細(xì)胞培養(yǎng)物的污染及防止

1、細(xì)胞培養(yǎng)物的污染及防止 按現(xiàn)代的觀念，凡是混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存產(chǎn)生有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)該視為污染。根據(jù)這一概念，組織培養(yǎng)污染物應(yīng)包括生物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)（影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分）、細(xì)胞（非同種的其他細(xì)胞）。其中一微生物最為多見(jiàn)。另外，隨著使用細(xì)胞種類(lèi)增多，不同細(xì)胞交叉污染，尤其是Hela細(xì)胞的污染也時(shí)有發(fā)生，從而造成細(xì)胞不純。 一、污染途徑 污染物，特別是微生物常通過(guò)下列途徑進(jìn)入培養(yǎng)體系，造成污染 1 空氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑?？諝饬鲃?dòng)性大，如果培養(yǎng)操作場(chǎng)地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，

2、培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無(wú)菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩，以免因講話(huà)、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操作面，造成污染。 2 器材：各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導(dǎo)致污染，另外需要對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行定期消毒，防止形成污染 3 操作：實(shí)驗(yàn)操作無(wú)菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造成污染。培養(yǎng)兩種細(xì)胞以上時(shí)，操作不規(guī)范，交叉使用吸管或培養(yǎng)液、瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。 4 血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。 5 組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來(lái)源于組織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)。 二、污

3、染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染的檢測(cè) 由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽回。細(xì)胞污染早期或污染程度較輕時(shí)，如果能及時(shí)去除污染物，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)、但是當(dāng)污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，分類(lèi)象減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)細(xì)胞漿出現(xiàn)顆粒、污染較嚴(yán)重，細(xì)胞增值停止，分裂象消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓、脫壁。 （一）細(xì)菌污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染物的檢測(cè) 常見(jiàn)的污染細(xì)菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細(xì)菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不

4、易判斷。懷疑培養(yǎng)細(xì)胞有細(xì)菌污染時(shí)，取10ml細(xì)胞懸液離心1000轉(zhuǎn)5分鐘，沉淀中加入無(wú)抗生素培養(yǎng)液2ml,將細(xì)胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 如果培養(yǎng)無(wú)真的細(xì)菌污染，24小時(shí)內(nèi)可以獲得陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)污染的細(xì)菌量比較大或者細(xì)菌增殖到一定基數(shù)時(shí)，大約每20分鐘一代，會(huì)使培養(yǎng)系統(tǒng)中很快產(chǎn)生大量細(xì)菌，后者不僅可以消耗培養(yǎng)系統(tǒng)中的養(yǎng)分，還能釋放大量代謝產(chǎn)物。幾個(gè)小時(shí)后，增殖的細(xì)菌就可以導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。細(xì)菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液pH，使培養(yǎng)液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察，可見(jiàn)滿(mǎn)視野都是點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，原來(lái)的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細(xì)菌甚至可以覆蓋細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的生存構(gòu)成威脅。用青霉素、鏈霉素可以

5、預(yù)防細(xì)菌污染有效。 （二）真菌污染對(duì)細(xì)胞的影響及污染物的檢測(cè) 微生物污染中以真菌最多，真菌種類(lèi)繁多，形態(tài)各異，但是污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見(jiàn)；有的散在生長(zhǎng)，鏡下可見(jiàn)呈絲狀、管狀、樹(shù)枝狀，縱橫交錯(cuò)穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。真菌生長(zhǎng)迅速，能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞?？拐婢苿?duì)預(yù)防和排除真菌污染有效。 （三）支原體污染對(duì)細(xì)胞影響及污染物的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題,是細(xì)胞培養(yǎng)最常見(jiàn)的、干擾試驗(yàn)結(jié)果的一種污染。但由于不易被察覺(jué)，有些污染的細(xì)胞仍在被應(yīng)用。研究表明，95以上

6、是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是最常見(jiàn)的污染細(xì)胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細(xì)胞的支原體種類(lèi)是很多的，國(guó)外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。據(jù)查，目前各實(shí)驗(yàn)室使用的二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞中約有11%的細(xì)胞受到支原體污染。 污染來(lái)源包括工作環(huán)境污染、操作者本身污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。支原體污染后，因

7、為它們不會(huì)使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無(wú)明顯變化，外觀上給人以正常感覺(jué)，實(shí)則細(xì)胞手到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等。 細(xì)胞培養(yǎng)中，主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預(yù)防支原體的污染： 控制環(huán)境污染； 嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作； 細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無(wú)菌； 在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。 支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒(méi)有細(xì)胞壁，一般來(lái)講，對(duì)作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如 -內(nèi)酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等完全不敏感；對(duì)多粘菌素（polymycin）、利福

8、平、磺胺藥物普遍耐藥。對(duì)支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)及一些氟喹諾酮；其他類(lèi)抗生素如氨基糖苷類(lèi)、氯霉素對(duì)支原體有較小抑制作用，所以常不用來(lái)作為支原體感染的化學(xué)治療劑。 （四）細(xì)胞交叉污染對(duì)細(xì)胞的影響及污染物的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞間交叉污染并不罕見(jiàn)，多是由于在培養(yǎng)中操作時(shí)各種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、形態(tài)特征等發(fā)生變化，有些變化較輕、不易察覺(jué)，有些可能由于污染的細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)最終壓過(guò)原來(lái)細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，最終死亡。常用觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分析生長(zhǎng)特性和核型、檢測(cè)細(xì)胞的標(biāo)記物等方法檢測(cè)交叉污染的細(xì)胞。 三、污染

9、的預(yù)防:防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)該貫穿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的始終。 1.器皿準(zhǔn)備中的預(yù)防：用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿應(yīng)該嚴(yán)格消毒，做到真正潔凈；應(yīng)該無(wú)菌的物品，要做到消毒嚴(yán)格、真正無(wú)菌；器皿的運(yùn)輸、貯存過(guò)程中，要嚴(yán)格操作，謹(jǐn)防污染。 2.開(kāi)始操作前的預(yù)防：應(yīng)當(dāng)按廠家規(guī)定，定期清洗或更換超凈臺(tái)的空氣濾網(wǎng)，請(qǐng)專(zhuān)職人員定期檢查超凈臺(tái)的空氣凈化標(biāo)準(zhǔn)；檢查培養(yǎng)皿是否有消毒標(biāo)志，有條件得實(shí)驗(yàn)室可以使用一次性用品；檢查新配置的培養(yǎng)液，確認(rèn)無(wú)菌方可使用；操作前提前半小時(shí)啟動(dòng)超凈臺(tái)的紫外燈消毒；操作應(yīng)戴口罩，消毒雙手。 3.操作過(guò)程中的預(yù)防；主要包括：超凈臺(tái)內(nèi)放置的所有培養(yǎng)瓶瓶口不能與風(fēng)向相逆，不允許用手觸及器皿的無(wú)菌

10、部分，如瓶口和瓶塞內(nèi)側(cè)；在安裝吸管冒、開(kāi)啟或封閉瓶口操作時(shí)要經(jīng)過(guò)酒精燈燒灼，并在火焰附件工作；吸取培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液等液體時(shí)，應(yīng)專(zhuān)管專(zhuān)用，防止污染擴(kuò)大或造成培養(yǎng)物的交叉污染；使用培養(yǎng)液前，不易較早開(kāi)啟瓶口；開(kāi)瓶后的培養(yǎng)瓶應(yīng)保持斜位，避免直立；不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封口；培養(yǎng)的細(xì)胞在處理之前不要過(guò)早的暴露空氣中；操作時(shí)不要交談、咳嗽，以防唾沫和呼出氣流引發(fā)污染；操作完畢后應(yīng)將工作臺(tái)面整理好，并消毒擦拭工作面，關(guān)閉超凈臺(tái)。 4.其他預(yù)防：及早凍存培養(yǎng)物；重要的細(xì)胞株傳代工作應(yīng)有兩個(gè)人獨(dú)立進(jìn)行；購(gòu)入的未滅活血清應(yīng)采取56度水浴滅活30分鐘使血清的補(bǔ)體和支原體滅活；為了避免誘導(dǎo)抗藥細(xì)菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系

11、統(tǒng)的抗生素，或盡可能不用抗生素；對(duì)新購(gòu)入的細(xì)胞株應(yīng)加強(qiáng)觀察，防止外來(lái)的污染源；定期消毒培養(yǎng)箱。 四、污染的排除:培養(yǎng)的細(xì)胞一旦污染應(yīng)及時(shí)處理，防止污染其他細(xì)胞。通常選高壓滅菌被污染的細(xì)胞，然后棄掉。如果有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過(guò)及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常。常用的排除微生物污染的方法有以下幾種： 1 抗生素排除法：抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅細(xì)菌的主要手段。各種抗生素性質(zhì)不同，對(duì)微生物作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后應(yīng)用好；如果發(fā)生微生物污染后再使用抗生素，常難以根除。有的抗生素對(duì)細(xì)菌僅有抑制作用，無(wú)殺滅效應(yīng)。反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)細(xì)

12、胞本身也有一定影響，因此有人主張盡量不用抗生素處理，當(dāng)然，一些有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用510倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用2448小時(shí)，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時(shí)可以奏效。 2 加溫除菌：根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞置于41度中作用510小時(shí)（最長(zhǎng)可以達(dá)18小時(shí)）殺滅支原體。但是41度對(duì)細(xì)胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定最大限度殺傷支原體而對(duì)細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。 3 動(dòng)物體內(nèi)接種：受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可以接種到同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)生長(zhǎng)，待一定時(shí)間，