實驗01植物細胞滲透勢的測定

1、實驗01 植物細胞滲透勢的測定植物細胞的滲透勢主要取決于細胞液的溶質(zhì)濃度，因此又稱溶質(zhì)勢。已知在干旱、鹽漬等條件下，一些植物常在細胞內(nèi)主動積累溶質(zhì)，以降低其滲透勢，增加吸水能力，而在一定程度上維持膨壓，保障細胞的生長和氣孔的開放，這種現(xiàn)象叫做滲透調(diào)節(jié)作用。滲透調(diào)節(jié)能力的大小可以用逆境條件下細胞滲透勢的降低值來表示，在水分生理與抗性生理研究中經(jīng)常需要測定。以下介紹兩種測定方法。一、質(zhì)壁分離法測定植物細胞的滲透勢【原理】將植物組織放入一系列不同濃度的蔗糖溶液中，經(jīng)過一段時間，植物細胞與蔗糖溶液間將達到滲透平衡狀態(tài)。如果在某一溶液中細胞脫水達到平衡時剛好處于臨界質(zhì)壁分離狀態(tài)，則細胞的壓力勢p下降為零

2、。此時細胞液的滲透勢s等于外液的滲透勢s0，即s=s0，此溶液稱為該組織的等滲溶液，其濃度稱為該組織的等滲濃度，因此，只要測出植物組織的等滲濃度，即可計算出細胞液的滲透勢s。實際測定時，由于臨界質(zhì)壁分離狀態(tài)難以在顯微鏡下直接觀察到，故一般均以初始質(zhì)壁分離作為判斷等滲濃度的標準。處于初始質(zhì)壁分離狀態(tài)的細胞體積，比吸水飽和時略小，故細胞液濃縮而滲透勢略低于吸水飽和時的滲透勢，此種狀態(tài)下的滲透勢稱基態(tài)滲透勢?！緝x器與用具】顯微鏡1臺；載玻片與蓋玻片各若干；溫度計1支；尖頭鑷子1把；刀片1片；小培養(yǎng)皿（直徑6cm）9套；試劑瓶若干；燒杯、容量瓶、量筒、吸管等；吸水紙適量。【試劑】1mol/kg H2O

3、蔗糖溶液 稱取預(yù)先在6080下烘干的蔗糖34.2g溶于100g蒸餾水中，即為1質(zhì)量摩爾濃度蔗糖溶液。蔗糖系列標準液 取干燥潔凈的小試劑瓶9支編號，用1mol/kg H2O蔗糖溶液依C1V1=C2V2公式配制0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70mol/kg H2O等一系列不同濃度的蔗糖溶液（具體范圍可根據(jù)材料不同而加以調(diào)整），貯于試劑瓶中，瓶口加塞以防蒸發(fā)濃縮。0.03%中性紅溶液。【方法】1選大蔥或洋蔥鱗莖內(nèi)表皮、小麥葉片等作實驗材料。2取干燥潔凈的培養(yǎng)皿9套編號，將配制好的不同濃度蔗糖溶液按順序加入各培養(yǎng)皿中使成一薄層，蓋好培養(yǎng)皿蓋備用。3

4、用鑷子剝?nèi)」┰嚥牧舷卤砥せ蛴玫镀⌒墓稳⌒←溔~片上表皮（參考實驗1），大小以0.5cm2為宜。吸去切片表面水分，立即浸入不同濃度的蔗糖溶液中，每一濃度45片。為便于觀察，可先將切片于0.03%中性紅內(nèi)染色5min左右，吸去水分，再浸入蔗糖溶液中，但如不加染色即能區(qū)別質(zhì)壁分離時，仍以不染色為宜。4切片在蔗糖溶液中浸泡2030min，同時記錄室溫，取出放在載玻片上，滴一滴相同濃度的糖液，蓋好蓋玻片，顯微鏡下觀察確定引起50%以上細胞發(fā)生初始質(zhì)壁分離（即原生質(zhì)體剛從細胞壁的角隅分離）的濃度，每片觀察的細胞不應(yīng)少于100個，觀察要迅速。如果在兩個相鄰濃度的切片中，一個沒有發(fā)生質(zhì)壁分離或質(zhì)壁分離的細胞不

5、足50%，另一個發(fā)生質(zhì)壁分離的細胞數(shù)超過50%，則可粗略地將這兩個濃度的平均值作為其等滲濃度，也可用插值法更準確地確定等滲濃度。檢查時可先從中間濃度開始。5由所得到的等滲濃度和測定的室溫，可用下式計算細胞液的滲透勢（s）：s =iCRT式中各參數(shù)的意義見實驗5（植物組織水勢的測定）。6也可用CaCl2或NaCl代替蔗糖，但須改變式中等滲系數(shù)。CaCl2的i值可用2.6，NaCl一般為1.8（見附錄四）。7試比較不同植物材料的滲透勢，把結(jié)果列于表6-1：表6-1 測定植物組織滲透勢記載表蔗糖克分子濃度（M）滲透勢（巴）質(zhì)壁分離的相對程度（作圖表示）0.700.650.600.550.50.450

6、.400.350.30【思考題】1配制蔗糖溶液時為何用質(zhì)量摩爾濃度（mol/kg H2O）而不用容積摩爾濃度mol/L？2某植物葉片吸水飽和時的滲透勢經(jīng)測定為-0.8MPa，又用質(zhì)壁分離法測出其滲透勢為-0.9MPa，請計算質(zhì)壁分離狀態(tài)的細胞液體積相當于飽和時的百分數(shù)。實驗02 植物的無土培養(yǎng)和缺素癥狀植物正常生長發(fā)育需要多種礦質(zhì)元素。但要確定各種元素是否為植物所必需，必需借助無土培養(yǎng)法（溶液培養(yǎng)和砂基培養(yǎng)法）才能解決。近年來，無土栽培不僅作為一種研究手段，而且成為新的生產(chǎn)方式，在蔬菜、花卉生產(chǎn)中開始大規(guī)模應(yīng)用。本實驗學(xué)習(xí)溶液培養(yǎng)的技術(shù)，并證明氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵諸元素對植物生長發(fā)育的重要性

7、?！驹怼坑弥参锉匦璧牡V質(zhì)元素按一定比例配成培養(yǎng)液來培養(yǎng)植物，可使植物正常生長發(fā)育，如缺少某一必需元素，則會表現(xiàn)出缺素癥；將所缺元素加入培養(yǎng)液中，缺素癥狀又可逐漸消失?！緝x器與用具】25ml和500ml燒杯各1個；吸量管1ml 1支，5ml 10支；1000ml 量筒1個；培養(yǎng)瓶（可用1000ml塑料廣口瓶或瓷質(zhì)、玻璃質(zhì)培養(yǎng)缸）個；黑色蠟光紙適量；塑料紗網(wǎng)紗布（15cm15cm）1塊；精密p試紙（p56）或廣泛p指示劑；搪瓷盤（帶蓋）個；石英砂適量；陶質(zhì)花盆個；500ml試劑瓶11個。【試劑】表11-1 大量元素貯備液配制表營養(yǎng)鹽濃度（g/L）Ca(NO3)24H2O236.0KNO3102.

8、0MgSO47H2O98.0KH2PO427.0K2SO488.0CaCl2111.0NaH2PO424.0NaNO3170.0Na2SO421.0EDTA-FeEDTA-Na7.45FeSO47H2O5.57硝酸鉀；硫酸鎂；磷酸二氫鉀；硫酸鉀；硫酸鈉；磷酸二氫鈉；硝酸鈉；硝酸鈣；氯化鈣；硫酸亞鐵；硼酸；氯化錳；硫酸銅；硫酸鋅；鉬酸；鹽酸；乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na）。以上試劑均需分析純。【方法】1.精選高活力玉米（或番茄、向日葵）種子為試驗材料。2.培苗：用搪瓷盤裝入一定量的石英砂或潔凈的河沙，將已浸種一夜的玉米（或番茄）等種子均勻地排列在砂面上，再覆蓋一層石英砂，保持濕潤，然后放置在溫

9、暖處發(fā)芽。第一片真葉完全展開后，選擇生長一致的幼苗，小心地移植到各種缺素培養(yǎng)液中。移植時注意勿損傷根系。3.配制大量元素及鐵貯備液：用蒸餾水按表11-1配制。微量元素貯備液按以下配方配制：稱取H3BO4 2.86g，MnCl24H2O 1.81g，CuSO45H2O 0.08g，ZnSO47H2O 0.22g，H2MoO4H2O 0.09g，溶于1L蒸餾水中。表11-2 完全培養(yǎng)液和各種缺素培養(yǎng)液配制表貯備液每100ml培養(yǎng)液中各種貯備液的用量(ml)完全缺N缺P缺K缺Ca缺Mg缺FeCa(NO3)20.5-0.50.5-0.50.5KNO30.5-0.5-0.50.50.5MgSO40.50

10、.50.50.50.5-0.5KH2PO40.50.5-0.50.50.5K2SO4-0.50.1-CaCl2-0.5-NaH2PO4-0.5-NaNO3-0.50.5-Na2SO4-0.5-EDTA-Fe0.50.50.50.50.50.5-微量元素0.10.10.10.10.10.10.1配好以上貯備液后，再按表11-2配成完全培養(yǎng)液或缺乏某元素的培養(yǎng)液（用蒸餾水）。（調(diào)節(jié)pH至5.55.8）。4.取7個1000毫升塑料廣口瓶，分別裝入配制的完全培養(yǎng)液及各種缺素培養(yǎng)液900ml，貼上標簽，寫明日期。然后把各瓶用黑色蠟光紙或黑紙包起來（黑面向里），或用報紙包三層，用0.3mm的橡膠墊做成瓶蓋

11、，并用打孔器在瓶蓋中間打一圓孔，把選好的植株去掉胚乳，并用棉花纏裹住莖基部，小心地通過圓孔固定在瓶蓋上，使整個根系浸入培養(yǎng)液中，裝好后將培養(yǎng)瓶放在陽光充足、溫度適宜（2025）的地方，培養(yǎng)34周。5.實驗開始后每兩天觀察一次，并用精密pH試紙檢查培養(yǎng)液的pH值，如高于6，應(yīng)用稀鹽酸調(diào)整到56之間。為了使根系氧氣充足，每天定時向培養(yǎng)液中充氣，或在蓋與溶液間保留一定空隙，以利通氣。培養(yǎng)液每隔一周需更換一次。注意記錄缺乏必需元素時所表現(xiàn)的癥狀和最先出現(xiàn)癥狀的部位。待各缺素培養(yǎng)液中的幼苗表現(xiàn)出明顯癥狀后，可把缺素培養(yǎng)液一律更換為完全培養(yǎng)液，觀察癥狀逐漸消失的情況，并記錄結(jié)果?！舅伎碱}】1.為什么說無土

12、培養(yǎng)是研究礦質(zhì)營養(yǎng)的重要方法?2.比較溶液培養(yǎng)和砂基培養(yǎng)的優(yōu)缺點。3.進行溶液培養(yǎng)或砂基培養(yǎng)有時會失敗，主要原因何在?實驗03-04 植物激素對愈傷組織形成和分化的影響在植物組織培養(yǎng)中，原已分化的外植體（根、莖、葉、花、果實、種子、花粉等）細胞，又能重新進行分裂生長，形成沒有組織結(jié)構(gòu)的細胞團，即愈傷組織，這個過程稱為脫分化。愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)后又可分化形成根和芽，稱為再分化。植物激素在“再分化”中起重要作用。【原理】 愈傷組織分化根和芽受培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的相對濃度的影響，生長素/細胞分裂素比值高時，促進根的分化；比值低時，則促進芽的分化；兩種激素比值適中時，則愈傷組織生長占優(yōu)勢或不

13、分化。這樣，通過改變兩種激素的相對濃度即可有效地調(diào)節(jié)愈傷組織再分化的進程?！緝x器與用具】超凈工作臺；高壓滅菌鍋1個；手術(shù)刀一把；長柄鑷子1把；三角瓶4 支； 容量瓶：25ml、50ml、500ml、1000ml各1支；吸量管：1ml、2ml、5ml、10ml各1支；培養(yǎng)皿1個；下口杯1個；燒杯1000ml 1個；酒精燈1個；牛皮紙；白線繩；培養(yǎng)室。【試劑】75乙醇；1次氯酸納；1mol/L HCI；瓊脂；6-芐基腺嘌呤；萘乙酸；MS培養(yǎng)基中各種化合物（配方見附錄七）?！痉椒ā?.配制培養(yǎng)基按MS培養(yǎng)基配方（見附錄七），先配制各母液。(1)按表36-1，配置10倍的大量元素母液：表36-1 10

14、倍的大量元素母液配置表無機鹽NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO4重量(g)16.5194.43.71.7用蒸餾水溶解并定容至1000ml。(2)按表36-2配置100倍的微量元素母液：用蒸餾水溶解并定容至1000ml。(3)200倍的鐵鹽母液：稱EDTA-Na2 3.37g，F(xiàn)eSO47H2O 2.78g，用蒸餾水溶解并定容至500ml。(4)有機成分：20mg/ml的肌醇溶液 稱取2g肌醇，用蒸餾水溶解后定容至100ml。0.5mg/ml的煙酸溶液 稱取12.5mg的煙酸，用蒸餾水溶解后定容至25ml。1mg/ml的甘氨酸溶液 稱取25mg甘氨酸，用蒸餾水溶解

15、后定容至25ml。表35-2 100倍的微量元素母液配置表無機鹽重量（mg）KI83H3BO4620MnSO44H2O2230ZnSO47H2O860Na2MoO42H2O25CuSO45H2O2.5CoCl26H2O2.50.5mg/ml的鹽酸吡哆醇（維生素B6） 稱取12.5mg鹽酸吡哆醇，用蒸餾水溶解后定容至25ml。0.1mg/ml的鹽酸硫胺素（維生素B1） 稱取10mg鹽酸硫胺素，用蒸餾水溶解后定容至100ml。(5)植物激素：0.1mg/ml的萘乙酸溶液 稱取10mg NAA，用少量95乙醇溶解后，用蒸餾水定容至100ml。1mg/ml 6-芐基腺嘌呤 稱取50mg6-BA，用少量

16、1mol/L的HCl溶解后，用蒸餾水定容至50ml。將各種元素的母液混合，配制成MS培養(yǎng)基，其中1升體積中所含各種元素的母液含量如表36-3：表36-3 1L MS培養(yǎng)基中各種元素的母液含量大量元素母液100ml微量元素母液10ml鐵鹽母液5m l肌醇母液5ml甘氨酸母液2ml煙酸母液1ml鹽酸吡哆醇母液1ml蔗糖30g鹽酸硫胺素母液1ml瓊脂9g再按表36-4分別加入NAA和6-BA母液：表36-4 培養(yǎng)基14加入NAA、6-BA配置表培養(yǎng)基1234NAA母液0.1ml0.2ml0.1ml06-BA母液3ml3ml03ml先在三角燒杯（或不銹鋼鍋）加入600ml蒸餾水，加入所需的瓊脂和糖，在

17、水浴鍋里將瓊脂溶化，如果直接加熱應(yīng)不停地攪拌，防止在瓶底（或鍋底）燒焦或沸騰溢出。再將溶解的瓊脂糖溶液倒入盛有上述各種物質(zhì)母液的下口杯中，混勻，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)pH至5.8，用蒸餾水定容至1升。將培養(yǎng)基分注到三角瓶或試管中，按容器的大小和培養(yǎng)要求放入適當量的培養(yǎng)基。分裝時注意不要把培養(yǎng)基沾附到瓶口或管口附近的內(nèi)壁上，以免培養(yǎng)過程中發(fā)生污染。分裝中還要不時攪動下口杯中的培養(yǎng)基，否則先后分裝的各瓶培養(yǎng)基凝固能力不同。蓋上棉塞，用牛皮紙包扎好后，放入高壓滅菌鍋，1.2大氣壓下滅菌15min，冷卻后備用。2.材料的滅菌與接種取開花前23天已露白的菊花花蕾，先用自來水沖洗

18、花蕾，然后在75乙醇中浸泡15秒鐘，后用無菌水沖洗2次，再用1次氯酸納溶液浸泡15min，并不時輕輕攪動。用無菌水清洗三次，再轉(zhuǎn)入放有濾紙而又無菌的培養(yǎng)皿中，用剪刀剪取舌狀花，用解剖刀切取舌狀花的5毫米見方大小的小塊，一個100ml的三角瓶中68個小塊。接種后放到培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)室內(nèi)的溫度為252，日光燈每天照明12h，光照強度約2000lx。3.結(jié)果觀察和記錄接種后注意觀察記錄外植體上愈傷組織和根芽出現(xiàn)的時間和數(shù)量，加以分析比較。【注意事項】1.在配制植物激素時，溶解試劑的乙醇和鹽酸用量要少，用蒸餾水稀釋時，慢慢沿?zé)瓋?nèi)壁加入。2.對培養(yǎng)基和材料及器皿的滅菌要嚴格。3.分裝培養(yǎng)基時，不能把

19、培養(yǎng)基沾附到瓶口上，以免引起污染。4.在溫室內(nèi)培養(yǎng)過程中，經(jīng)常檢查，及時剔除污染的材料或三角瓶?！舅伎碱}】1.植物激素與愈傷組織形成和器官分化有何關(guān)系？2.在組織培養(yǎng)過程中應(yīng)注意些什么？實驗05 葉綠體色素的提取分離和理化性質(zhì)一、葉綠體色素的提取與分離【原理】 葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素和葉黃素）兩大類。它們與類囊體膜上的蛋白質(zhì)相結(jié)合，而成為色素蛋白復(fù)合體，這兩類色素都不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇或丙酮等有機溶劑提取。提取液可用色層分析的原理加以分離。因吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，當用適當?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各成分在兩相（流動相和固定相）間具

20、有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動速度不同，經(jīng)過一定時間層析后，便將混合色素分離?！緝x器與用具】研缽2套；漏斗；100ml三角瓶；玻璃棒；剪刀；滴管；培養(yǎng)皿（直徑11cm）；康維皿或平底短玻管（也可用塑料藥瓶蓋代替）；藥勺；圓形濾紙（直徑11cm）；濾紙條（5cm1.5cm）?！驹噭?5%乙醇；石英砂；碳酸鈣粉；推動劑：按石油醚丙酮苯（1021）比例配制（體積比）?！痉椒ā?葉綠體色素的提?。?）取菠菜或其他植物新鮮葉片45片（2g左右），洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放入研缽中。（2）研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，加23ml 95%乙醇，研磨至糊狀，再加1015ml 95%乙醇，提取35min

21、，上清液過濾于三角瓶中，殘渣用10ml 95%乙醇沖洗，一同過濾于三角瓶中。如無新鮮葉片，也可用事先制好的葉干粉提取。取新鮮葉片（以菠菜葉最好），先用105殺青，再在80下烘干，研成粉末，密閉貯存。用時稱葉粉1g放入小燒杯中，加95%乙醇2030ml浸提，并隨時攪動。待乙醇呈深綠色時，濾出浸提液備用。（3）另取一研缽，放入剪碎的新鮮葉片，放入少量石英砂（不加碳酸鈣粉），用水研磨。先加2ml蒸餾水，研至糊狀，再加蒸餾水30ml，攪均，不過濾。2葉綠體色素的分離（1）取圓形定性濾紙一張（直徑11cm），在其中心戳一圓形小孔（直徑約3mm）。另取一張濾紙條（5cm1.5cm），用滴管吸取乙醇葉綠體色

22、素提取液沿紙條的長度方向涂在紙條的一邊，使色素擴散的寬度限制在0.5cm以內(nèi)，風(fēng)干后，再重復(fù)操作數(shù)次，然后沿長度方向卷成紙捻，使浸過葉綠體色素溶液的一側(cè)恰在紙捻的一端。（2）將紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿凸出）。（3）在培養(yǎng)皿內(nèi)放一康維皿，在康維皿中央小室中加入適量的推動劑，把帶有紙捻的圓形濾紙平放在康維皿上，使紙捻下端浸入推動劑中。迅速蓋好培養(yǎng)皿（圖16-1）。此時，推動劑借毛細管引力順紙捻擴散至圓形濾紙上，并把葉綠體色素向四周推動，不久即可看到各種色素的同心圓環(huán)。如無康維皿，也可在培養(yǎng)皿中放入一平底短玻管或塑料藥瓶蓋，以盛裝推動劑。但所用培養(yǎng)皿底、蓋直徑應(yīng)相

23、同，且略小于濾紙直徑，以便將濾紙架在培養(yǎng)皿邊緣上。（4）當推動劑前沿接近濾紙邊緣時，取出濾紙，風(fēng)干，即可看到分離的各種色素：葉綠素a為藍綠色，葉綠素b為黃綠色，葉黃素為鮮黃色，胡蘿卜素為橙黃色。用鉛筆標出各種色素的位置和名稱。二、葉綠體色素的理化性質(zhì)【原理】葉綠素是一種二羧酸葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開；葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計精確測定；葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當它變回到基態(tài)時可發(fā)射出紅

24、光量子，因而產(chǎn)生熒光。葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強光的破壞，特別是當葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅則成為綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標本。皂化反應(yīng)式如下：COOCH3 COOKC32H30ONMg + 2KOH C32H30ON4Mg皂化葉綠素COOC20H39 COOK+ CH3OH + C20H39OH甲醇 葉綠醇【儀器與用具】 20ml刻度試管；10ml小試管；試管架；分光鏡；石棉網(wǎng)；藥匙；燒杯（100ml）；酒精燈；玻棒；鐵三角架；刻度吸量管

25、2ml、5ml各1支；火柴?！驹噭?95%乙醇；苯；醋酸銅粉末；5%的稀鹽酸；醋酸-醋酸銅溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸餾水4倍稀釋而成；KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，過濾后盛于塞有橡皮塞的試劑瓶中?！痉椒ā坑帽緦嶒灥谝豁椫刑崛〉娜~綠體色素乙醇溶液和水研磨勻漿，進行以下實驗。1光對葉綠素的破壞作用（1）取4支小試管，其中兩支各加入5ml用水研磨的葉片勻漿，另外兩支各加入2.5ml葉綠體色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀釋1倍。（2）取1支裝有葉綠素乙醇提取液的試管和1支裝有水研磨葉片均漿的試管，放在直射光下，另外兩支放到暗處，40min后對比觀察

26、顏色有何變化，解釋其原因。2熒光現(xiàn)象的觀察 取1支20ml刻度試管加入5ml濃的葉綠體色素乙醇提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同？解釋原因。3皂化作用（綠色素與黃色素的分離）（1）在做過熒光現(xiàn)象觀察的葉綠體色素乙醇提取液試管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分搖勻。（2）片刻后，加入5ml苯，搖勻，再沿試管壁慢慢加入11.5ml蒸餾水，輕輕混勻（勿激烈搖蕩），于試管架上靜置分層。若溶液不分層，則用滴管吸取蒸餾水，沿管壁滴加，邊滴加邊搖動，直到溶液開始分層時，靜置?？梢钥吹饺芤褐饾u分為兩層，下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b（以及少量的葉黃素）；上層是苯

27、溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。4吸收光譜的觀察 將上述已分層的試管溶液，用分光鏡觀察兩類色素的吸收光譜，首先讓下層綠色素部分對準進光孔，看光譜有何變化；然后再將上層黃色素溶液對準進光孔，看光譜又有何變化。把觀察的結(jié)果用簡單的圖表示出來。5H+和Cu+對葉綠素分子中Mg+的取代作用方法一：（1）取兩支試管，第一支試管加葉綠體色素提取液2ml，作為對照。第二支試管中加葉綠體色素提取液5ml，再加入5%HCl數(shù)滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。（2）當溶液變褐后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記載溶液顏色變化情況，并與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。方法二：另取醋酸醋酸銅溶液20ml，以

28、燒杯盛之。取新鮮植物葉片兩片，放入燒杯中，用酒精燈慢慢加熱，隨時觀察并記錄葉片顏色的變化，直至顏色不再變化為止。解釋原因?！咀⒁馐马棥?在低溫下發(fā)生皂化反應(yīng)的葉綠體色素溶液，易乳化而出現(xiàn)白絮狀物，溶液渾濁，且不分層?？杉ち覔u勻，放在3040的水浴中加熱，溶液很快分層，絮狀物消失，溶液變得清澈透明。2分離色素用的圓形濾紙，在中心打的小圓孔，周圍必須整齊，否則分離的色素不是一個同心圓?！舅伎碱}】1用不含水的有機溶劑如無水乙醇、無水丙酮等提取植物材料特別是干材料的葉綠體色素往往效果不佳，原因何在？2研磨提取葉綠素時加入CaCO3有什么作用？3從葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素的吸收光譜討論其生理

29、意義。實驗06 紅外線CO2氣體分析儀法測定植物光合速率與呼吸速率紅外線CO2氣體分析儀（IRGA）工作原理：許多由異原子組成的氣體分子對紅外線都有特異的吸收帶。CO2的紅外吸收帶有四處，其吸收峰分別在2.69m、2.77m、4.26m和14.99m處，其中只有4.26m的吸收帶不與H2O的吸收帶重疊，紅外儀內(nèi)設(shè)置僅讓4.26m紅外光通過的濾光片，當該波長的紅外光經(jīng)過含有CO2的氣體時，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少與CO2的濃度有關(guān)，并服從朗伯比爾定律。分別供給紅外儀含與不含CO2的氣體，紅外儀的檢測器便可通過檢測紅外光能量的變化而輸出反映CO2濃度的電訊號。.密閉系統(tǒng)斜率法一、原理

30、把IRGA與光合作用同化室連接成密閉的氣路系統(tǒng)。將植物材料密封在透明的同化室內(nèi)，給以適當?shù)墓庹?，同化室?nèi)CO2濃度將因植物光合而下降，用IRGA配以適當?shù)挠涗泝x可繪出同化室內(nèi)CO2濃度隨光合時間下降的曲線。在同化室不漏氣、光強度穩(wěn)定、室內(nèi)空氣不斷得到攪動的情況下，該曲線將是一條平滑曲線，在曲線的任一點作切線，即可根據(jù)切線的斜率，密閉系統(tǒng)的容積和同化室面積求出在該點的CO2濃度下的光合速率。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：植物葉片（二）儀器設(shè)備：1. 密閉氣路光合測定裝置：將QGD07型紅外線CO2氣體分析儀、XWT264型自動記錄儀、MXQ型氣體取樣器（圖4）、光合作用同化室、溫度轉(zhuǎn)換器（

31、測溫探頭可放在同化室內(nèi)，輸出信號接記錄儀）或半導(dǎo)體點溫計、橡皮管（內(nèi)徑67mm）、塑料氣球，按圖6所示連接成套，放在一輛醫(yī)用小推車上。2. 量子輻射照度計；3. 葉面積儀；4. 鐵架臺（帶試管夾）；5. 050溫度計（用以校正葉室溫度）；6. 剪刀；7. 帶蓋搪瓷盤；8. 紗布。（三）試劑：1. 無水氯化鈣（無水硫酸鈣）；2. 燒堿石棉（10目）或堿石灰。三、實驗步驟（一）光合速率的測定1. 安裝儀器（1）將安裝好的密閉氣路光合測定裝置安放在靠待測植株12m處，接通紅外儀、錄儀、取樣器、溫度轉(zhuǎn)換器的供電電源。打開紅外儀電源開關(guān)預(yù)熱12h，紅外儀量程開關(guān)置于I檔（0500ppm，1ppm1mg/

32、L）。把紅外儀和溫度轉(zhuǎn)換器的信號輸出與記錄儀的兩個信號輸入接線柱用導(dǎo)線接通。旋轉(zhuǎn)記錄儀第一支筆量程選擇開關(guān)于10mV位置（與紅外儀輸出信號電壓匹配），旋轉(zhuǎn)記錄儀第二支筆量程選擇開關(guān)于2V位置（與溫度轉(zhuǎn)換器輸出溫度050信號電壓匹配）。2. 調(diào)、校儀器（1）紅外儀預(yù)熱完畢后，開啟記錄儀電源開關(guān)、記錄儀信號輸入開關(guān)和取樣器前面板上的氣泵開關(guān)，將取樣器F1旋鈕置“零氣”位置，F(xiàn)2旋鈕置“測量”位置，開始調(diào)整紅外儀的零點（此時，無CO2無水分的零氣循環(huán)經(jīng)過紅外儀），約12min，調(diào)節(jié)紅外儀的調(diào)零旋鈕使指針穩(wěn)定在“0”點位置，穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)記錄儀第一支筆的“調(diào)零”旋鈕使記錄筆到零點位置，紅外儀調(diào)零完畢。（

33、2）拔下紅外儀進氣口處的橡皮管，改接CO2標準氣（已知準確CO2濃度）鋼瓶，出口放空，讓標準氣流經(jīng)紅外儀分析氣室（流量以1Lmin左右為宜）開始校正，此時紅外儀指針應(yīng)指在標準氣濃度所對應(yīng)的刻度（A值）上，否則可調(diào)節(jié)紅外儀“校正”旋鈕，校正完畢后恢復(fù)原氣路。（3）把玻璃溫度計感溫端與葉室內(nèi)的溫度轉(zhuǎn)換器探頭放在一起（注意遮蔭），從玻璃溫度計上讀出溫度，迅速旋轉(zhuǎn)記錄儀第二支筆的調(diào)零旋鈕，使記錄筆置該溫度所對應(yīng)的位置，校正溫度。3. 測定（1）旋轉(zhuǎn)取樣器面板上F1旋鈕至“測量”位置，把植物葉片平展放入同化室后關(guān)閉同化室（注意勿讓操作者的呼吸氣進入葉室），開啟葉室風(fēng)扇。觀察記錄筆開始左移時，迅速旋轉(zhuǎn)記錄

34、儀“走紙變速”開關(guān)至合適檔（以所劃曲線45角為宜），開始記錄CO2濃度變化（此時記錄筆應(yīng)從350ppm左右開始記錄）和溫度變化，用鉛筆在記錄紙上記下所測葉片的編號、走紙速度，用量子輻射照度計測量所測葉片的受光強度（光子通量密度）并記錄，待記錄筆左移至310ppm左右時，關(guān)閉走紙開關(guān)，停止記錄，第一次測定完畢。（2）旋轉(zhuǎn)取樣器面板上的F2旋鈕至“補充”位置后，迅速復(fù)原，讓氣球內(nèi)的高濃度CO2氣進入同化室以補充CO2濃度至350ppm左右，觀察記錄筆左移后迅速開啟走紙開關(guān)，進行第二次重復(fù)測定，測量光照強度并記錄，當記錄筆左移至310ppm左右時，關(guān)閉走紙開關(guān)，第二次重復(fù)測定完畢。如此再進行第三次重

35、復(fù)測定。（3）三次重復(fù)測定完畢后，關(guān)閉同化室內(nèi)風(fēng)扇，用記號筆在葉片的葉室內(nèi)外相交處作標記，打開葉室，剪下葉片的測定部分，用紙牌編號后包在濕紗布內(nèi)并放置于帶蓋搪瓷盤內(nèi)，待測葉面積。然后再測定第二張葉片的光合速率。（4）測定結(jié)束后，用葉面積儀測定各葉片面積（如有便攜式葉面積儀，可在測定光合后，立即測出葉面積）。 4. 計算II.密閉系統(tǒng)落差法原理在密閉的系統(tǒng)中，由于同化室中的葉片進行光合后，系統(tǒng)中的CO2濃度不斷下降，可用單位時間內(nèi)同化室中CO2濃度的減少量或CO2濃度減少量所需的時間，根據(jù)葉片面積、同化室體積，計算光合速率。二、材料、儀器設(shè)備及試劑材料：待測植物葉片。（二）儀器設(shè)備：1.GXH3

36、05型紅外線CO2氣體分析儀（或QGD07型紅外儀，使用該紅外儀需要配用MXQ氣體取樣器和數(shù)字萬用電表）；2.電子秒表；3.同化室（根據(jù)需要自制，內(nèi)裝兩個小風(fēng)扇和一個測定溫度的傳感器）；4.量子輻射照度計。（三）試劑：燒堿石棉或堿石灰。三、實驗步驟1. 按要求將氣路系統(tǒng)的各部分連接起來，若使用QGD07型紅外儀，把數(shù)字萬用電表上選擇開關(guān)旋至200mV電壓檔上，與紅外儀0200mV輸出相連接。2. 接通電源，打開紅外儀電源預(yù)熱12h，打開氣泵電源，旋轉(zhuǎn)零氣調(diào)節(jié)開關(guān)至“零點”上，此時紅外儀通入無CO2氣體，調(diào)節(jié)紅外儀“調(diào)零”旋鈕，顯示在“零點”位置，并觀察零點的穩(wěn)定性。3. 將待測葉片放入同化室，

37、密閉后開啟同化室內(nèi)的風(fēng)扇，當CO2濃度穩(wěn)定下降時，開始測定，讀取開始的CO2濃度值C1，開始計時，CO2下降至C2（約下降2030ppm），終止計時，記錄C1、C2、t（或確定從測定開始到結(jié)束所需時間），并同時用照度計測定光照強度，測定葉室內(nèi)的溫度。一次測定完成之后，向同化室內(nèi)補充CO2，進行重復(fù)測定（使用MXQ取樣器，補充CO2操作見密閉氣路斜率法）。測定結(jié)束，用葉面積儀測量葉片的面積。4. 計算光合速率PnCV273P/tS22.4(273t)0.1013上式中，Pn光合速率（單位mol/m2/s）；CCO2濃度落差C1C2（ppm）；t測定時間（S）；S葉片面積（單位m2）；V同化室（包

38、括氣路系統(tǒng)）體積（單位L）；t同化室的溫度；P大氣壓（單位Mpa）。密閉氣路落差法測定裝置除了進行光合速率測定外，也能夠進行呼吸速率、CO2光合速率曲線的測定。測定步驟同光合速率測定方法。更換群體同化箱，可以進行群體光合速率的測定，測定步驟略。實驗07 赤霉素對-淀粉酶的誘導(dǎo)形成原理 淀粉性種子在萌動過程中，胚釋放出來的赤霉素能誘導(dǎo)糊粉層細胞中-淀粉酶基因的表達，引起-淀粉酶生物合成，并分泌到胚乳中催化淀粉水解為糖。通過碘試法比色測定淀粉在酶催化反應(yīng)過程中的消耗量，可以定量分析-淀粉酶的活力。 二、材料、儀器設(shè)備及試劑 （一）材料：大麥、小麥種子 （二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計；2. 恒溫箱

39、；3. 水浴鍋；4. 移液管；5. 燒杯；6. 試管；7. 青霉素小瓶；8. 鑷子；9. 刀片。 （三）試劑：1. 1%次氯酸鈉溶液；2. 0.1%淀粉溶液；3. 2105mol/L、2106mol/L、2107mol/L、2108mol/L 赤霉素溶液；4. 103mol/L 醋酸緩沖液；5. I2-KI溶液。三、實驗步驟1. 選取大小一致、健康的大麥種子50粒，用刀片將每粒種子橫切成兩半，使成無胚的半粒和有胚的半粒，分別置于新配制的1次氯酸鈉溶液中，消毒15min，取出用無菌水沖洗數(shù)次，備用。 2. 取小瓶6只編好號碼，按表（詳教材）加入各種溶液和材料，于25下培養(yǎng)24小時（最好進行振蕩培

40、養(yǎng)，如無條件，則必須經(jīng)常搖動小瓶）。3. 淀粉酶活性分析：從每個小瓶中吸取培養(yǎng)液0.1mL，分別置于事先盛有1.9mL淀粉磷酸鹽的溶液中，搖勻，在30溫箱或水浴中精確保溫10min，然后加I2-KI溶液2mL，蒸餾水5mL，充分搖勻，于波長580nm下測定吸光度，以蒸餾水為空白校正儀器零點。讀數(shù)，從標準曲線查得淀粉含量，以被分解的淀粉量作為淀粉酶的活性。4. 以不同淀粉濃度（07g/L）或淀粉量（0100g）及其吸光度繪制標準曲線。四、結(jié)果計算1. 第1瓶為淀粉的原始量（X）。 2. 第26瓶分別為反應(yīng)后淀粉的剩余量（Y）。3. 淀粉水解量=（XY）/X100%。實驗08 根系活力的測定（TT

41、C法）植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水本。本實驗練習(xí)測定根系活力的方法，為植物營養(yǎng)研究提供依據(jù)。一、 原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是標準氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比較穩(wěn)定，不會被空氣中的氧自動氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到增強，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標。二、材料、設(shè)備儀器及試劑（一）材料：水培或砂培小麥、玉米

42、等植物根系。（二）儀器設(shè)備：1. 分光光度計；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 電子頂載天平（感量0.1g）；4. 溫箱；5. 研缽；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管10ml；10. 刻度試管10ml；11. 試管架；12. 容量瓶10ml；13. 藥勺；14. 石英砂適量；15. 燒杯10ml、1000ml。（三）試劑：1. 乙酸乙酯（分析純）。2. 次硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末。3.1TTC溶液準確稱取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用時稀釋至各需要的濃度。4. 磷酸緩沖液（115mol/L，pH7）。5. 1mol/L

43、硫酸用量筒取比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。6. 0.4mol/L琥珀酸稱取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、實驗步驟（1）TTC標準曲線的制作取0.4TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少許Na2S2O4粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25g、50g、100g、150g、200g的標準比色系列，以空白作參比，在485nm波長下測定吸光度，

44、繪制標準曲線。（2）稱取根尖樣品0.5g，放入10ml燒杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，把根充分浸沒在溶液內(nèi)，在37下暗保溫13h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反應(yīng)。（與此同時做一空白實驗，先加硫酸，再加根樣品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯34ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出甲月替。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌二、三次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量為10ml，用分光光度計在波長485nm下比色，以空白試驗作參比測出吸光度，查標準曲線，即可求出四氮唑還原量。四、結(jié)果計算四氮唑還原強度（mg/g(根鮮重)/

45、h）四氮唑還原量（mg）/根重（g）時間(h)實驗09 類似生長素對種子萌發(fā)的影響一、原理 生長素及人工合成的類似物質(zhì)如萘乙酸等對植物生長有很大的調(diào)節(jié)作用，在不同濃度下對植物生長的效應(yīng)也不同。一般來說，低濃度的生長素促進生長，高濃度時則抑制生長。不同的植物器官對生長素的反應(yīng)也不同，通常根比芽、莖對生長素更敏感。本實驗據(jù)此觀察不同濃度的萘乙酸在種子萌發(fā)過程中對植物不同器官生長的影響。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：小麥種子。（二）儀器設(shè)備：溫箱，培養(yǎng)皿，移液管，鑷子，濾紙，尺子。（三）試劑：10mg/L萘乙酸，0.1%升汞。三、實驗步驟1. 取小麥種子，用0.1%升汞消毒15min，再用自來

46、水和蒸餾水各沖洗3次，置于22的溫箱中催芽2d。2. 取9cm的潔凈培養(yǎng)皿7套，編號。在1號培養(yǎng)皿中加入10mg/L 萘乙酸10mL，然后從其中吸取1mL放入2號培養(yǎng)皿中，加9mL蒸餾水混勻后即成為1 mg/L 萘乙酸溶液。如此依次稀釋到6號培養(yǎng)皿（最后從第6號培養(yǎng)皿中取出1mL棄去），則1號至6號培養(yǎng)皿中的萘乙酸濃度依次為10 mg/L、1 mg/L、0.1 mg/L、0.01 mg/L、0.001 mg/L、0.0001 mg/L。第7號培養(yǎng)皿中則加入9mL蒸餾水作為對照。3. 在各培養(yǎng)皿中放入一張與培養(yǎng)皿皿底大小一致的濾紙，選取已萌動的小麥種子10粒，用鑷子將其整齊地排列在培養(yǎng)皿中，使芽

47、尖朝上并使胚的部位朝向同一側(cè)，蓋上皿蓋后，放在22的溫箱中暗培養(yǎng)3d。4. 測量培養(yǎng)皿內(nèi)小麥幼芽及幼根的平均長度以及根的數(shù)目。四、實驗結(jié)果計算與分析 以蒸餾水中的材料為對照，計算不同濃度萘乙酸溶液中小麥幼芽及幼根長度的增加或減少值，并填入表中進行比較分析。實驗10 植物組織中超氧物歧化酶活力的測定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基（）的酶，它催化下列反應(yīng)：2 反應(yīng)產(chǎn)物H2O2可被過氧化氫酶進一步分解或被過氧化物酶利用。因此SOD有保護生物體免受活性氧傷害的能力。已知此酶活力與植物抗逆性及衰老有密切關(guān)系，故成為植物逆境生理學(xué)的重要研究對象。【原理】本實驗依據(jù)

48、超氧物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有可氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生，可將氮藍四唑還原為藍色的甲 。后者在560nm處有最大吸收，而SOD可清除從而抑制了甲 的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一個酶活性單位定義為將NBT的還原抑制到對照一半（50）時所需的酶量，據(jù)此可以計算出酶活性大小。【儀器與用具】高速臺式離心機；分光光度計；微量進樣器；熒光燈（反應(yīng)試管處光照強度為4000lx）；試管數(shù)支；黑色硬紙?zhí)??！驹噭?.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）；提取介質(zhì)50mmo

49、l/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1聚乙烯吡咯烷酮）；130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱取1.9399g Met用磷酸緩沖液定容至100ml；750mol/L氮藍四唑（NBT）溶液：稱取0.06133g NBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存；100mol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml；20mol/L核黃素溶液：取0.00753g核黃素定容至1000ml避光保存?！痉椒ā?酶液提取 取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，加1ml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取1.52

50、ml于10000r/min下離心10min，上清液即為SOD粗提液。2顯色反應(yīng) 取5ml指形管（要求透明度好）7支，3支為樣品測定管，3支為對照管，另外1支作為空白，按表39-1加入各溶液?；靹蚝髮⒖瞻坠苤冒堤?，其它各管于4000lx日光燈下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，反應(yīng)室的溫度高時時間可適當縮短，溫度低時時間可適當延長）。表39-1 各溶液加入量試 劑（酶）用量(ml)終濃度（比色時）0.05mol/L磷酸緩沖液130mmol/L Met溶液750mol/L NBT溶液100mol/L EDTA-Na2液20mol/L核黃素酶 液蒸餾水總體積1.50.30.30.30.30.05

51、0.253.013mmol75mol10mol2.0mol空白和對照管加緩沖液代替酶液3SOD活性測定與計算 至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的作空白，分別測定其它各管560nm波長下的消光度值，已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。按下式計算SOD活性：SOD總活性=SOD比活力=式中 SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以酶單位/mg蛋白表示；A0照光對照管的消光度值；AS樣品管的消光度值；VT樣液總體積（ml）；V1測定時樣品用量（ml）；FW樣重（g）；蛋白質(zhì)濃度單位為每克鮮重含蛋白毫克數(shù)(mg/g)?！舅伎碱}】1在SOD測定中為什么設(shè)照光對照管和暗中空白管？2影響本實驗準