多肽修飾的PEGMAGMA涂層構(gòu)建方法研究報(bào)告

1、編號：2本科畢業(yè)論文多肽修飾的PEGMA-GMA涂層構(gòu)建方法研究院系：化學(xué)化工系姓名：X麗學(xué)號：1033110152專業(yè)：化學(xué)年級：2010級指導(dǎo)教師：魏雨職稱：講師完成日期：2014年05月12日摘要聚乙二醇(PEG)聚合物因具有良好的親水性和生物相容性而被廣泛應(yīng)用在聚合物膜、硅基材料外表和金屬外表的防污以及防止蛋白質(zhì)、細(xì)菌或微生物在聚合物膜外表的吸附和粘接。本文擬用偶氮二異丁腈(AIBN)作為引發(fā)劑，使甲基丙烯酸縮水甘油酯GMA和聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)在四氫味喃與無水乙醇的混合溶液中以不同比例進(jìn)展自由基聚合反響，并由氫核磁共振分析儀(1HNMR)檢測合成的聚合物分子構(gòu)造，進(jìn)一步

2、制備能穩(wěn)定存在于基材外表的可功能化涂層，通過與短肽RGD,REDV,YIGSR氨基反響后，將短肽固定在涂層外表，并完成對不同種多肽粘附性差異的表征。關(guān)鍵詞：PEG共聚物；涂層構(gòu)建；短肽AbstractPolyethyleneglycol(PEG)polymerduetohydrophilicityandexcellentbiopatibilityandiswidelyusedinthepolymerfilm,themetalsurfaceandtheanti-foulingmaterialandtopreventthesiliconsurfaceproteins,bacteriaormicro

3、organismsinthepolymerandbondingthemembranesurfaceadsorption.Thispaperusingazobisisobutyronitrile(AIBN)asaninitiator,sothatglycidylmethacrylate(GMA)andpolyethyleneglycolmethacrylate(PEGMA)inamixedsolutionoftetrahydrofuranandethanolinadifferentradicalpolymerizationratiobyprotonnuclearmagneticresonance

4、analyzer(1HNMR)andFouriertransforminfraredanalyzer(FTIR)detectingthemolecularstructureofsyntheticpolymers,canbestableinthefurtherpreparationofthebasecoatsurfacecanbefunctionalized,withtheshortpeptideRGD,REDV,afterYIGSRaminoreaction,thepeptidecoatingsurfaceisfixedandpletecharacterizationofthedifferen

5、tpolypeptidesadhesiondifferences.Keywords:PEGcopolymer;Coatingbuild;Shortpeptides目錄引言1 TOC o 1-5 h z 研究背景1PEG修飾的材料外表阻抗蛋白質(zhì)吸附機(jī)理1RGD,REDV,YIGSR三種多肽的特性2本文研究思路3 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 實(shí)驗(yàn)局部3儀器與試劑3主要儀器3主要試劑3PEG共聚物的合成4PEG共聚物涂層的構(gòu)建5PET基底材料的處理52.2.3PEG共聚物涂層的制備52.4多肽的固定5固定多肽的PEG共聚物涂層構(gòu)建5探究不同種類

6、多肽的粘附性差異7 HYPERLINK l bookmark12 o Current Document 結(jié)果與討論7共聚物的氫核磁表征7涂層的構(gòu)造8接枝前后多肽溶液的紫外表征9 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 結(jié)論與展望10結(jié)論10展望10參考文獻(xiàn)11致謝12引言研究背景蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)根底，廣泛地存在于生物體中，并且對生物體有著重要的功能。然而蛋白質(zhì)一旦與人造生物材料外表接觸，很容易發(fā)生吸附現(xiàn)象，對這些材料造成污染，影響生物材料的性能，有時(shí)甚至危及生命平安。體內(nèi)植入材料外表的蛋白吸附會誘發(fā)體內(nèi)的生物排異反響，導(dǎo)致血栓形成，細(xì)菌繁殖與感染1

7、。此外，在非生物體內(nèi)應(yīng)用中，材料外表的蛋白質(zhì)吸附也有諸多危害，如在船舶航行過程中，會有大量的生物體如細(xì)菌、貝類、藻類等附著在船體外表上2-3，增大航行阻力，增加燃料消耗。在這些與人們生產(chǎn)生活密切相關(guān)的生物技術(shù)應(yīng)用中所涉及的一個(gè)共性科學(xué)問題就是如何減少蛋白質(zhì)的吸附。因此，研究具有阻抗蛋白質(zhì)吸附性能的材料外表已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，對材料外表阻抗蛋白質(zhì)吸附機(jī)理的深入了解將對隱形眼鏡、醫(yī)用植入材料、船體涂料、藥物傳遞系統(tǒng)、生物芯片等應(yīng)用起非常重要的指導(dǎo)作用。聚乙二醇(PEG)又稱聚氧乙烯(PEO),是一種非枝化水溶性高分子化合物，其分子量分布X圍很廣；PEG(PEO)完全溶于水，并能與很多物質(zhì)相容，

8、有很好的穩(wěn)定性和潤滑性，低毒且無刺激性。PEG(PEO)具有獨(dú)特、有效的抗蛋白質(zhì)吸附或血液相容的能力。在目前被采用的抗污染材料中，PEG(PEO)的應(yīng)用最為廣泛，抗污染效果最好。因而，PEG(PEO)常被作為“標(biāo)尺，衡量其他材料的抗污染性能。由于PEG(PEO)及其衍生物具有優(yōu)良的抑制蛋白質(zhì)吸附性能以及生物相容性，研究者們嘗試了大量方法把PEG(PEO)及其衍生物用于材料的外表改性。課題組4-7以含PEO的兩親性嵌段共聚物Pluronic(PEO-PPO-PEO)為改性劑，基于外表偏析原理構(gòu)建抗污染超濾膜，發(fā)現(xiàn)成膜過程親水PEO段自發(fā)富集在膜外表，而疏水PPO段起到很好的錨定作用，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)

9、在膜外表的超低吸附甚至“零吸附和純水清洗下通量恢復(fù)率接近100%。PEG修飾的材料外表阻抗蛋白質(zhì)吸附機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，材料外表的化學(xué)組成、親疏水性、外表電荷、形貌構(gòu)造等因素對蛋白質(zhì)在材料外表的吸附行為具有較大的影響8。目前，對于材料外表阻抗蛋白吸附的機(jī)理主要有水化層理論、空間位阻理論，下面就本實(shí)驗(yàn)涉及到的空間位阻理論加以說明。StableUftstabke圖1PEG抗蛋白質(zhì)污染的空間位阻效應(yīng)示意圖最初的抗污染機(jī)理是人們基于對PEG抗污染性質(zhì)研究的逐步深入而建立的。如前所述，PEG是常見的具有優(yōu)異抗蛋白質(zhì)吸附性能的聚合物。PEG分子的抗污染機(jī)理通常用空間阻力模型來解釋。這種模型認(rèn)為，PEG分子能迅速

10、形成水化聚合物鏈，具有很大的排除體積，從而防止蛋白質(zhì)到達(dá)PEG外表。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子接觸PEG外表并發(fā)生粘附時(shí)，會在較大程度上壓縮PEG鏈的排除體積，PEG分子構(gòu)象受到限制，是一種嫡減的不穩(wěn)定狀態(tài)如圖1所示。實(shí)驗(yàn)和分子模擬證明PEG的抗污染能力取決于PEG鏈在材料外表的密度和長度9-10。RGD,REDV,YIGSR三種多肽的特性RGD三肽（精氨酸-甘氨酸-大冬氨酸）是許多細(xì)胞膜和ECM中所共有的細(xì)胞間識別的最小序列，而這一序列在介導(dǎo)細(xì)胞粘附和鋪展方面起著非常重要的作用11。Klok等12通過聚合物刷將RGD短肽固定在外表后發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附得到很大的改善。Holland等13將RGD和纖連蛋白分

11、別固定于聚苯乙烯上研究了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)RGD和纖連蛋白修飾的外表內(nèi)皮細(xì)胞相容性均有顯著提高，而且RGD修飾的外表細(xì)胞粘附、生長更加良好。Hubbell等14發(fā)現(xiàn)，REDV短肽序列可以選擇性的增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞粘附機(jī)制，這種粘附作用不同于整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附機(jī)制，具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性。Hubbell等15研究了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在接枝固定了REDV短肽片段的基材外表的粘附和鋪展行為，發(fā)現(xiàn)4小時(shí)后REDV接枝外表內(nèi)皮細(xì)胞的鋪展率要強(qiáng)于RGD。.Hodde等16研究了分別經(jīng)RGD,REDV,LDV和PHSRN序列預(yù)處理的豬細(xì)胞外基質(zhì)膜對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附率的影響，發(fā)現(xiàn)只有RGD和REDV

12、序列可以有效地調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞在豬細(xì)胞外基質(zhì)膜外表的粘附。本文研究思路本文擬用偶氮二異丁月青作為引發(fā)劑，使甲基丙烯酸縮水甘油酯和聚乙二醇甲基丙烯酸酯在四氫吠喃與無水乙醇的混合溶液中進(jìn)展自由基聚合，進(jìn)一步制備能穩(wěn)定存在于PET基材外表的可功能化涂層，通過與短肽RGD,REDV,YIGSR進(jìn)展氨基反響后，將短肽固定在涂層外表，從而構(gòu)建了一種對細(xì)胞具有特異性粘附的生物活性外表，并對三種多肽粘附性差異的進(jìn)展了相關(guān)表征。2實(shí)驗(yàn)局部儀器與試劑主要儀器表1主要儀器設(shè)備序號設(shè)備名稱型號生產(chǎn)J家1集熱式恒溫加熱磁力拌器DF-101S鞏義巾英峪華儀器廠制造2循環(huán)水式真空泵SHZ-Dem鞏義巾英峪華儀器廠制造3紫外分光

13、光度計(jì)722XX佑科儀器儀表XX4傅里葉變換紅外光譜儀BrukerTensor27德國Bruker公司5氫核磁共振分析儀BrukerAm400MHz德國Bruker公司主要試劑表2主要試劑序號試齊型號生產(chǎn)廠家1聚乙二醇甲基丙烯酸酯分析純XX亞科化學(xué)試劑制造XX2甲基丙烯酸縮水甘油酯分析純XX亞科化學(xué)試劑制造XX3偶氮二異丁睛分析純XX亞科化學(xué)試劑制造XX4四氫吠喃分析純XX巾富宇精細(xì)化工XX5無水乙醇分析純XX市雙雙化工XX6無水乙醛分析純XX市雙雙化工XX7硫酸分析純XX昊化化學(xué)試劑XX8過氧化氫分析純XX市凱XX學(xué)試劑XX91,6-己二胺分析純XX亞科化學(xué)試劑制造XX10氯化鈉分析純XX市

14、恒興化學(xué)試劑制造XX11氯化鉀分析純XX市恒興化學(xué)試劑制造XX12磷酸二氫鉀分析純XX市恒興化學(xué)試劑制造XX13磷酸氫二鈉分析純XX市恒興化學(xué)試劑制造XX14多肽RGD分析純吉爾生化XXXX15多肽REDV分析純吉爾生化XXXX16多肽YIGSR分析純吉爾生化XXXXPEG共聚物的合成本實(shí)驗(yàn)中共聚物的合成，主要是利用PEGMA和GMA在引發(fā)劑AIBN的作用下聚合制得的。實(shí)驗(yàn)主要步驟：首先通過抽烤的方法對裝置除水除氧，然后將單體溶解注入到密封裝置，在60c下恒溫振蕩反響16h,反響產(chǎn)物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至3-5mL,濃縮后的溶液用冰乙醴進(jìn)展沉析，產(chǎn)物經(jīng)抽濾，真空枯燥保存?zhèn)溆肅H3反響原理如圖2所示

15、，兩種單體按不同投料比所得產(chǎn)物的量見下表表CH3CH3 IH2C = C I C = OH2C = CO=CAIBNH2 a CC=OO H2CC、oS3H2H2O= C- OfCH3OCH2H220圖2PEGMA與GMA反響的化學(xué)方程式表3PEGMA與GMA按不同投料比所得產(chǎn)物的量PEGMA質(zhì)量gGMA質(zhì)量gAIBN的質(zhì)量gn(PEGMA):n(GMA)產(chǎn)物質(zhì)量g10.96510.29710.0248120.375120.96050.15100.0206110.268531.91390.15570.0422210.8999PEG共聚物涂層的構(gòu)建PET基底材料的處理醫(yī)用PET膜：依次用丙酮、甲

16、醇和三蒸水超聲處理10分鐘，最后用三蒸水洗凈。N2吹干，保存?zhèn)溆?。取適量1,6-己二胺固體溶解于無水乙醇中，配制成10%的溶液，將預(yù)先處理好的PET膜片浸入到10%的1,6-己二胺溶液中，并在低溫下反響24h然后用三蒸水沖洗3遍，N2吹干，保存?zhèn)溆?。處理前后的膜片比擬見圖3圖3PET氨基化處理前后的膜片PEG共聚物涂層的制備仿生涂層的浸涂法制備：配制濃度為1mg/mL的聚合物-四氫吠喃涂層液，將已經(jīng)處理過的玻璃片或PET薄膜浸入所配制的溶液中，并在低溫下反響24h,然后用銀子將膜片勻速提起，在空氣中靜置一段時(shí)間，待THF揮發(fā)后，真空枯燥成膜，放在真空枯燥箱中保存?zhèn)溆?。接枝聚合物前后膜片的比擬見

17、圖4o圖4接枝聚合物前后膜片的變化多肽的固定固定多肽的PEG共聚物涂層的構(gòu)建(PBS緩沖溶液PH=7.4的配制分別稱取磷酸二氫鉀0.048g磷酸氫二鈉0.288g氯化鈉1.64氯化鉀0.04g,置于500mL的燒杯中，用200mL三蒸水進(jìn)展溶解，溶解完全后，用微孔濾膜進(jìn)展過濾至離心管中，低溫保存?zhèn)溆谩?2)多肽溶液500Ng/mPBS緩沖液，pH7.4的配制準(zhǔn)確稱量三種多肽固體RGD(0.005g),REDV(0.005g),YIGSR(0.004g)分別參加10ml的PBS緩沖液溶解，溶解完全后，取出2ml溶液用做標(biāo)準(zhǔn)曲線，剩余液體低溫保存?zhèn)溆谩?3)制備多肽修飾的PEG共聚物涂層首先將涂覆

18、聚合物的PET膜片剪成一樣大小，長寬均為18mm然后分別浸入到短肽RGD、短肽REDV和短肽YIGSR溶液中，低溫下反響24h。再用銀子取出，PBS溶液沖洗外表數(shù)次后常溫枯燥。接枝多肽的主要操作內(nèi)容見表4,接枝多肽前后膜片的比擬見圖5。表4接枝多肽的主要操作內(nèi)容固體多肽的PEG共聚物涂層的制備RGDREDVYIGSRPEGMA:GMA=1:13片3片3片1:23片3片3片2:13片3片3片GMA自身聚合3片3片3片圖5接枝多肽前后膜片的變化探究不同種類多肽的粘附性差異通過紫外分光光度計(jì)測定出多肽溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定與PEG聚合物反響前后多肽溶液吸光度A值的變化。由吸光度A值的變化依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲

19、線可得出多肽溶液濃度的變化Ac,進(jìn)而得出反響前后多肽溶液的變化量Am,因而可以分別計(jì)算出三種不同的多肽分子與PEG聚合反響的程度，即可得出不同種多肽粘附性的差異表5。表5多肽外表粘附性差異的表征多肽外表粘附性差異的表征RGDREDVYIGSR與PEG聚合物反響前多肽溶液的濃度Co500g/ml500g/ml400g/ml與PEG聚合物反響前多肽溶液的吸光度AAiA2A3與PEG聚合物反響后多肽溶液的吸光度AAiA2A3與PEG聚合物反響后多肽溶液的濃度cCiC2C33結(jié)果與討論本章主要是對制備的PEG共聚物進(jìn)展氫核磁表征，并對三種不同多肽在PEG聚合物涂層外表的接枝情況進(jìn)展測定。PEG共聚物的

20、氫核磁表征核磁共振波譜是物質(zhì)與電磁波相互作用而產(chǎn)生的，屬于吸收光譜波譜X疇。根據(jù)核磁共振波譜圖上共振峰的位置、強(qiáng)度和精細(xì)構(gòu)造可以研究分子構(gòu)造。本實(shí)驗(yàn)將聚合物用笊代氯仿溶解，配制成一定濃度的溶液，并用氫核磁共振分析儀對產(chǎn)品進(jìn)展氫核磁表征見圖6。H CeCo = c -OCH3H3C C圖6PEGMA-GMA聚合物的氫核磁共振譜圖共聚物由聚乙二醇甲基丙烯酸酯單體和甲基丙烯酸縮水甘油酯單體構(gòu)成，由氫核磁共振譜圖可以看出：6a=4.302HCOOCH2),從聚合物的構(gòu)造來看，亞甲基因與酯基相連，向低場移動，位移變大。1=3.6080H,-CH2-CH2-O-，此處吸收峰強(qiáng)度最強(qiáng)，明顯可以看出是氧乙烯長

21、鏈的吸收峰，而6=3.38(3H,OCH3),也可以看出是與氧乙烯長鏈相連的甲基的吸收峰。綜合這三組吸收峰，我們可以知道反響最終合成了想要得到的聚合物。涂層構(gòu)造實(shí)驗(yàn)中，通過化學(xué)接枝的方法先將PEG聚合物引入到涂層外表，然后利用聚合物上的環(huán)氧基團(tuán)與多肽中的氨基發(fā)生開環(huán)反響將多肽引入到涂層外表，這就構(gòu)建了一種對內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性吸附的生物活性外表，它兼具了PEG抗蛋白吸附的性能，同時(shí)能實(shí)現(xiàn)對內(nèi)皮細(xì)胞的特異性吸附，RGD,REDV,YIGSR三種多肽的涂層構(gòu)造見圖7a,b,Gabc圖7涂層構(gòu)造接枝前后多肽溶液的紫外表征通過紫外可見分光光度計(jì)分別測定出多肽RGD,多肽REDV,多肽YIGSR與聚合物反

22、響前后的紫外吸收曲線見圖8,從圖中可以看出三種多肽的最大吸收峰位置相近，都在280nm左右，但在最大吸收峰處吸光度值有一定的差異，這可能與其自身構(gòu)造有一定的關(guān)系。利用多肽溶液反響前后吸光度的差值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以知道反響前后多肽溶液的濃度對應(yīng)也有一個(gè)差值，同時(shí)反響前后體積不變，因而可以計(jì)算出與聚合物反響的多肽溶液的量，即可比擬出三種多肽粘附性的大小（見表6）。abc圖8三種多肽溶液與聚合物反響前后的紫外吸收曲線表6三種多肽粘附性大小的比擬變量多/AAAm(單位：mg)Am/S單位：g2dmRGD1.5031.2572.46431.69REDV1.5101.2662.37230.51YIGSR

23、1.5731.3052.25729.03由表6可以看出三種多肽都能在聚合物涂層外表發(fā)生吸附，且吸附量相近。但與實(shí)際吸附量相比，可能存在一定的誤差，這主要來自兩個(gè)方面：一是涂層外表固定多肽的過程中，取出膜片的時(shí)候，不可防止地會將一局部多肽溶液帶出，造成溶液的損失。二是所使用的紫外分光光度計(jì)運(yùn)行時(shí)不是太穩(wěn)定，測量的數(shù)據(jù)存在一定的誤差。4結(jié)論與展望結(jié)論(1)本文首先通過用偶氮二異丁月青作為引發(fā)劑，使聚乙二醇甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯在四氫吠喃與乙醇的混合溶液中發(fā)生自由基聚合反響，并由氫核磁共振分析儀(1HNMR)對合成的聚合物分子構(gòu)造進(jìn)展了表征，1HNMR結(jié)果證實(shí)了聚合物的構(gòu)造。進(jìn)一步通過化

24、學(xué)接枝反響將聚合物引入到PET基材外表，最后利用多肽的氨基反響將三種多肽RGD,REDV,YIGSR固定到涂層外表，從而構(gòu)建了一種對細(xì)胞具有特異性吸附的生物活性外表。(2)通過紫外表征可知，這三種多肽RGD,REDV,YIGSR均能在PEG聚合物涂層外表發(fā)生化學(xué)接枝反響，并且他們的接枝量相近，也就是說他們之間的粘附性存在一定的差異但并不是很明顯，這可能與他們自身的構(gòu)造有一定的關(guān)系。這對于探索出其他種類的多肽修飾的聚合物涂層外表有一定的啟示意義。展望聚乙二醇聚合物表現(xiàn)出來的良好的親水性和生物相容性，使其可以廣泛應(yīng)用在生物金屬材料外表改性等方面。但是PEG在有氧氣和過渡金屬離子存在的情況下，容易發(fā)

25、生自動氧化170這就需要更好地優(yōu)化反響條件，選擇適宜的修飾產(chǎn)物，適宜的PEG,對蛋白質(zhì)和多肽進(jìn)展定點(diǎn)修飾。如何使材料外表不受或者盡可能少受到生物污染，制備性能優(yōu)良的阻抗蛋白質(zhì)吸附材料，這將成為當(dāng)今生物醫(yī)用材料、生化別離、船體涂層材料等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。參考文獻(xiàn)HerrwerthS,EckW,ReinhardtS,etal.Factorsthatdeterminetheproteinresistanceofoligoetherself-assembledmonolayers-internalhydrophilicity,terminalHydrophilicity,andlateralpac

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