dna甲基化及其檢測65

1、 DNA甲基化及其檢測方法1綱 要表觀遺傳學(xué)DNA甲基化DNA甲基化檢測方法研究進(jìn)展2一、表觀遺傳學(xué)3基因型相同現(xiàn)象1：一個(gè)生物體的不同組織基因表達(dá)模式截然不同表達(dá)模式迥異4現(xiàn)象2：同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但他們往往在長大成人后在性格、健康方面往往存在很大差異。5 現(xiàn)象3： 腫瘤抑制基因被過量地甲基化而導(dǎo)致失去活性，而基因的DNA序列并不發(fā)生變化。 6現(xiàn)象4：橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，其實(shí)味不同。同一種水果，在不同產(chǎn)地生長，其味道，大小，外觀可能相差很遠(yuǎn)。7Basket ball player？Singer？President？TV host？如果他們出生在不同的

2、地方8基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)9相同的基因型 不同的表型 ? 10 什么是表觀遺傳學(xué)？ 表觀遺傳學(xué)： 基因序列無變化 基因功能發(fā)生變化 可遺傳并且是可逆的 表觀遺傳學(xué)機(jī)制： DNA甲基化 組蛋白修飾 RNA調(diào)控（RNA干擾，microRNA, long non-coding RNA等)11表觀遺傳學(xué)/Epigenetics 基因型不變的情況下，影響表型并能遺傳的現(xiàn)象，稱為表觀遺傳或后生遺傳。表觀遺傳學(xué)研究的是在基因組DNA序列不變的情況下，在表型上具有的穩(wěn)定的、可遺傳(或潛在的可遺傳性)的變化。 定義Epigenetics - On or over the genetic information

3、 encoded in the DNA12在細(xì)胞基因組上存在兩類信息： A- 遺傳學(xué)信息 B- 表觀遺傳學(xué)信息前者維持細(xì)胞活性功能工廠的所有物質(zhì)材料后者怎么建、何時(shí)建、在哪建的附加信息基因組不僅僅是序列包含遺傳信息，而且其修飾也可以記載遺傳信息。13DNA sequence codingEpigenetic programming表觀遺傳的特點(diǎn)：廣泛，多樣，復(fù)雜14DNA甲基化 染色質(zhì)重塑 RNA調(diào)控（RNA干擾， 非編碼RNA:microRNA, long non-coding RNA等)表觀遺傳學(xué)目前的主要研究發(fā)現(xiàn)15 二、 DNA甲基化16DNA甲基化組蛋白翻譯后修飾RNA機(jī)制17DNA

4、 甲基化的概念及機(jī)理1950年，Wyatt在Nature上首次指出測序結(jié)果表明DNA可能存在第5堿基。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAH18高等生物基因組甲基化特點(diǎn) 1）廣泛性 2）可遺傳性 3）可逆性 4）組織特異性19CpG島(CpG islands) 在結(jié)構(gòu)基因5端附近的調(diào)控區(qū)段， CG二聯(lián)核苷常常以成簇串聯(lián)的形式排列，含量大于50%。 預(yù)測軟件 廣泛性20可遺傳性21DNA的甲基化如何調(diào)節(jié)基因表達(dá)？A: 未甲基化或低度甲基化的啟動(dòng)子能夠允許轉(zhuǎn)錄正常進(jìn)行。B:

5、甲基化的CpGs阻止轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，因此阻止轉(zhuǎn)錄。C: MBP ( Me-CpG binding protein ) 也阻止轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。其他，如改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，22啟動(dòng)子高甲基化使基因表達(dá)受抑制23DNA 修復(fù)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)癌基因代謝 凋亡分化細(xì)胞周期DNA甲基化DNA甲基化的功能24 三、DNA甲基化檢測手段 25DNA甲基化檢測方法總覽26 主要檢測途徑3-1 基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法3-2 不基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法27 3-1基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法質(zhì)譜分析水解核苷酸質(zhì)譜分析28基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基化分析原理129基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基化分析原理230應(yīng)用一:直接測

6、序法（Direct sequencing)31直接測序法32圖6 PMVK基因擴(kuò)增產(chǎn)物反向測序結(jié)果33圖7 TRIB3基因擴(kuò)增產(chǎn)物正向測序結(jié)果34應(yīng)用二： 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序(Bisulfite-sequence PCR，BSP)35 注： A：癌組織；B：癌旁組織；：未甲基化；：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆測序結(jié)果36BSP克隆測序甲基化率三維圖形37應(yīng)用三：甲基化特異性PCR (methylafion-specific PCR，MS-PCR)38甲基化特異性PCR39 U M U M U M ladder100150200250

7、MSP法檢測抑癌基因RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)的甲基化圖 MSP檢測組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果，U為非甲基化，M為甲基化?；蛟\斷中心鄭芳實(shí)驗(yàn)室40 MSP擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖研究結(jié)果注：M表示 甲基化，U表示未甲基化 B1-B6為高脂血癥組六例標(biāo)本，D1-D5為正常對照組五例標(biāo)本； H2O為陰性對照；m為50bpMarker。SREBP-1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)基因診斷中心鄭芳實(shí)驗(yàn)室41甲基化特異性PCR優(yōu)點(diǎn)：操作簡便；敏感性高。缺點(diǎn)：引物設(shè)計(jì)要求高；只能作定性研究；存在重亞硫酸鹽處理不完全導(dǎo)致的假陽性；只能了解部分位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。42應(yīng)用四：結(jié)合重

8、亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)43結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法44基于限制性內(nèi)切酶的工具酶甲基化特異性的限制性內(nèi)切酶：可以識別甲基化的胞嘧啶甲基化敏感性的限制性內(nèi)切酶：可以識別甲基化的胞嘧啶45基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法基因診斷中心鄭芳實(shí)驗(yàn)室46MSRE-PCR原理圖 1-1 MSRE-PCR原理圖注：左圖DNA無甲基化, DNA被切斷, 無法得到PCR產(chǎn)物; 右圖DNA有甲基化, DNA保持完整,可以獲得PCR產(chǎn)物.基因診斷中心鄭芳實(shí)驗(yàn)室47本課題組應(yīng)用舉例二：采用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶技術(shù)結(jié)合

9、PCR的方法（MSRE-PCR）篩選在肝癌與癌旁組織中有甲基化差異的基因。基因診斷中心鄭芳實(shí)驗(yàn)室48圖1-3：DNM基因瓊脂糖凝膠電泳圖M21AE17B17BE17A17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500bp注：M：Marker；E：加酶體系；A：癌組織；B：癌旁組織；空：水空白基因診斷中心鄭芳實(shí)驗(yàn)室49結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法優(yōu)點(diǎn)：方法相對簡單；可進(jìn)行甲基化水平的定量研究；需要樣本量少。缺點(diǎn)：只能獲得特殊酶切位點(diǎn)甲基化情況。50優(yōu)點(diǎn)： 可同時(shí)檢測基因組內(nèi)多個(gè)CpG位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋，成本低廉。缺點(diǎn)：由于CG僅限于內(nèi)切酶識別序列中，因此非識別序列的

10、CG將被忽略；只有檢測與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí)，該檢測方法的結(jié)果才有意；需要樣本量大；存在酶消化不完全引起的假陽性的問題；不適用于混合樣本。 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法51應(yīng)用五：甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析（methylation specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）52甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析53甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析優(yōu)點(diǎn)：能夠方便的應(yīng)用于任何序列的甲基化狀態(tài)分析；能夠?qū)谆牡任换蜻M(jìn)行半定量； 可以提示甲基化狀態(tài)分布的不均勻性。缺點(diǎn)： 只有甲基化水平較高的單鏈才能明顯的區(qū)分開，而較低水平的則不易分開，

11、有時(shí)會(huì)因甲基化的CpG位點(diǎn)隨機(jī)和不均勻分布導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)擁擠、拖尾的現(xiàn)象，故敏感性及準(zhǔn)確性略低； 檢測片段不宜過長。54應(yīng)用六：基于親和純化的甲基化分析方法55基于親和純化的甲基化分析方法5657應(yīng)用七：ChIP-Seq技術(shù)58 ChIP-Seq59應(yīng)用八：芯片技術(shù)在甲基化檢測中的應(yīng)用60啟動(dòng)子區(qū)甲基化芯片技術(shù)61基因芯片雜交信號圖626364應(yīng)用九：HRM高分辨熔解曲線分析 65HRM技術(shù)： 用于篩選大量樣本，獲得感興趣的CpG位點(diǎn) 鑒定感興趣的CpG 島 。66HRM技術(shù)原理 67HRM技術(shù)原理 68HRM特點(diǎn) 高靈敏性：可檢測低達(dá)0.1%甲基化程度。高通量：1次可同時(shí)檢測不超過384樣

12、本，適用于大樣本多位點(diǎn)甲基化掃描。高重復(fù)性：重復(fù)性100%。使用范圍廣：不受堿基位點(diǎn)局限。 操作簡便：只需設(shè)計(jì)特異引物，無須序列特異性探針，無需測序。 標(biāo)本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測。 69應(yīng)用十：焦磷酸測序法 70是由4種酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 每一輪測序反應(yīng)體系中只加入一種dNTP。如果該dNTP與模板配對，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)。摻入的dNTP和釋放的PPi

13、是等量的ATP硫酸化酶催化PPi與5-磷酰硫酸（APS）結(jié)合形成ATP，然后在熒光素酶的催化作用下，生成的ATP和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。CCD感應(yīng)器檢測到光信號后，Pyrogram轉(zhuǎn)化為檢測峰，每個(gè)峰的高度（光信號）與摻入的核苷酸數(shù)目呈正比Apyrase不斷降解未摻入的核苷酸和ATP，淬滅光信號，再生反應(yīng)體系焦磷酸測序法（Pyrosequencing）71焦磷酸測序 72焦磷酸測序 73焦磷酸測序 74焦磷酸測序的優(yōu)勢：靈敏度高，可測到鄰近CpG區(qū)域的單個(gè)甲基化水平，甚至包括測序的引物區(qū)域。除常規(guī)的檢測位點(diǎn)變化情況外，還可準(zhǔn)確計(jì)算頻率變化。 對于檢測位點(diǎn)要求低，可檢測未知序

14、列信息，覆蓋到人類基因組的所有CpG位點(diǎn)；對于樣品要求低，適用于新鮮、冷凍和FFPE樣本。75焦磷酸測序法的局限性利用該方法測定在人類基因組中大量存在且DNA甲基化高發(fā)的重復(fù)元件Alu和LINE-1(long-interpread nucleotide element)的甲基化率，以它們的甲基化水平代表人類基因組DNA甲基化的總體水平。但是該方法的得到的不是嚴(yán)格意義上的全基因組DNA甲基化率，并不能精確的反映全基因組DNA甲基化水平的實(shí)際情況。 7677總結(jié)：基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法MSP, methylation-specific PCR; Ms-SnuPE, methylation-sen

15、sitive single nucleotide primer extension；Ms-SSCP, methylation-sensitive single-stranded conformational polymorphism; MS-REs, methylation-sensitive restriction endonucleases78sample throughput versus genome coverage. A plot of sample throughput against genome coverage for various DNA methylation tec

16、hniques. Throughput is determined by the number of samples that can be analysed per experiment, based on large eukaryotic genomes. Coverage is determined by the number of CpGs in the genome that can be analysed per experiment. Daniel Zilberman et al. Development 134, 3959-3965 (2007)不同甲基化檢測方法的檢測通量79

17、 3-2 整體甲基化水平的檢測方法80 全基因組整體甲基化水平的分析81應(yīng)用一：高效液相色譜法（HPLC)高效毛細(xì)管電泳（HPCE）82高效液相色譜法（HPLC)高效毛細(xì)管電泳（HPCE）先將DNA樣品經(jīng)過鹽酸或氫氟酸裂解為單個(gè)堿基（A, T, 5C, G, 5mC), 水解產(chǎn)物通過色譜柱或毛細(xì)管，將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，紫外光測定吸收峰值，計(jì)算5mC/(5mC+5C)的積分面積得出基因組整體的甲基化水平。相比HPLC, HPCE方法更加簡便，快速，經(jīng)濟(jì)。兩種方法測定基因組DNA甲基化水平的敏感性均較高。83高效毛細(xì)管電泳（HPCE法）Resolution of nucleosides obtai

18、ned from enzymatic hydrolysis of genomic DNA from human cancer cell line HT29 by HPCE.mC, 5-methylcytidine; A, adenosine;C, cytidine;G, guanosine; T, thymidine.總體甲基化=100%5mC/(5mC+5C）84生物質(zhì)譜技術(shù)檢測DNA總體甲基化水平85應(yīng)用二：生物質(zhì)譜技術(shù)86質(zhì)譜分析法是通過對被測樣品離子的質(zhì)荷比的測定來進(jìn)行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運(yùn)動(dòng)行為的不同，把離子按質(zhì)荷比（m/z）分開而得到質(zhì)量圖譜，通過樣品的質(zhì)量圖譜和相關(guān)信息，可以得