分子雜交基因芯片課件

1、第四章 基因操作中大分子的分離和分析三、分子雜交分子雜交：指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或 RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則經(jīng)過(guò)退火 處理，形成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程。由于操作方式相似，通 常將檢測(cè)蛋白質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)也看作是分子雜交。作用：用于檢測(cè)混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì) 是否存在，以及其相對(duì)分子質(zhì)量的大小。 分類(lèi)：根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同可分為Southern雜交、 Northern雜交、Western雜交。Southern雜交： 即DNA-DNA雜交分析，檢測(cè)樣品中特定的DNA及其含量 。Northern雜交： 即RNA-DNA雜交分析。檢測(cè)樣品中是否含有特定 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（

2、mRNA）及其含量 。Western雜交： 即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 膜上的特異性蛋白質(zhì)。 Southern雜交 1975年，英國(guó)Southern創(chuàng)建 1.是一種檢測(cè)DNA分子的一種方法，通過(guò)southern印跡轉(zhuǎn)移將瓊脂糖凝膠上的DNA分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后進(jìn)行分子雜交，在濾膜上找到與核酸探針有同源序列的DNA分子。2.主要步驟：（1）待測(cè)DNA樣品的制備、酶切（2）待測(cè)DNA 樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳（3）凝膠中DNA的變性：堿變性（4）Southern轉(zhuǎn)膜： 硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜 毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法（5）探針的制備（6）Sou

3、thern雜交(預(yù)雜交、雜交） 預(yù)雜交的意義：將濾膜的空白處用魚(yú)精DNA或牛奶蛋白 封閉起來(lái)，防止在雜交過(guò)程中濾膜本身對(duì)探針的吸附。 （7）洗膜 經(jīng)過(guò)一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針?lè)肿映?去。 （8）雜交結(jié)果的檢測(cè)3.Southern 印跡轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)膜）印跡轉(zhuǎn)移（blotting) ：通過(guò)電泳將DNA、RNA或蛋 白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，使不同相對(duì)分子質(zhì)量的的分子 在凝膠上展開(kāi)，然后將凝膠上的樣品通過(guò)影印的方 式轉(zhuǎn)移到濾膜上的過(guò)程稱(chēng)為印跡。 4.探針及探針的標(biāo)記 探針：分子雜交中被標(biāo)記的已知序列的核酸片斷稱(chēng)為探針。 （1）探針的種類(lèi)： 根據(jù)探針的標(biāo)記物不同：放射性探針和非放射性探針； 根據(jù)探針的來(lái)源及核酸

4、性質(zhì)不同：分為DNA探針,RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類(lèi)。 Western雜交中的抗體被看作探針。（2）探針的標(biāo)記： i）標(biāo)記物 同位素標(biāo)記：32P、35S、3H等 非同位素標(biāo)記：生物素、地高辛、熒光素等ii）標(biāo)記方法 a 均勻標(biāo)記 b末端標(biāo)記帶有放射性的已知序列的核酸片斷標(biāo)記已知序列的核酸片斷5 標(biāo)記已知序列的核酸片斷3 a 切口平移法(nick translation)：大腸桿菌的DNA聚合酶b 隨機(jī)引物法(random primer)：六核苷酸殘基的引物c PCR擴(kuò)增標(biāo)記法:d末端標(biāo)記法: 5335535355PCR擴(kuò)增法標(biāo)記示意圖T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T

5、4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPMg2+ pppATP（g-32P-ATP3 HOp 5 5 p HO 3 a. 放射性標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：制作簡(jiǎn)單、 高比放射性、 放射自顯影效果好。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：半衰期短（32P只有14.3天）、 不易保存、 對(duì)人體有害。 要求在專(zhuān)門(mén)實(shí)驗(yàn)室操作。（3）標(biāo)記物及其檢測(cè)b.非放射性標(biāo)記： 地高辛標(biāo)記地高辛可以與dNTP連接成地高辛-dUTP( UTP)等，參入DNA(RNA)的合成過(guò)程，形成地高辛標(biāo)記的DNA(RNA)探針。利用抗地高辛的抗體通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)來(lái)完成。探針檢測(cè)原理地高辛探針

6、序列待測(cè)基因地高辛抗體酶底物產(chǎn)物探針DNA用地高辛標(biāo)記。地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個(gè)顯色反應(yīng)。地高辛抗體與地高辛結(jié)合。偶聯(lián)酶及其底物酶：堿性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP）催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過(guò)程生成有色的產(chǎn)物。酶的作用：AP的顯色反應(yīng)底物(4) 單鏈探針的獲取f1-orilacZPT7MCSpBluescriptPT32958 bpAprNorthern 印跡雜交(Northern bloting)檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉(zhuǎn)膜：不需變性Western雜交印跡轉(zhuǎn)移的是蛋白質(zhì)雜交過(guò)程：抗原抗體反應(yīng)探

7、針是針對(duì)某一蛋白質(zhì)的特異性的抗體。其他分子雜交菌落雜交：就是將細(xì)菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點(diǎn)種在濾膜上然后再生長(zhǎng)出可見(jiàn)的菌落，對(duì)濾膜上的菌體進(jìn)行原位裂解使 DNA 釋放出來(lái)，并使之固定在濾膜上。然后通過(guò)分子雜交，判斷哪個(gè)或哪些菌落含有與探針同源的DNA 。菌落雜交主要用來(lái)從用質(zhì)?；?Cosmid 構(gòu)建的基因文庫(kù)中尋找陽(yáng)性克隆。噬菌斑雜交：以噬菌斑改為菌落。斑點(diǎn)雜交：是分子雜交中最簡(jiǎn)單的一種，直接將DNA或RNA分子以斑點(diǎn)的形式固定在雜交濾膜上，然后進(jìn)行分子雜交。 其雜交的信號(hào)比菌落雜交和噬菌斑雜交受到蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分的干擾小，其結(jié)果的可靠性更強(qiáng)。 當(dāng)核酸分子的斑點(diǎn)面積變得更小，在單位面積濾膜

8、上處理的樣品數(shù)量就更多，當(dāng)檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步提高后，就發(fā)展成 DNA 芯片。 四、基因芯片技術(shù)（一）、生物芯片的定義 生物芯片（Biochip）是指通過(guò)機(jī)器人自動(dòng)印跡或光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于芯片表面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。基因芯片：又稱(chēng) DNA 芯片或DNA陣列，是生物芯片的一種類(lèi)型，它是將 DNA 分子固定于支持物上，并與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)自動(dòng)化儀器檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)判斷樣品中靶分子的數(shù)量，進(jìn)而得知樣品中mRNA的表達(dá)量。也

9、可進(jìn)行基因突變體的檢測(cè)和基因序列的測(cè)定。6400點(diǎn)的基因芯片 （面積 12X14 mm)基因芯片分析的過(guò)程主要包括：樣品及其標(biāo)記處理、芯片制作、分子雜交、信號(hào)的檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理及分析等。（三）、生物芯片的分類(lèi) 1按載體材料不同 玻璃芯片 硅芯片 陶瓷芯片 目前，玻片材料因易得、熒光背景低、應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)在國(guó)際上被廣泛接受。通常是將玻片用化學(xué)方法處理并連接上活性基團(tuán)，如氨基、醛基、巰基等，使生物分子通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與載體結(jié)合。 2按點(diǎn)樣方式不同 原位合成芯片（Loci-synthetic DNA Chip微矩陣芯片（Microarray）電定位芯片（Microelectronic） 是利用靜電吸

10、附的原理將DNA快速定位在硅基 質(zhì)、導(dǎo)電玻璃上。3按芯片固定的生物分子類(lèi)型 基因芯片或 DNA 芯片 蛋白質(zhì)芯片（Protein Chip） 芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-Chip） 在微小的硅材料表面，制造出能夠?qū)ξ⒘繕悠愤M(jìn)行變性、分離、純化、電泳、PCR擴(kuò)增、加樣及檢測(cè)等微小結(jié)構(gòu)，使過(guò)去一個(gè)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟微縮于一個(gè)芯片上，這種技術(shù)被稱(chēng)為芯片實(shí)驗(yàn)室。顧秉林校長(zhǎng)參觀(guān)北京博奧生物芯片有限公司 博奧研制的獸藥殘留蛋白芯片檢測(cè)平臺(tái)系統(tǒng) 4按芯片使用功能和用途不同分類(lèi) 測(cè)序芯片 表達(dá)譜芯片 基因差異表達(dá)分析芯片 基因功能分析研究 將成千上萬(wàn)個(gè)我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對(duì)來(lái)源于不同個(gè)體、

11、不同組織、不同細(xì)胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激（包括不同誘導(dǎo)不同治療手段）下細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性進(jìn)行綜合評(píng)定與判斷，極大加快這些基因功能的確立。（四）、基因芯片技術(shù)的特點(diǎn)高通量、微型化： 基因芯片技術(shù)的特點(diǎn)的核心是微型化。芯片每平方厘米固體表面上可固定十萬(wàn)個(gè) DNA 片段、數(shù)萬(wàn)個(gè)基因。一次分析可得到數(shù)萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)信息。微型化的另一方面是樣品用量與試劑用量的微量化，用納克級(jí)的 mRNA 、微升級(jí)的雜交液就能分析成 千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)信息。平行化： 基因芯片技術(shù)可在同一張

12、芯片上同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì) 照材料進(jìn)行雜交分析，實(shí)現(xiàn)了平行化操作，避免了各種 誤差，提高了信息的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有 可比性。自動(dòng)化： 芯片制作及分析過(guò)程易于自動(dòng)化。芯片設(shè)計(jì)制作可 實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可根據(jù)要求將需要分析的基因制作成符合 要求的芯片；雜交、洗片等過(guò)程都可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，工作 效率大幅提高。 （五）、 基因芯片的制作 必須要有代表所要分析基因的DNA樣品。1DNA 樣品的來(lái)源 （1）從細(xì)胞或組織中提取mRNA 后反轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫(kù)，經(jīng)測(cè)序及生物信息學(xué)分析得到代表各個(gè)基因的DNA序列，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)或DNA固相合成獲取所期望的各種基因片段；（2）利用基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，經(jīng)生物信息學(xué)分

13、析得到代表各個(gè)基因的序列數(shù)據(jù)，再利用PCR擴(kuò)增技術(shù)或DNA固相合成技術(shù)獲取人們期望的各種基因片段。2生物芯片的制作 生物芯片微陣列的制作按照制作方法可分為兩大類(lèi)，即原位合成和預(yù)合成后點(diǎn)樣。 接觸點(diǎn)樣法 噴墨法 光刻 DNA 合成法 （五）、 基因芯片的雜交及結(jié)果分析 1探針的標(biāo)記 標(biāo)記的方法通常是在反轉(zhuǎn)錄的底物中加入帶有標(biāo)記基團(tuán)的寡核苷酸單體，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將標(biāo)記分子摻入 cDNA 分子中。 雙色熒光標(biāo)記技術(shù)（Cy3,Cy5)是常用的標(biāo)記技術(shù). 2雜交 在一定的條件下，分子間氫鍵的斷裂與恢復(fù)是 DNA/DNA 、 DNA/RNA 分子間選擇性結(jié)合的根本動(dòng)力，這一過(guò)程稱(chēng)之為雜交。3芯片結(jié)果讀取與掃描

14、儀 生物芯片掃描儀：激光系統(tǒng)掃描儀（共聚焦/非共聚焦） 和CCD系統(tǒng)掃描儀 分次掃描，同時(shí)掃描， 4生物芯片的軟件系統(tǒng)與數(shù)據(jù)處理 偽色圖： Cy3,Cy5 若以紅色表示處理樣品，以綠色表示對(duì)照樣品，重疊變成黃色，如某一點(diǎn)（代表一個(gè)基因）呈紅色就表明該基因的表達(dá)上升，若某一點(diǎn)呈綠色就表明該基因的表達(dá)下降，表達(dá)量 。相等為黃色（六）、 基因芯片的應(yīng)用 1基因表達(dá)分析；2基因型及多態(tài)性分析； 3雜交測(cè)序； 4核酸和蛋白質(zhì)相互作用的研究；5疾病的診斷與治療；6藥物開(kāi)發(fā)； 7在營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用； 8在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。 五、RNAi技術(shù)1. 定義RNA干擾( RNA interference

15、, RNAi) ：是指在生物體 細(xì)胞內(nèi)，由于外源或內(nèi)源性雙鏈RNA的存在，誘導(dǎo)體內(nèi) 同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。 不破壞或改變?cè)瓉?lái)的目的基因，但可以降低目的基因的 表達(dá)。因此是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默( post transcriptional gene silencing, PTGS) 機(jī)制。2.RNAi的發(fā)現(xiàn)“ 共抑制( co- suppression)” 發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的RNA 水平1990年, Napoli CD 1995年，Guo S等試圖阻斷秀麗新小桿線(xiàn)蟲(chóng)（C. elegans）中的par-1基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)： 反義RNA 特異性地阻斷par-1基因的表達(dá)； 正義RNA

16、以期觀(guān)察到基因表達(dá)的增強(qiáng)。結(jié)果: 二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋不相符合。該研究小組一直沒(méi)能給這個(gè)意外以合理解釋。 RNAi的提出uninjected, no probeuninjected, mex-3 probeantisense mex-3 RNA, mex-3 probe double-stranded mex-3 RNA injected, mex-3 probe1998年2月，F(xiàn)ire A和Mello C體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線(xiàn)蟲(chóng)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱經(jīng)過(guò)純化的雙鏈RNA能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)證實(shí)，Guo S

17、博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過(guò)去的反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。該小組將這一現(xiàn)象稱(chēng)為RNA干擾（RNA interference，簡(jiǎn)稱(chēng)RNAi）。Zamore, P. D. Science 296, 1265-1269 (2002)dsRNA55RNA-induced silencing complex (active, 100kDa complex)small interfering RNAsMechanism of RNAi post-transcriptional gene silencing(inactive,

18、250-500kDa complex)(endonucleolytic cleavage in the region of homology)(a critical step in the activation of RISC)Zamore, P. D. Science 296, 1265-1269 (2002)RNAi 誘導(dǎo)特異性基因沉默的機(jī)制研究（1） dsRNA的降解，siRNA的形成 dsRNA 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi), 與一種核酸內(nèi)切酶Dicer 結(jié)合, 并被酶切成19 23nt 的小干擾RNA( small interference RNA, siRNA) , （2 ）沉默復(fù)合物的形成 siRNA