生物化學(xué)與分子生物學(xué)：Folin-酚試劑法（Lowry法）測定蛋白質(zhì)濃度

1、1Folin-酚試劑法（Lowry法）測定蛋白質(zhì)濃度2成績生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)要求平時成績（30%）期末成績（70% ）實(shí)驗(yàn)報(bào)告、考勤（10%）實(shí)驗(yàn)考試（10%）， 1h實(shí)驗(yàn)測試科研設(shè)計(jì)標(biāo)書（10%）3常用儀器設(shè)備的使用刻度吸管（擦、慢、吹） 選擇 拿取2. 試管3. 分光光度計(jì)4分光光度法（specrophotometry）I0入射光I出射光透光度（T）：I/I0定義：分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。5分光光度法（specrophotometry）Lambert定律 lg I0/I=K1L K1是常數(shù)，L為溶液的厚度(光徑)。2.

2、 Beer定律 lg I0/I=K2C K2是常數(shù)，C為溶液的濃度。 3. Lambert-Beer定律 A=KCL A為吸光度(光密度、消光度)，K為常數(shù)(消光系數(shù)) 。6分光光度法（specrophotometry）的應(yīng)用A標(biāo)=KC標(biāo)L， A測=KC測L7一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理及操作步驟。2. 掌握分光光度計(jì)的操作。8臨床意義血清總蛋白增高血液濃縮：腹瀉合成增加：多發(fā)性骨髓瘤2.血清總蛋白降低血液稀釋攝入量不足：營養(yǎng)不良合成障礙：肝臟疾病蛋白質(zhì)丟失：腎病綜合癥9二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)濃度測定微量凱氏定氮法雙縮脲法Folin-酚試劑法考馬斯亮藍(lán)染色法 紫外吸收

3、法10 蛋白質(zhì) 堿性銅試劑 銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)） 試劑甲 -CO-NH- 紫紅色 銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物 磷鉬酸-磷鎢酸 磷鉬藍(lán) + 磷鎢藍(lán) 試劑乙 深藍(lán)色 (Folin試劑)二、實(shí)驗(yàn)原理11優(yōu)點(diǎn)：此方法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為每25250g/ml蛋白質(zhì)，是測定蛋白質(zhì)含量的常用方法。缺點(diǎn)：Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同。實(shí)驗(yàn)優(yōu)缺點(diǎn)12三、實(shí)驗(yàn)步驟待測樣品稀釋： 0.1ml 血清，置于50ml 容量瓶，加生理鹽水至離刻度1-2cm處

4、，以膠頭滴管補(bǔ)充至刻度， 倒置搖勻。此為血清待測液樣品。13管號空白標(biāo)準(zhǔn)待測蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（100ug/ml）-1.0_待測樣品/ml -1.0生理鹽水/ml1.0-堿性銅/ml5.05.05.0混合均勻，室溫10min酚試劑/ml0.50.50.5 各管充分混合均勻，置于室溫放置30min, 以空白管調(diào)零，波長650nm 比色，分別讀取各管吸光度值。取三次測定的平均值，根據(jù)公式（P156）計(jì)算出待測蛋白濃度。2. 取玻璃管3支，按下表操作：143. 722型分光光度計(jì)的使用1. 開機(jī)預(yù)熱10分鐘2. 調(diào)波長3. 空白、標(biāo)準(zhǔn)與待測液體加入比色杯4. 開蓋調(diào)“0”，關(guān)蓋調(diào)“100”-T5. 轉(zhuǎn)至

5、A檔，測吸光度-A6. 記錄，重復(fù)測三次15標(biāo)準(zhǔn)管待測管實(shí)驗(yàn)步驟空白管四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果原始數(shù)據(jù) A標(biāo)，A測（3次測量結(jié)果的平均值）計(jì)算結(jié)果 C測= A測*C標(biāo)/A標(biāo) （標(biāo)準(zhǔn)管：相當(dāng)于血清蛋白濃度50 g/L）17注意事項(xiàng)1.按順序添加試劑，做好標(biāo)記，計(jì)時從第一管加入后開始。2.試劑乙在酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下（試劑甲）易被破壞，因此加試劑乙后要立即混勻，加一管混勻一管，使試劑乙（磷目酸）在破壞前即被還原。18分光光度計(jì)的注意事項(xiàng)拉比色桿時動作要輕。2. 手持比色杯的毛面(粗糙面)，不盛裝比色液時，約達(dá)比色杯2/3體積，不宜過多或過少；若不慎使溶液流至比色杯外，須用棉花或擦鏡紙吸干，才能放入比色架。比色杯用后應(yīng)立即用自來水沖洗干凈。3. 測定溶液濃度的吸光度值在0.10.8之間最符合光吸收定律，線性好、讀數(shù)誤差較小。 實(shí)驗(yàn)名稱 摘要（