腫瘤的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)PPT通用課件

1、 第十五章 線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)濱醫(yī)附院檢驗(yàn)科 袁笑“千手觀音” 21位聾啞演員中 18人有藥物史部分患者使用正常劑量也會(huì)致聾“一針致聾”現(xiàn)象線(xiàn)粒體基因突變（A1555G）+環(huán)境（使用氨基糖苷類(lèi)）線(xiàn)粒體（Mitochondrion）31. 真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，二分裂方式進(jìn)行新陳代謝，平均壽命10天2. 多數(shù)細(xì)胞含幾個(gè)到幾千個(gè)線(xiàn)粒體3. 每個(gè)線(xiàn)粒體含2-10 線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）線(xiàn)粒體的主要功能 1、參與人體很多重要的生物化學(xué)過(guò)程（三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸分解代謝、血紅素合成和部分尿素合成過(guò)程）被稱(chēng)為“細(xì)胞的能量工廠” 2、線(xiàn)粒體體積大小，數(shù)量增減反應(yīng)器官功能負(fù)荷的變化。第一

2、節(jié)線(xiàn)粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)第一節(jié) 線(xiàn)粒體基因組與線(xiàn)粒體病人體細(xì)胞中的線(xiàn)粒體DNA具有自主的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄功能，為非孟德?tīng)栠z傳方式，故稱(chēng)為25號(hào)染色體。25號(hào)染色體7（一）人類(lèi)線(xiàn)粒體基因組1、基因組小, 16569 bp2、雙鏈環(huán)狀DNA外環(huán)富含鳥(niǎo)嘌呤稱(chēng)為重鏈，內(nèi)環(huán)富含胞嘧啶稱(chēng)輕鏈3、1）編碼區(qū) 13 結(jié)構(gòu)基因 / mRNA22 tRNA 基因2 rRNA 基因2）非編碼區(qū)D-loop（約1120bp）L鏈復(fù)制起始區(qū)（約3050bp，tRNAAsn-tRNACys）一、線(xiàn)粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)1、結(jié)構(gòu)基因7個(gè)為NADH-CoQ還原酶復(fù)合體（復(fù)合體）的亞基（ND1、ND2、ND3、ND4L、ND

3、4、ND5和ND6）1個(gè)編碼的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)為CoQH2-細(xì)胞色素c還原酶復(fù)合體（復(fù)合體）中細(xì)胞色素b的亞基 3個(gè)為構(gòu)成細(xì)胞色素c氧化酶（COX）復(fù)合體（復(fù)合體）催化活性中心的亞單位（COX、COX和COX）2個(gè)為ATP合酶復(fù)合體（復(fù)合體）F0部分的2個(gè)亞基（A6和A8）1、結(jié)構(gòu)基因2、tRNA基因22個(gè)tRNA 基因可轉(zhuǎn)錄20種tRNA 滿(mǎn)足線(xiàn)粒體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯的需要。tRNALeutRNASer 都有2個(gè)基因外，其余18種均只有1個(gè)基因。3、rRNA基因1、mtRNA 編碼兩種rRNA,即12SrRNA16SrRNA2、位于H鏈tRNAPhetRNALeu之間以tRNAVal相隔 3、變異常發(fā)生

4、在二級(jí)結(jié)構(gòu)莖環(huán)上。4、非編碼區(qū)D-loop（約1120bp）位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間，約1120bp,是mtDNA中變異最多的區(qū)域，參與并調(diào)控mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。L鏈復(fù)制起始區(qū)（約3050bp，tRNAAsn-tRNACys可折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。（二）線(xiàn)粒體基因表達(dá)系統(tǒng)及特點(diǎn)1、密碼子1979年，Barrell 報(bào)道了人線(xiàn)粒體DNA所用的遺傳密碼。 通用遺傳密碼和線(xiàn)粒體遺傳密碼的差異密碼子線(xiàn)粒體DNA編碼核DNA編碼UGA色氨酸終止AUA起始異亮氨酸AGG終止精氨酸（二）線(xiàn)粒體基因表達(dá)系統(tǒng)及特點(diǎn)2、mtDNA復(fù)制特點(diǎn)D環(huán)復(fù)制為主要模式，重鏈以逆時(shí)針?lè)较驈?fù)制，輕鏈以順時(shí)針?lè)较驈?fù)

5、制。nDNA只在細(xì)胞分裂時(shí)復(fù)制，mtDNA一直處于分裂狀態(tài)，并由nDNA編碼的調(diào)控因子控制。mtDNA復(fù)制特點(diǎn) mtDNA可進(jìn)行半保留復(fù)制，其H鏈復(fù)制的起始點(diǎn)（OH）與L鏈復(fù)制起始點(diǎn)（OL）相隔2/3個(gè)mtDNA。復(fù)制起始于L鏈的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，首先以L(fǎng)鏈為模板合成一段RNA作為H鏈復(fù)制的引物，在DNA聚合酶作用下，復(fù)制一條互補(bǔ)的H鏈，取代親代H鏈與L鏈互補(bǔ)。被置換的親代H鏈保持單鏈狀態(tài)，這段發(fā)生置換的區(qū)域稱(chēng)為置換環(huán)或D環(huán)，故此種DNA復(fù)制方式稱(chēng)D-環(huán)復(fù)制。（二）線(xiàn)粒體基因表達(dá)系統(tǒng)及特點(diǎn)3、mtDNA轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)對(duì)稱(chēng)性轉(zhuǎn)錄，重鏈啟動(dòng)子啟動(dòng)重鏈順時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)錄，輕鏈啟動(dòng)子啟動(dòng)輕鏈逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)錄。成熟的m

6、RNA只在3末端加polyA尾巴，5 末端不修飾帽子結(jié)構(gòu)（二）線(xiàn)粒體基因表達(dá)系統(tǒng)及特點(diǎn)4、線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)的合成特點(diǎn) 自主編碼合成13個(gè)多肽，其余功能所需蛋白均由核基因組編碼，與細(xì)菌合成蛋白質(zhì)體系十分相似?！肮采鷮W(xué)說(shuō)”18核基因組編碼了1500多個(gè)線(xiàn)粒體蛋白線(xiàn)粒體基因組只編碼了13條多肽鏈“交叉對(duì)話(huà)（cross-talk）”機(jī)制（三）mtDNA與nDNA的相互關(guān)系1、nDNA的表達(dá)狀況可直接影響和調(diào)控mt DNA的表達(dá)和線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)的生物合成。2、 mt DNA突變可直接影響mt DNA所編碼蛋白多肽的合成，而影響有氧呼吸、物質(zhì)代謝和能量代謝，并進(jìn)一步通過(guò)線(xiàn)粒體功能變化反饋影響n(yōu)DNA的復(fù)制和表達(dá)

7、。3、各種轉(zhuǎn)錄因子是其通訊的基礎(chǔ)?！敖徊鎸?duì)話(huà)（cross-talk）”機(jī)制二、線(xiàn)粒體病的概念因線(xiàn)粒體功能受損或缺陷而導(dǎo)致的疾病。主要累及大腦和肌肉組織。分為線(xiàn)粒體肌病，線(xiàn)粒體腦病、線(xiàn)粒體腦肌病線(xiàn)粒體功能涉及眾多的組織器官21三、線(xiàn)粒體病的特征（一）母系遺傳與遺傳早發(fā)線(xiàn)粒體疾病的母系遺傳(二)同質(zhì)性突變與異質(zhì)性突變與發(fā)病閾值效應(yīng)24線(xiàn)粒體基因同質(zhì)性（Homoplasmy）0 或 100%異質(zhì)性（Heteroplasmy） 0-100%核基因純合子（Homozygous） 0 或 100%雜合子（Heterozygous）50%mtDNA同質(zhì)性/異質(zhì)性突變與閾值25線(xiàn)粒體DNA的突變率極高，約比核

8、DNA高10-20倍。 線(xiàn)粒體DNA排列緊湊，沒(méi)有內(nèi)含子，任何mtDNA的突變都可能影響其基因組的重要功能；線(xiàn)粒體DNA缺少組蛋白的保護(hù)；線(xiàn)粒體DNA容易被呼吸鏈生成自由基氧化損傷；線(xiàn)粒體中沒(méi)有DNA損傷的修復(fù)系統(tǒng)；四、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)志四、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)志（一）mtDNA堿基位點(diǎn)1、點(diǎn)突變 1）結(jié)構(gòu)基因點(diǎn)突變包括同義突變和錯(cuò)義突變，錯(cuò)義突變導(dǎo)致氨基酸的替換，由此引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致疾病。Leber視神經(jīng)?。↙HON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）1、點(diǎn)突變 2）tRNA基因的點(diǎn)突變，可以降低線(xiàn)粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成的能力，從

9、而影響線(xiàn)粒體氧化磷酸化的功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。MELAS綜合征（線(xiàn)粒體腦肌病乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作）：A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(UUR)基因）四、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)志2、單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)單個(gè)核苷酸變異引起的mtDNA序列的多態(tài)性，與不同人群有關(guān)。3、線(xiàn)粒體單體群 在進(jìn)化過(guò)程中，母系遺傳的mtDNA為適應(yīng)環(huán)境所形成的堿基位點(diǎn)多態(tài)性集合。（二） mtDNA缺失或插入片段 大片段重組包括缺失和重復(fù)，以缺失較為常見(jiàn)。 大片段的缺失往往涉及多個(gè)基因，可導(dǎo)致線(xiàn)粒體OXPHOS功能下降，產(chǎn)生的ATP減少，從而影響組織器官的功能。 常見(jiàn)缺失： 848313459：

10、Kearns-Sayre綜合癥（KSS）、缺血性心臟病 ； 863716073：與衰老有關(guān)的退行性疾病； 438914812：能量代謝受到嚴(yán)重破壞 。（二） mtDNA拷貝數(shù)的變化mtDNA拷貝數(shù)可作為評(píng)價(jià)線(xiàn)粒體功能的指標(biāo)，當(dāng)拷貝數(shù)減少時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞能量缺乏，由此引發(fā)疾病，在胃癌、食管鱗癌等腫瘤細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)下降，有可能成為一種新的腫瘤標(biāo)志物。第二節(jié)線(xiàn)粒體病分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)及質(zhì)量控制一、線(xiàn)粒體病分子生物學(xué)檢驗(yàn)策略二、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)（一）PCR-RFLP技術(shù)PCR-RELP的質(zhì)量控制（1）模板DNAD的制備和引物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)合適的引物擴(kuò)增目的模板DNA（2）酶的選擇：去除干擾物

11、質(zhì)，根據(jù)酶活性要求選擇適宜的緩沖液、活性劑等，酶的用量不超過(guò)總體積的10%。（3）PCR擴(kuò)增體系和酶切反應(yīng)條件：優(yōu)化保證PCR產(chǎn)物的純度和精度，設(shè)計(jì)好酶切反應(yīng)體系，根據(jù)內(nèi)切酶活性，適時(shí)終止反應(yīng)。（4）結(jié)果分析：根據(jù)酶解片段選擇不同濃度的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，染色后觀察擴(kuò)增基因的變異情況。二、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)（二）變性高效液相色譜法在部分變性的條件下，通過(guò)雜合與純合二倍體在柱中保留時(shí)間的差異，發(fā)現(xiàn)DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時(shí)間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來(lái)，在色譜圖中表現(xiàn)

12、為雙峰或多峰的洗脫曲線(xiàn)。 DHPLC檢測(cè)的質(zhì)量控制1、 DHPLC檢測(cè)的樣本要求（1）片段大小：最好在200-500bp.敏感性最好。（2）樣品質(zhì)量：檢測(cè)前不許純化，核苷酸和引物會(huì)很早被洗脫，模板大分子在樣品峰后洗脫。引物二聚體和非特異性擴(kuò)增及堿基數(shù)類(lèi)似的污染物需優(yōu)化PCR去除。（3）樣品含量：PCR濃度必須足夠大，要求2微升產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)清晰條帶，相當(dāng)于濃度至少20ng/ul.（1）PCR引物的設(shè)計(jì)：引物長(zhǎng)度200-500bp范圍，且只有一個(gè)溶解區(qū)域，無(wú)錯(cuò)配的PCR片段（2）PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，控制好溫度和時(shí)間達(dá)到模板雙鏈完全變性、復(fù)性（3）DHPLC檢測(cè)上樣前要驗(yàn)證PCR產(chǎn)物質(zhì)

13、量，以保證結(jié)果準(zhǔn)確性。（4）結(jié)果分析：在部分變性條件下出現(xiàn)異源雙鏈峰，表明異質(zhì)性突變位點(diǎn)，反之則為同源單峰。建議購(gòu)買(mǎi)陽(yáng)性質(zhì)控品。2、DHPLC檢測(cè)的條件優(yōu)化二、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)（三）DNA芯片技術(shù)略（四）DNA測(cè)序技術(shù)略三、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用（一）MELAS綜合征11月23日，讀初三的曉炎從學(xué)?；丶液螅櫞耗染透杏X(jué)女兒臉色不好，以為曉炎在學(xué)校吃的沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)，就趕緊給女兒做了頓好飯?？蓵匝壮赃^(guò)飯后不久，就開(kāi)始嘔吐。當(dāng)晚凌晨2點(diǎn)鐘，曉炎出現(xiàn)了全身抽搐的癥狀，看到女兒四肢顫抖，嘴眼歪斜，顧春娜趕緊撥打120，急救車(chē)將女兒送到醫(yī)院救治。入院后的曉炎，直接被送進(jìn)了ICU重癥監(jiān)護(hù)室。經(jīng)

14、過(guò)醫(yī)院的多次檢查，也沒(méi)有最終確診，院方建議顧春娜帶曉炎去北京治療。到了北京兒童醫(yī)院，終于確診曉炎患上的是一種因遺傳基因的缺陷而導(dǎo)致的線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常，病癥名稱(chēng)為線(xiàn)粒體腦肌病。MELAS綜合征發(fā)病特點(diǎn)母系遺傳1040歲發(fā)病，10歲前發(fā)育正常。首發(fā)癥狀為運(yùn)動(dòng)不耐受、卒中樣發(fā)作、偏輕癱、失語(yǔ)、皮層盲或聾。并有肢體無(wú)力、抽搐或陣發(fā)性頭痛、智能低下癡呆及乳酸血癥MELAS基因已發(fā)現(xiàn)4種點(diǎn)突變與大多數(shù)MELAS病例有關(guān)，其中2種分別在第A3243G、T3271C位核苷酸，最常見(jiàn)其中80%是A3243G的突變45399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G 為異

15、質(zhì)性突變PCR-RFLP（限制酶Apa）PCR-DHPLCWTA3242Gmt3243 突變DNA序列測(cè)定 3243正常序列突變雜合子三、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用（二）Leber遺傳性視神經(jīng)病變Leber遺傳性視神經(jīng)病是以德國(guó)眼科醫(yī)生Theodor Leber的名字命名的，又稱(chēng)Leber視神經(jīng)萎縮，為一種急性或亞急性發(fā)作的母系遺傳病，男女病人比例5:1，至今尚未發(fā)現(xiàn)一個(gè)男性患者將此病傳給后代。視神經(jīng)與視網(wǎng)膜神經(jīng)元退化，發(fā)病較早，表現(xiàn)急性亞急性視力減退，中心視野喪失明顯，導(dǎo)致失明。突變位點(diǎn)基因同質(zhì)性/異質(zhì)性首次報(bào)道*G3316AND1同質(zhì)性Saillard et al.(2000)T3394

16、CND1同質(zhì)性Hofmann et al.(1997)G3460A*ND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Huoponen et al.(1991)C3497TND1同質(zhì)性Kong et al.(2003）G3733AND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Valentino et al.(2004)C4171AND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Kim et al.(2002)T4216CND1同質(zhì)性Torroni et al.(1994）A4435GtRNAMet同質(zhì)性Herrnstadt et al.（2002）G7444ACO同質(zhì)性Huoponen et al.（1993）T10663CND同質(zhì)性Brown et al.(1995)G11

17、696AND4同質(zhì)性/異質(zhì)性Zhou et al.（2006）G11778A*ND4同質(zhì)性/異質(zhì)性Wallace et al.(1988)T12338CND4同質(zhì)性Wong et al.（2002）G14459AND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Jun et al.(1994)C14482G/AND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Howell et al.(1998)T14484C*ND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Johns et al.(1992)A14495GND6異質(zhì)性Chinnery et al.(2001)T14502CND6同質(zhì)性O(shè)zawa et al.（1991）C14568TND6同質(zhì)性Wissinger et al.

18、(1997)A14693GtRNAGlu同質(zhì)性/異質(zhì)性Tzen et al.（2003）A15951GtRNAThr同質(zhì)性L(fǎng)i et al.（2006）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College49原發(fā)性突變：G3460A， G11778A，T14484C的突變，占全部LHON的 80-90繼發(fā)性突變：T3394C ，T4216C ，C4019T，G5244A ，C4777T，G9438A ，G13708A ，G15257A新突變： A4435G 位于tRNAMet 基因可以調(diào)節(jié)ND4 G11778A 突變的外顯率與Leber遺

19、傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變11778GA 90. 9%,3460GA 1. 8%, 14484TC 7. 3% 是目前公認(rèn)的致病性最強(qiáng)的三種原發(fā)性突變11778GA發(fā)病時(shí)視力多低于0.1，視力預(yù)后也最差；14484TC發(fā)病時(shí)視力及視力恢復(fù)情況明顯好于11778GA患者 11778GA導(dǎo)致編碼NADH脫氫酶亞單位4(ND4)中第340位的Arg精His組，改變ND4空間構(gòu)型，NADH脫氫酶活性降低，線(xiàn)粒體產(chǎn)能效率下降，視神經(jīng)細(xì)胞提供能量不能長(zhǎng)期維持視神經(jīng)完整結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞退行性變、死亡。11778 GA3460GA(ND1) 14484TC(ND6)Leber病變相關(guān)的mtDNA突變

20、常用檢測(cè)技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)PCR-SSCP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測(cè)序技術(shù)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College52G3460A， G11778A，T11484C原發(fā)性突變測(cè)序圖三、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用（三）藥物性耳聾突變位點(diǎn)基 因同質(zhì)性/異質(zhì)性疾 病首次報(bào)道aT961delT+C(n)ins961insC12S rRNA同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Bacino et al.(1995)Tang et al.(2002)T1095C12S rRNA同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Thyagaraja

21、n et al. (2000)C1494T12S rRNA同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Zhao et al.(2004)A1555G12S rRNA同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Prezant et al.(1993)G1606AtRNAVal異質(zhì)性綜合征型耳聾Tiranti et al.(1998)A3243GtRNALeu(UUR)異質(zhì)性綜合征型耳聾van den Ouweland, et al.(1992)G7444ACO1/ tRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Pandya et al.(1999)A7445GCO1/ tRNASer(UCN)

22、同質(zhì)性/異質(zhì)性非綜合征型耳聾Reid et al.(1994)7472insCtRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性綜合征型耳聾Tiranti et al.(1995)T7511CtRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性非綜合征型耳聾Sue et al.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性綜合征型耳聾Nakamura et al. (1995)A8344GtRNALys異質(zhì)性綜合征型耳聾Shoffner et al. (1990)G8363AtRNALys異質(zhì)性綜合征型耳聾Santorelli et al. (1996)T14709CtRNAGlu同質(zhì)性綜合征型耳聾Ri

23、goli et al.(2001)G15927AtRNAThr同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Wang et al.(2008)第二節(jié) 線(xiàn)粒體基因組與耳聾耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測(cè)PCR-RFLP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測(cè)序技術(shù)基因芯片技術(shù)55檢測(cè)位點(diǎn)引物序列(53)退火溫度() 產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)A1555GC1494TCGA TCA ACC TCA CCA CCT CT58802TGG ACA ACC AGC TAT CAC CAA7445GACG CCA AAA TCC ATT TCA CT58987CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT三、線(xiàn)粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用（

24、四）線(xiàn)粒體糖尿病線(xiàn)粒體糖尿病美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(1997)/世界衛(wèi)生組織(1999)制定了新的糖尿病分型標(biāo)準(zhǔn)，將線(xiàn)粒體基因缺陷型糖尿病列為特殊類(lèi)型糖尿病，屬于細(xì)胞功能遺傳缺陷型糖尿病，約占糖尿病總數(shù)的13據(jù)浙江省糖尿病防治中心提供的數(shù)據(jù)，浙江省糖尿病患病率為2.96%線(xiàn)粒體DNA突變與糖尿病突變位點(diǎn)累及基因同質(zhì)性/異質(zhì)性疾病首次報(bào)道C1310T12S rRNA同質(zhì)性糖尿病臨床表型Guan et al. (2010)A1438G12S rRNA同質(zhì)性糖尿病臨床表型Vawter et al.(2009)A3243G*tRNA Leu (UUR)異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Van den et al.(1992

25、)C3254AtRNA Leu (UUR)異質(zhì)性妊娠糖尿病Ng et al. (2000)T3264CtRNA Leu (UUR)異質(zhì)性糖尿病Matsuoka et al.(1997)T3271CtRNA Leu (UUR)異質(zhì)性糖尿病Jaksch et al. (1995)G3316AMT-ND1同質(zhì)性非胰島素依賴(lài)性糖尿病Ogihara et al. (1995)T3394CMT-ND1同質(zhì)性非胰島素依賴(lài)性糖尿病Wallace et al. (1995)T3398CMT-ND1同質(zhì)性糖尿病合并耳聾Jaksch et al. (1995)A3399TMT-ND1同質(zhì)性妊娠糖尿病Ng et al

26、.(2000)T4291CtRNA Ile同質(zhì)性糖尿病臨床表型Lifton et al. (2004)A4833GMT-ND2同質(zhì)性非胰島素依賴(lài)性糖尿病Onaya et al. (2000)A7472CtRNA Ser (UCN)同質(zhì)性糖尿病合并耳聾Hanna et al. (2005)A8296GtRNA Lys同質(zhì)性/異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Ohsawa et al. (1998)A10398GMT-ND3同質(zhì)性2型糖尿病Kato et al. (2003)A12026GMT-ND4同質(zhì)性糖尿病Onaya et al. (1998)C12258AtRNA Ser (AGY)異質(zhì)性糖尿病合并耳聾

27、Turnbull et al. (1998)T14709C*tRNA Glu同質(zhì)性/異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Moraes et al. (1995)T16189CMT-DLOOP同質(zhì)性2型糖尿病Poulton et al. (1998)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College5758攜帶tRNA Leu(UUR) A3243G突變的糖尿病家系School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College59399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A324

28、3G 為異質(zhì)性突變RFLPDNA SequencingDHPLCControl A3243GA3242GWTSchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College60School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 第十六章 腫瘤的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)濱醫(yī)附院檢驗(yàn)科 袁笑常見(jiàn)腫瘤標(biāo)志物與腫瘤 前列腺癌PSAEAP睪丸癌AFP, hCG胰腺癌CA 199乳房癌CA 153卵巢癌CA 125肝癌AFP肝癌AFP 腫瘤 首選標(biāo)志物 補(bǔ)充標(biāo)志物 肺癌 CEA、NSE、CYFRA21-1 TP

29、A、SCC、ACTH、降鈣素、TSA肝癌 AFP AFU、GT、CEA、ALP乳腺癌 CA15-3、CEA CA549、hCG、降鈣素、鐵蛋白 胃癌 CA72-4 CEA、CA19-9、CA242前列腺癌 PSA、f-PSA PAP結(jié)腸直腸癌 CEA CA19-9、CA50 胰腺癌 CA19-9 CA50、CEA、CA125 卵巢癌 CA125 CEA、hCG、CA19-9 睪丸腫瘤 AFP、hCG宮頸癌 SCC CA125、CEA、TPA 膀胱癌 無(wú) TPA、CEA 骨髓瘤 本-周蛋白、2-M 常用腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的臨床應(yīng)用腫瘤的分子診斷腫瘤從本質(zhì)上來(lái)講是基因出現(xiàn)了問(wèn)題，本質(zhì)上是一種基因病

30、同一種腫瘤其驅(qū)動(dòng)基因可能完全不同，對(duì)治療的反應(yīng)，腫瘤的發(fā)展以及預(yù)后可能完全不同不同的腫瘤其驅(qū)動(dòng)基因可能相同，對(duì)相同的針對(duì)性治療方案反應(yīng)相似因此，針對(duì)腫瘤的分子診斷愈發(fā)重要第一節(jié)腫瘤的分子生物學(xué)檢驗(yàn)策略一、腫瘤的分子生物學(xué)檢驗(yàn)策略1、檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因包括癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等。2、檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒的基因致瘤性DNA病毒：HPV,HBV,EBV等致瘤性RNA病毒：人類(lèi)T細(xì)胞白血病/淋巴瘤病毒1和HCV.3、檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物基因或Mrna在血液中的含量能反應(yīng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及對(duì)治療的反應(yīng)二、腫瘤的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)1、標(biāo)本的來(lái)源： 容易獲得（無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)）2、分析方法的選擇：敏感性高、

31、特異性強(qiáng)，適合相應(yīng)樣本的檢測(cè)方法分析DNA,RNA仍然是分子雜交、PCR、基因測(cè)序。3、新技術(shù)產(chǎn)生：基因芯片，高通量測(cè)序，分子病理學(xué)，分子顯像技術(shù)，高通量質(zhì)譜技術(shù)等。68腫瘤分子診斷的常用方法染色體數(shù)目異常：熒光原位雜交技術(shù)FISH致病基因結(jié)構(gòu)異常檢測(cè)（1） 斑點(diǎn)雜交（dot blot hybridization）（2）等位基因特異的寡核苷酸探針雜交（ASO） （3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP） （4）限制性?xún)?nèi)切酶圖譜（restriction map）分析 （5）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP ）（6）DNA 分

32、子雜交（Southern blot）致病基因表達(dá)異常檢測(cè)（1） mRNA檢測(cè) 定量PCR（2）蛋白檢測(cè)免疫組化：定性、半定量、定位Western blot ：定量第二節(jié)腫瘤診斷的生物標(biāo)志物70腫瘤診斷的生物標(biāo)志物的發(fā)展第1階段（1963-1978）：癌胚性抗原1963年 Abelev AFP1965年 Gold & Freeman CEA第2階段（1979-1989）：糖鏈抗原為主1980年 Koprowski CA19-9（1116-NS-19-9）1981年 Bast CA125（OC125）第3階段（1990以后）：基因標(biāo)志腫瘤基因標(biāo)志71一、腫瘤相關(guān)的染色體異常1、數(shù)目異常：某個(gè)癌細(xì)胞

33、的染色體共104條，包括許多異常的染色體 722. 染色體結(jié)構(gòu)異常易位、缺失、重復(fù)、環(huán)狀染色體和雙著絲粒染色體 例：Ph染色體（費(fèi)城1號(hào)染色體），慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML） ，9號(hào)和22號(hào)染色體長(zhǎng)臂易位 9號(hào)原癌基因abl和22號(hào)bcr基因組合成融合基因增高的酪氨酸激酶活性。 Ph臨床意義在于：95的CML都是Ph陽(yáng)性，可以作為診斷的依據(jù)。有時(shí)Ph先于臨床癥狀出現(xiàn)，故又可用于早期診斷。 73二、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)異常 原癌基因: sis、VEGF、EGFR、c-myc抑癌基因: APC、BRCA、p53、Rb細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因: cyclins、CDKs、CKIs細(xì)胞凋亡相關(guān)基因: Bcl-1、

34、p53、bcr-abl基因組穩(wěn)定相關(guān)基因(DNA修復(fù)基因): APE1腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因:nm23、WDNM、sis、p53腫瘤血管生成相關(guān)基因: VEGF 、EGFR、p53（一）原癌基因普遍存在于人類(lèi)或其他動(dòng)物固有的一類(lèi)基因，其在生物進(jìn)化過(guò)程中高度穩(wěn)定，對(duì)細(xì)胞無(wú)害，而且在控制細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中起重要作用。在環(huán)境致癌因素作用下，原癌基因發(fā)生點(diǎn)突變、易位激活、原癌基因擴(kuò)增、癌基因甲基化程度降低被激活成活性形式的癌基因才引起細(xì)胞癌變。(一)原癌基因點(diǎn)突變(point mutation) 癌基因在編碼順序的特定位置上的某一個(gè)核苷酸發(fā)生突變，使其表達(dá)蛋白質(zhì)中相應(yīng)的氨基酸發(fā)生變化，從而獲得了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的活性

35、 75mutation (二)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（translocation）基因重排（rearrangemant）： 有些癌基因從其染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到另一染色體的某個(gè)位置，由于調(diào)控環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致從相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)變成激活狀態(tài)，使原癌基因表達(dá)產(chǎn)物顯著增加而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 76(三)原癌基因獲得外源啟動(dòng)子而激活 腫瘤細(xì)胞中原癌基因的表達(dá)水平可以其轉(zhuǎn)錄的mRNA或翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的含量來(lái)表示 在原癌基因的上游插入外源性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可激活原癌基因，使其表達(dá)產(chǎn)物增多 病毒的增強(qiáng)子常位于5端的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(1ong terminal repeat，LTR)內(nèi)。如果增強(qiáng)子插入到原

36、癌基因的附近或遠(yuǎn)處，均使之激活，促使癌基因的表達(dá)比正常表達(dá)增高幾十甚至上百倍 77 (四)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的甲基化(methylation)對(duì)阻抑基因的轉(zhuǎn)錄具有重要作用 78（二）抑癌基因又稱(chēng)腫瘤抑制基因，為一類(lèi)可編碼對(duì)腫瘤形成起阻抑作用的蛋白質(zhì)基因，正常情況下抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化。抑癌基因失活方式： 1）DNA點(diǎn)突變或缺失導(dǎo)致一個(gè)等位基因失活。 2）DNA甲基化和組蛋白去乙?；种埔粋€(gè)等位基因表達(dá)。（三）細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因細(xì)胞周期：正常連續(xù)分裂的細(xì)胞從前一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的連續(xù)動(dòng)態(tài)過(guò)程，也是多階段多因子參與的精確而有序的調(diào)控過(guò)程。特點(diǎn)：1

37、）單向性：G1 S G2 M 2）階段性：因某種原因停滯下來(lái)，條件好轉(zhuǎn)，進(jìn)入下一時(shí)項(xiàng) 3）檢查點(diǎn)：細(xì)胞各時(shí)項(xiàng)交叉處存在檢查點(diǎn)，通過(guò)檢查點(diǎn)才能進(jìn)入下一個(gè)時(shí)項(xiàng)。細(xì)胞周期運(yùn)行的動(dòng)力主要來(lái)自細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶，它的活性受細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑調(diào)控。這些調(diào)控方式相互制約，形成一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞周期分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1、細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶CDK1-132、細(xì)胞周期蛋白CCND13、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑CDK4、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)Chk1(三)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因（四）細(xì)胞凋亡相關(guān)基因大致分為三組1、促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因2、抑制細(xì)胞凋亡基因3、細(xì)胞凋亡過(guò)程中表達(dá)的基因（五）維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定

38、相關(guān)基因DNA修復(fù)基因及基因組不穩(wěn)定性基因（六）促進(jìn)和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因（七）腫瘤血管生成相關(guān)基因VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)84三、腫瘤相關(guān)單核苷酸多態(tài)性1. SNP與腫瘤腫瘤易感基因、腫瘤藥物治療相關(guān)基因腫瘤個(gè)體化診療2. SNP的研究思路研究對(duì)象差異性研究技術(shù)：PCR、芯片研究難點(diǎn)：樣本采集85四、腫瘤相關(guān)表觀遺傳異常 （一）表觀遺傳（epigenetics）是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。這種改變是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變，且這種改變?cè)诎l(fā)育和細(xì)胞增殖過(guò)程中能穩(wěn)定傳遞。（二）分子機(jī)制：1、基因印記丟失，一對(duì)等位基因只表達(dá)來(lái)自親本一方的

39、等位基因，而與性別無(wú)關(guān)。 2、DNA甲基化：例如啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島高甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄沉默 3、組蛋白修飾與染色體重塑86五、腫瘤相關(guān)miRNA1、 miRNA與腫瘤miRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療、預(yù)后2、miRNA類(lèi)腫瘤標(biāo)志物的研究思路研究對(duì)象：實(shí)體瘤、細(xì)胞、循環(huán)血、其他研究技術(shù)：定量PCR、western blot、芯片、免疫組化、細(xì)胞培養(yǎng)（增殖、遷移、浸潤(rùn)）等等第三節(jié)腫瘤分子生物學(xué)檢驗(yàn)的臨床應(yīng)用 肺癌肺癌的分子遺傳特征1、細(xì)胞色素P450家族，絕大多數(shù)的致癌物包括內(nèi)源性和外源性都需經(jīng)過(guò)P450轉(zhuǎn)化，研究最多的CYP1A12、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）家族,使致癌物失活3、NA

40、T2家族，解毒作用90肺癌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)1、EGFR（原癌基因表皮生長(zhǎng)因子受體）基因檢測(cè) 大多數(shù)在NSCLC中過(guò)表達(dá)且是重表皮生長(zhǎng)要是治療靶標(biāo)，EGFR是表皮生長(zhǎng)因子相關(guān)酪氨酸受體家族的成員，通過(guò)與配體的結(jié)合，受體同源和異源二聚體化，從而激活受體內(nèi)源性的酪氨酸激酶，并引發(fā)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要包括Ras-Raf-MAP激酶信號(hào)通路、P3K-Akt信號(hào)通路和STAT通路。這些信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增值、分化、遷移和血管生成有很強(qiáng)的刺激效應(yīng)。91肺癌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)2、K-ras檢測(cè) ras基因，特別是K-ras基因，與肺癌的發(fā)生及預(yù)后有 關(guān)。有20%-30%的NSCLC患者存在K-ras基因突變。8

41、0%-90%的突變是12密碼子G-T引起的，導(dǎo)致K-ras蛋白組成性活化， NSCLC患者伴隨K-ras突變與預(yù)后不良有關(guān)， K-ras突變與EGFR突變是相互排斥的。伴隨K-ras突變的NSCLC患者EGFR-TK3藥物敏感性較差92肺癌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)3、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF-1）是一種分子量為38-40的核蛋白，在胎兒肺組織及成人型肺泡上皮中存在，而在型肺泡上皮中不表達(dá)，TTF-1高表達(dá)則EGFR突變率高，是服用EGFR-TK3藥物的優(yōu)勢(shì)人群。93肺癌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)4、癌胚抗原（CEA） 表達(dá)于胎兒上皮細(xì)胞的一種糖蛋白，用于檢測(cè)上皮性腫瘤，尤其是腺上皮來(lái)源的腺癌。靶向EGFR的抗腫

42、瘤藥物類(lèi)別一：小分子酪氨酸激酶抑制劑（ EGFR TKI) 作用機(jī)制：抑制EGFR胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR信號(hào)通路； 藥物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄羅替尼（羅氏）。類(lèi)別二：?jiǎn)慰寺】贵w(mAb) 作用機(jī)制：與EGFR胞外區(qū)結(jié)合，阻斷配體與EGFR的結(jié)合； 藥物代表：西妥昔（默克）；貝伐單抗（羅氏）。 乳腺癌乳腺癌基因檢測(cè)的意義BRCA1:1990年研究者發(fā)現(xiàn)一種直接與遺傳性乳腺癌有關(guān)的基因，命名為BRCA1，1994年又發(fā)現(xiàn)另外一種與乳腺癌有關(guān)的基因，稱(chēng)為BRCA2。乳腺癌遺傳檢測(cè)適宜人群 (如果有以下因素，強(qiáng)烈建議接受乳腺癌BRCA檢查)1、一個(gè)或多個(gè)直系親屬有乳腺癌史，如母親或

43、姐妹 2、家族成員里有早發(fā)乳腺癌患者，發(fā)病年齡早于40 3、家族成員里兩代以上出現(xiàn)乳腺癌患者 4、家族成員有雙側(cè)乳腺癌患者 5、家族成員里有卵巢癌患者 6、家族成員有男性成員乳腺癌患者 7、一個(gè)或多個(gè)家族成員攜帶BRCA基因突變，即遺傳檢測(cè)陽(yáng)性 乳腺癌的分子生物學(xué)檢測(cè)1、c-erb B-2/HER2基因的檢測(cè)是乳腺癌中較常見(jiàn)，易激活的原癌基因c-erb B-2/HER2基因高表達(dá)往往生存率低，惡性程度高2、雌激素受體和孕激素受體的檢測(cè)ER和PR陽(yáng)性的乳腺癌可以進(jìn)行內(nèi)分泌治療腫瘤生物學(xué)行為決定乳癌治療選擇NegativePositiveER / PgRHER-2NegativePositive

44、化療 Avastin內(nèi)分泌治療抗Her-2治療 白血病1、白血病相關(guān)基因突變（1）C-KIT基因突變（2）FLT3基因突變 (3) NPM基因突變 （4）N-ras基因突變 （5）NOTCH1基因突變2、白血病相關(guān)基因異常表達(dá)（1）WT1基因異常表達(dá)，為抑癌基因的一種，是急性白血病獨(dú)立的預(yù)后因子（2）HOX11基因異常表達(dá)，此類(lèi)患者預(yù)后較好，化療效果佳。3、白血病融合基因 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉(zhuǎn)移到第22對(duì)染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達(dá)增高，蛋白質(zhì)產(chǎn)物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生 染色體易位使位于9q3

45、4的c-abl基因轉(zhuǎn)移到第22對(duì)染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達(dá)增高，蛋白質(zhì)產(chǎn)物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生 104 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉(zhuǎn)移到第22對(duì)染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達(dá)增高，蛋白質(zhì)產(chǎn)物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生 結(jié)直腸癌大腸癌靶向治療敏感基因EGFR的傳導(dǎo)通路大腸癌靶向治療敏感性基因檢測(cè)K-RAS基因檢測(cè)已經(jīng)成為大腸癌患者治療前必做的常規(guī)檢查，是目前醫(yī)生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法K-RAS基因檢測(cè)可以

46、篩選出對(duì)抗EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個(gè)體化治療，從而達(dá)到良好的預(yù)后。早期檢測(cè)K-RAS還可以通過(guò)該基因的狀態(tài)了解到病人的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，為將來(lái)選擇最佳治療做好準(zhǔn)備。 第十七章 藥物代謝與毒副作用相關(guān)基因 的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)濱醫(yī)附院檢驗(yàn)科 袁笑是藥三分毒？ 你吃錯(cuò)藥啦!你藥吃多啦！不合理用藥導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng) 全球死亡患者中，三分之一是由于不合理用藥，而并非死于自然疾病本身。 WHO（聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織）美國(guó)每年有10萬(wàn)人死于藥物不良反應(yīng)，直接和間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)120億美元。FDA(美國(guó)食品和藥物管理局)根據(jù)藥監(jiān)局和食品藥品管理局等機(jī)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)：1、中國(guó)每

47、年有5000萬(wàn)的住院病人，其中至少250萬(wàn)與藥物不良反應(yīng)有關(guān)，20多萬(wàn)人因此而死亡。2、我國(guó)住院病人中有20是由于不合理用藥造成二次住院。傳統(tǒng)用藥的弊端 癥狀體征及儀器檢查診斷藥物治療經(jīng)驗(yàn)處方藥物治療A藥B藥C藥D藥傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)性用藥代價(jià)1、耗時(shí)多2、花費(fèi)大3、療效差4、不良反應(yīng)多5、毒副作用幾率大藥物代謝因人而異生物轉(zhuǎn)化肝臟藥物藥物重吸收代謝產(chǎn)物排泄藥物重吸收腎臟藥物毒性但有效藥物毒性且無(wú)效藥物無(wú)毒性且有效藥物無(wú)毒性也無(wú)效同種同量藥物治療一種類(lèi)型的藥并不適合所有人藥物代謝酶決定藥物反應(yīng)的因素體重/身高性別老人/小孩/孕婦病史并發(fā)癥環(huán)境因素遺傳因素（基因）不同人群藥代動(dòng)力學(xué)藥效動(dòng)力學(xué)藥物療效和毒性的個(gè)體差異基因組基因變異(單核苷酸多態(tài)性)藥物靶點(diǎn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體藥物代謝酶約59%的藥物不良反應(yīng)與遺傳相關(guān)基因變異決定藥物反應(yīng)個(gè)體差異 決定性因素單核苷酸多態(tài)性（S