/毫升或斑點雜交法陰性為完全應(yīng)答；部分應(yīng)答為未達(dá)完全應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)但HBV DNA載量下降大于2個對數(shù)級；無應(yīng)答為未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)17HBV-DNA定量 療效評價（3）血清免疫學(xué)應(yīng)答：完全應(yīng)答為HBeAg/抗HBe血清轉(zhuǎn)換；部分應(yīng)答為HBeAg陰轉(zhuǎn)但未出現(xiàn)抗HBe；無應(yīng)答為未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)。18HBV-DNA定量 綜合療效評價（1）完全應(yīng)答為療程結(jié)束時，生化學(xué)、病毒學(xué)和血清免疫學(xué)所有指標(biāo)均達(dá)到完全應(yīng)答19HBV-DNA定量 綜合療效評價（2）部分應(yīng)答

7、為療程結(jié)束時，生化學(xué)、病毒學(xué)和血清免疫學(xué)指標(biāo)介于完全應(yīng)答和無應(yīng)答之間20HBV-DNA定量 綜合療效評價（3）無應(yīng)答為療程結(jié)束時，生化學(xué)、病毒學(xué)和血清免疫學(xué)指標(biāo)均為無應(yīng)答 HBeAg陰性伴HBV DNA活躍復(fù)制的慢性乙型肝炎患者不進(jìn)行血清免疫學(xué)應(yīng)答評價，但應(yīng)進(jìn)行生化學(xué)和病毒學(xué)指標(biāo)的療效評價21HBV-DNA定量 何時可以停藥（1）治療前HBeAg陽性的患者，治療1年時綜合療效達(dá)到完全應(yīng)答者建議至少繼續(xù)用藥6個月，期間每3個月1次復(fù)查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持續(xù)完全應(yīng)答者可停藥觀察 22HBV-DNA定量 何時可以停藥（2）治療前HBeAg陽性的患者，治療1年時綜合療效達(dá)到

8、部分應(yīng)答者建議繼續(xù)用藥直至達(dá)到完全應(yīng)答后，再繼續(xù)用藥至少6個月，期間每3個月1次復(fù)查ALT、HBV DNA、HBeAg/抗HBe，仍持續(xù)完全應(yīng)答者可停藥觀察23HBV-DNA定量 何時可以停藥（3）治療前HBeAg陽性患者治療1年時綜合療效仍無應(yīng)答可停藥觀察，或改用其他有效的抗病毒藥治療。對于有肝臟組織學(xué)檢查等其它臨床指征顯示病情進(jìn)展合并肝功能失代償或肝硬化的病人，不宜輕易停藥，并應(yīng)加強對癥保肝治療24HBV-DNA定量 何時可以停藥（4）HBeAg陰性伴HBV DNA活躍復(fù)制的慢性乙型肝炎患者，綜合療效完全應(yīng)答者療程至少2年；對于完成1年治療仍無應(yīng)答者可改用或加用其他有效 治療方案 25HB

9、V-DNA定量 治療后的隨訪無論有否治療應(yīng)答，都應(yīng)對患者定期隨訪。建議停藥后的前3個月每月1次、以后每36個月1次檢測ALT、AST、HBV血清標(biāo)志物和HBV DNA，以及臨床表現(xiàn)和不良反應(yīng)。隨訪至少6-12個月。如病情有變化，可隨時隨訪。26HBV拉米夫定耐藥雖然拉米夫定治療慢性乙肝療效顯著，但長期使用拉米夫定會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象使用一年、二年、三年、四年的耐藥比率為：15-32%、38%、56%、67%一旦出現(xiàn)拉米夫定耐藥突變（YMDD變異），大多數(shù)患者會在2-4個月之內(nèi)出現(xiàn)HBV-DNA和ALT反彈27YMDD變異檢測采用實時熒光定量PCR方法，不僅能夠檢測出現(xiàn)的突變類型（YVDD或YIDD）

10、，而且能夠確定突變株所占比例，對及時調(diào)整治療方案具有非常重要的意義能夠準(zhǔn)確穩(wěn)定的檢測到1%的突變株，能夠更早發(fā)現(xiàn)耐藥突變，盡早調(diào)整治療方案28HBV 拉米夫定耐藥突變檢測試劑原理Primer FPrimer FPrimer FProbeProbeProbePrimer HBVPrimer YIDDPrimer YVDDHBV檢測I突變檢測V突變檢測29YMDD的定量檢測采用選擇性引物，基于TaqMan實時PCR技術(shù)，在三個平行反應(yīng)中分別擴增總HBV(C管）、YIDD（I管）、YVDD（V管），根據(jù)管間Ct值差異計算突變毒株在病毒群體中的比例30YMDD的定量檢測31YMDD的定量檢測32YMD

11、D的定量檢測33YMDD的定量檢測34YMDD的定量檢測35與其它方法的比較Comparison of results obtained by sequencing, pyrosequencing and real-time PCRTypesSequencingpyrosequencingreal-time PCRrtM20425 (36%)24 (35%)23 (33%)rtM204I26 (38%)24 (35%)21 (30%)rtM204V18 (26%)19 (27%)20 (29%)rtM204I + rtM204V02 (3%)5 (8%)36YMDD變異定性判斷的臨界值定性判斷

12、：Ct 3.5，此時病毒群體中突變株比例大于10%與測序法比較，15例標(biāo)本結(jié)果完全符合37YMDD變異定性判斷的臨界值Wang et al, WJG, 12:1308-131138什么時候開始檢測YMDD變異拉米夫定治療過程中YMDD變異情況治療時間 HBV DNA大于104copies/ml例數(shù) YMDD變異例數(shù)* 6個月61（17%）612個月2614（54%）1224個月3826（68%）2436個月3838（100%）* 各組之間兩兩比較均有顯著差異（P0.05）。39YMDD變異株的動態(tài)變化40YMDD變異株的動態(tài)變化41YMDD檢測試劑應(yīng)用方法對接受拉米夫定治療的慢性乙肝患者進(jìn)行耐

13、藥監(jiān)測治療前檢測一次（約有10-20%的人在治療前就有YMDD變異）治療開始后第七個月開始，每三個月檢測一次42慢性乙肝的基因分型乙肝病毒分八個基因型：根據(jù)基因組序列的差異可以分為AH八種亞型，我國以B型（41%）和C型（53%）為主不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型對肝的損傷比B型嚴(yán)重，基因型C比基因型B更容易發(fā)展成為肝硬化不同的基因型對藥物的應(yīng)答也不一樣：基因型B比基因型C對干擾素治療的應(yīng)答率高43HBV基因分型PCR檢測試劑運用多重、多色實時PCR技術(shù)，分別對乙肝病毒（HBV）各種基因型序列進(jìn)行分析根據(jù)國內(nèi)HBV基因型的特點，設(shè)計能檢測HBV AD四種基因型特異性引物及探針研制開發(fā)

14、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的乙肝病毒（HBV）基因分型多重、多色實時PCR檢測試劑盒 44HBV基因分型結(jié)果判斷方法45HBV基因分型分型識別率分型識別率（12+22）/359746HBV基因分型分型靈敏度（1）HBV B型血清樣本靈敏度約在2103IU/ml47HBV基因分型分型靈敏度（2）HBV C型血清樣本靈敏度約在1103IU/ml48共價閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)檢測HBV cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復(fù)制的原始模板只有徹底清除了cccDNA，乙肝的治療才能算真正有效HBV cccDNA可作為評價抗病毒治療效果新的有效指標(biāo)49HBV cccDNA PCR檢測試劑運用實時PCR技術(shù)

15、，根據(jù)乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）和雙鏈松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）分子結(jié)構(gòu)上的差異，即rcDNA負(fù)鏈上的缺口和正鏈的不完整性，設(shè)計一對特異性cccDNA的引物，分別雜交于1500和2100鄰近區(qū)域(以EcoR I切點為物理起始原點)，同時設(shè)計一條雜交于負(fù)鏈3端近缺口處檢測探針，研制開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的HBV cccDNA實時PCR檢測試劑盒。50HBV cccDNA檢測試劑原理rcDNA不能被擴增無熒光信號cccDNA能被擴增檢測到熒光信號P118201590+ 3200（1）EcoR I P2EcoR I5+ P2 3200(1)53159031820P151阿德福韋治療乙

16、型肝炎阿德福韋為5-單磷酸脫氧阿糖腺苷類似物，可明顯抑制HBV DNA復(fù)制 HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年時的耐藥發(fā)生率分別為0%、1.6%、3.1%HBeAg陰性者1、2、3年的耐藥發(fā)生率分別為0%、3.0%、5.9%11% 52阿德福韋耐藥突變位點 rtN236T、rtA181V 53恩替卡韋治療乙型肝炎拉米夫定耐藥的病毒株對恩替卡韋敏感性降低8至30倍；發(fā)生YMDD變異患者治療1 年時對恩替卡韋耐藥發(fā)生率為5.8%，并出現(xiàn)相關(guān)的位點變異。 54 恩替卡韋耐藥突變位點如果乙肝病毒多聚酶存在rtL180M和/或rt M204V/I，rtT184，rtS202和/或rtM250等位點變異將造成對恩替卡韋耐藥 551896突變的診療意義G1896A點突變，形成終止密碼子 (TAG)，不表達(dá)HBeAg；