生物細(xì)胞學(xué)課件文字版：第03章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

1、第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié) 細(xì)胞及其組分的分析方法第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程第四節(jié) 細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化第五節(jié) 模式生物與功能基因組的研究第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡一、光學(xué)顯微(light microscope)(P49,30)(一)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡組成：光學(xué)放大系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、鏡架及樣品調(diào)節(jié)系統(tǒng)；性能參數(shù)：放大倍數(shù)、分辨率、清晰度、焦點(diǎn)深度、鏡像亮度等，其中最重要的是分辨率。分辨率（分辨本領(lǐng)）：能區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。該距離越小，則分辨率越高。顯

2、微鏡的分辨率計(jì)算公式：D=0.61/Nsin(/2) 光源波長(zhǎng)，物鏡鏡口角，N介質(zhì)折射率光學(xué)顯微鏡的最大分辨率最大值140；最小波長(zhǎng)450nm；介質(zhì)折射率N 油浸下1.5（ N 空氣1.0 ）；因此普通光鏡的分辨力極限為0.2微米，此數(shù)值亦為顯微水平和亞微水平的分界點(diǎn)。（稱為瑞利極限，Rayleigh limit）普通光鏡有效放大倍數(shù)（經(jīng)驗(yàn)值）=物鏡最大鏡口率（數(shù)值孔徑NA numerical aperture）1000提高光學(xué)顯微鏡分辨力的手段a、縮短照明光線波長(zhǎng)；b、應(yīng)用特殊光學(xué)效應(yīng)，增強(qiáng)反差。光學(xué)顯微鏡樣品制備取材固定（fixation）：使用固定劑（fixative）殺死細(xì)胞，并使細(xì)胞

3、結(jié)構(gòu)盡可能接近活細(xì)胞；包埋：石蠟切片：切片機(jī)脫蠟、染色：多種染料封片、觀察。顯微鏡技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合倒置顯微鏡（二）相差和微分干涉顯微鏡(P51，31)1、相差顯微鏡：（phase-contrast microscope, Ph ）1935年P(guān). Zernicke(德)發(fā)明，1953年獲得Nobel物理獎(jiǎng)；它利用光的衍射和干涉原理，將光的相位差（人眼無法感受）振幅差（人眼可以感受）；無色透明物體中的細(xì)節(jié)表現(xiàn)為明與暗的對(duì)比；適合觀察活細(xì)胞和未染色的樣品 。 兩束光波之間的相互干涉2、微分干涉顯微鏡(P51，32)（differentialinterference microscope ，DIM

4、）DIM獲得的反差取決于光線穿過樣品折射率變化的速率。樣品邊緣結(jié)構(gòu)反差增大（相對(duì)小的距離內(nèi)折射率發(fā)生明顯變化）。Nomarski microscope推薦閱讀細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南下冊(cè)，科學(xué)出版社，P896（三）熒光顯微鏡（fluorescence microscopy）原理：以紫外光為光源，激發(fā)標(biāo)本中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光，從而對(duì)某些物質(zhì)進(jìn)行定性和定位分析。熒光種類： 自發(fā)熒光：細(xì)胞內(nèi)某些天然物質(zhì)被UV激發(fā)產(chǎn)生的熒光，如葉綠素產(chǎn)生血紅色熒光。 誘發(fā)熒光：細(xì)胞中加入熒光染料，與特定成分結(jié)合，經(jīng)過UV照射發(fā)出熒光。（四）激光掃描共聚焦顯微技術(shù)(P53，33)（laser scanning confocal m

5、icroscope，LSCM）推薦閱讀細(xì)胞生物學(xué)熒光技術(shù)原理和應(yīng)用劉愛平等中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社The Nobel Prize in Chemistry 2008Green Fluorescent Protein, GFPGFP用途作為報(bào)告基因構(gòu)建基因工程載體；目的基因的功能研究；蛋白質(zhì)締合作用研究；病原體與宿主關(guān)系的研究；GFP 在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用；GFP 在生物防治中的應(yīng)用GFP 作為一種新型免疫標(biāo)記物的探索二、電子顯微鏡(P56，34)1932年E.Ruska(德國(guó)),1986年獲得Nobel物理獎(jiǎng)（一）電子顯微鏡基本知識(shí)電子顯微鏡是模仿光學(xué)顯微鏡的工作原理，用電子束來代替可見光束，用電磁

6、線圈代替玻璃透鏡匯聚電子束，通過熒光屏或者膠片捕獲圖像的觀察工具，理論分辨率可達(dá)0.2nm 。1、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別（表31）HITACHI H-8100透射電子顯微鏡3、電子顯微鏡基本構(gòu)造(P57，35)電鏡特點(diǎn)（1）“照明”光源電子束（2）放大倍數(shù)調(diào)節(jié)方式改變磁透鏡電流強(qiáng)度（3）高電壓工作幾萬十幾萬伏（4）內(nèi)部高真空104托（5）樣品厚度90nm電子穿透力有限，產(chǎn)熱（6）標(biāo)本染色技術(shù)不同重金屬鹽（正染，負(fù)染）超薄切片技術(shù)正染冰凍蝕刻（冰凍斷裂）技術(shù)freezeetching（freezefracture）樣品于-190快速冰凍在真空中用冷卻刀切割撕裂真空中冰升華暴露出的斷裂面

7、噴碳膜或者碳-鉑膜（表面復(fù)型膜）用有機(jī)溶劑或酶去除樣品將膜金屬噴鍍后在電鏡下觀察4、電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)低溫電鏡：不經(jīng)固定、染色、干燥，低溫下成像。5、掃描電鏡技術(shù)（P62，38）（scanning electron microscope，SEM）SEM發(fā)明于1965年；工作原理：利用電子束逐點(diǎn)掃描樣品表面，通過檢測(cè)樣品表面散發(fā)的二次電子，將樣品表面的形貌逐點(diǎn)成像，并合成為放大的圖像。 PHILIPS XL20掃描電子顯微鏡SEM的特點(diǎn)：（1）可觀察較大較厚的樣品；（2）景深大，圖像清晰逼真，具有強(qiáng)烈的立體感；（3）放大倍數(shù)在2020萬倍間連續(xù)變換，無需多次聚焦；（4）樣品可在樣品室內(nèi)多

8、方位移動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)；（5）分辨力不太高：310nm（6）只能觀察標(biāo)本表面，不能觀察內(nèi)部。推薦閱讀實(shí)用電子顯微鏡技術(shù)付洪蘭 高等教育出版社三、掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope，STM）（P63）1981年發(fā)明；用于探測(cè)物質(zhì)表面形貌的儀器；利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。STM的特點(diǎn)：（1）具有原子尺度的高分辨本領(lǐng)；（2）真空、大氣、液體環(huán)境中都能工作；（3）非破壞性測(cè)量，保持樣品原貌。原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）本 節(jié) 完第二節(jié) 細(xì)胞及其組分的分析方法一、超速離心技術(shù)（P64，39）離心技術(shù)原理不同的細(xì)胞器具有不同的密度和

9、體積，因此，可以利用離心方法加以分離和純化。1、差速離心（differential centrifugation）利用不同的離心速度產(chǎn)生的不同的離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分離開來。適合分離沉降速率差別較大的亞微結(jié)構(gòu)顆粒。多次離心達(dá)到純化的目的2、密度梯度離心（P65）（1）速度沉降分離密度接近大小不一的組分（2）等密度沉降分離不同密度的組分將介質(zhì)形成一涵蓋所有組分密度的密度梯度，不同的樣品由于其密度差異，在離心過程中進(jìn)入到等密度介質(zhì)區(qū)域即不再移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)分離的目的。速度沉降和等密度沉降的比較二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法（P65，40）利用一些顯色劑與被測(cè)物質(zhì)中的某些基團(tuán)特異性結(jié)合，

10、來判斷核酸、蛋白質(zhì)（酶）、糖類、脂類在細(xì)胞中的分布和含量。福爾根（Feulgen）反應(yīng)顯示DNA格莫瑞（Gomori）反應(yīng)顯示堿性磷酸酶三、特異蛋白抗原的定位與定性P66，40原理：抗體能夠自行識(shí)別并結(jié)合對(duì)應(yīng)的抗原目的：檢測(cè)特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況和含量。（一）免疫熒光技術(shù)（二）免疫電鏡技術(shù)人成纖維細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白束（800）BHK細(xì)胞中的微管蛋白（500）四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位和定性研究對(duì)象：細(xì)胞內(nèi)特異核酸（DNA或RNA）目的：定位、定量分析方法： 原位雜交（in situ hybridization，ISH） 以目標(biāo)核酸的互補(bǔ)序列為探針，對(duì)細(xì)胞或者組織標(biāo)本進(jìn)行雜交處理，使目標(biāo)核酸可視

11、呈現(xiàn)的技術(shù)。 是細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)相互交融的研究手段。構(gòu)建DNA分子物理圖譜核型分析光譜核型分析（spectral karyotype， SKY）SKY of Human五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)P69，41 細(xì)胞分選（cell sorting） 是細(xì)胞生物學(xué)中較新技術(shù)，是利用流式細(xì)胞儀（flow cytometery，F(xiàn)CM）對(duì)細(xì)胞或者其他生物微粒（如染色體）進(jìn)行分選，并對(duì)其進(jìn)行定量分析（大小、形狀、核酸含量和蛋白質(zhì)含量等）的技術(shù)。1、流式細(xì)胞儀（FCM） 是集合了流體噴射、激光、伽馬射線能譜、電子計(jì)算機(jī)、顯微熒光光度計(jì)量等技術(shù)于一體的設(shè)備;可以定性和定量分析生物顆粒

12、（包括細(xì)胞）的物理化學(xué)特性并將之分離純化;目前的FCM已經(jīng)運(yùn)用于細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、血清學(xué)、藥物學(xué)等研究領(lǐng)域，可以用來分析免疫復(fù)合物、病毒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、簡(jiǎn)單多細(xì)胞生物等等。BECKMAN MOFOLXDP流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)和工作原理2、標(biāo)記細(xì)胞： 免疫熒光染色 熒光素標(biāo)記抗體：異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅素（PE）、德克薩斯紅（Texas Red） 熒光染色分為：直接染色和間接染色 熒光染料直接染色 使用PI（碘化丙啶, propidium iodide）或DAPI，對(duì)固定處理過的細(xì)胞(核)直接進(jìn)行染色第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培

13、養(yǎng)P70,421、什么是細(xì)胞培養(yǎng) 是指從機(jī)體內(nèi)取出某種組織或者細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件使其在體外生存、生長(zhǎng)和繁殖的過程。細(xì)胞培養(yǎng)示意圖2、細(xì)胞培養(yǎng)分類：按照培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物是否經(jīng)過了分割，分類為：（1）原代培養(yǎng)（primary culture） 直接從機(jī)體取出組織或者細(xì)胞后所進(jìn)行的首次培養(yǎng)。（2）繼代培養(yǎng)（secondary culture）/傳代培養(yǎng)（subculture） 當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖到一定的密度后，將其從原培養(yǎng)容器中取出，按照一定的比例向另外一（多）個(gè)容器中接種所進(jìn)行的再培養(yǎng)，簡(jiǎn)稱傳代。傳代的累計(jì)次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。兩個(gè)概念（1）細(xì)胞系（cell line）：通過原代培養(yǎng)并且經(jīng)

14、過傳代后所形成的細(xì)胞群體，由于來源于原代培養(yǎng)物，故一個(gè)細(xì)胞系往往由多個(gè)生物學(xué)性狀不同的細(xì)胞群體組成。如HeLa、CHO等。（2）細(xì)胞株（cell strain）：利用單細(xì)胞分離培養(yǎng)法或者克隆形成法從原代培養(yǎng)物或者細(xì)胞系中選擇出來的細(xì)胞群體，一個(gè)細(xì)胞株往往具有特殊的生物學(xué)性狀或者標(biāo)記，并且可以持續(xù)存在。二、細(xì)胞工程（cell engineering）細(xì)胞培養(yǎng)、分化誘導(dǎo)、細(xì)胞融合、顯微注射等。（一）細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)1、細(xì)胞融合（cell fusion）兩個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞融合成雙核或者多核細(xì)胞的現(xiàn)象。產(chǎn)生的細(xì)胞稱為融合細(xì)胞。2、細(xì)胞融合的應(yīng)用：動(dòng)物和植物的不同種、屬之間的細(xì)胞可以融合;動(dòng)植物之間的細(xì)胞可以融合; 應(yīng)用于研究核質(zhì)關(guān)系、繪制染色體基因圖譜、制備單克隆抗體、研究腫瘤發(fā)生機(jī)制等領(lǐng)域。3、人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合：病毒誘導(dǎo)融合：滅活的仙臺(tái)病毒等。化學(xué)誘導(dǎo)融合：PEG電激誘導(dǎo)融合：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)（1984年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）（二）顯微操作技術(shù)與動(dòng)物克隆第四節(jié) 細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)一、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（P45）Fluorescence Photobleaching Rev