腫瘤的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)PPT通用課件

1、 第十五章 線粒體病的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)濱醫(yī)附院檢驗科 袁笑“千手觀音” 21位聾啞演員中 18人有藥物史部分患者使用正常劑量也會致聾“一針致聾”現(xiàn)象線粒體基因突變（A1555G）+環(huán)境（使用氨基糖苷類）線粒體（Mitochondrion）31. 真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，二分裂方式進(jìn)行新陳代謝，平均壽命10天2. 多數(shù)細(xì)胞含幾個到幾千個線粒體3. 每個線粒體含2-10 線粒體DNA（mtDNA）線粒體的主要功能 1、參與人體很多重要的生物化學(xué)過程（三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸分解代謝、血紅素合成和部分尿素合成過程）被稱為“細(xì)胞的能量工廠” 2、線粒體體積大小，數(shù)量增減反應(yīng)器官功能負(fù)荷的變化。第一

2、節(jié)線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)第一節(jié) 線粒體基因組與線粒體病人體細(xì)胞中的線粒體DNA具有自主的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄功能，為非孟德爾遺傳方式，故稱為25號染色體。25號染色體7（一）人類線粒體基因組1、基因組小, 16569 bp2、雙鏈環(huán)狀DNA外環(huán)富含鳥嘌呤稱為重鏈，內(nèi)環(huán)富含胞嘧啶稱輕鏈3、1）編碼區(qū) 13 結(jié)構(gòu)基因 / mRNA22 tRNA 基因2 rRNA 基因2）非編碼區(qū)D-loop（約1120bp）L鏈復(fù)制起始區(qū)（約3050bp，tRNAAsn-tRNACys）一、線粒體基因組及其表達(dá)系統(tǒng)1、結(jié)構(gòu)基因7個為NADH-CoQ還原酶復(fù)合體（復(fù)合體）的亞基（ND1、ND2、ND3、ND4L、ND

3、4、ND5和ND6）1個編碼的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)為CoQH2-細(xì)胞色素c還原酶復(fù)合體（復(fù)合體）中細(xì)胞色素b的亞基 3個為構(gòu)成細(xì)胞色素c氧化酶（COX）復(fù)合體（復(fù)合體）催化活性中心的亞單位（COX、COX和COX）2個為ATP合酶復(fù)合體（復(fù)合體）F0部分的2個亞基（A6和A8）1、結(jié)構(gòu)基因2、tRNA基因22個tRNA 基因可轉(zhuǎn)錄20種tRNA 滿足線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯的需要。tRNALeutRNASer 都有2個基因外，其余18種均只有1個基因。3、rRNA基因1、mtRNA 編碼兩種rRNA,即12SrRNA16SrRNA2、位于H鏈tRNAPhetRNALeu之間以tRNAVal相隔 3、變異常發(fā)生

4、在二級結(jié)構(gòu)莖環(huán)上。4、非編碼區(qū)D-loop（約1120bp）位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間，約1120bp,是mtDNA中變異最多的區(qū)域，參與并調(diào)控mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。L鏈復(fù)制起始區(qū)（約3050bp，tRNAAsn-tRNACys可折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。（二）線粒體基因表達(dá)系統(tǒng)及特點1、密碼子1979年，Barrell 報道了人線粒體DNA所用的遺傳密碼。 通用遺傳密碼和線粒體遺傳密碼的差異密碼子線粒體DNA編碼核DNA編碼UGA色氨酸終止AUA起始異亮氨酸AGG終止精氨酸（二）線粒體基因表達(dá)系統(tǒng)及特點2、mtDNA復(fù)制特點D環(huán)復(fù)制為主要模式，重鏈以逆時針方向復(fù)制，輕鏈以順時針方向復(fù)

5、制。nDNA只在細(xì)胞分裂時復(fù)制，mtDNA一直處于分裂狀態(tài)，并由nDNA編碼的調(diào)控因子控制。mtDNA復(fù)制特點 mtDNA可進(jìn)行半保留復(fù)制，其H鏈復(fù)制的起始點（OH）與L鏈復(fù)制起始點（OL）相隔2/3個mtDNA。復(fù)制起始于L鏈的轉(zhuǎn)錄啟動子，首先以L鏈為模板合成一段RNA作為H鏈復(fù)制的引物，在DNA聚合酶作用下，復(fù)制一條互補(bǔ)的H鏈，取代親代H鏈與L鏈互補(bǔ)。被置換的親代H鏈保持單鏈狀態(tài)，這段發(fā)生置換的區(qū)域稱為置換環(huán)或D環(huán)，故此種DNA復(fù)制方式稱D-環(huán)復(fù)制。（二）線粒體基因表達(dá)系統(tǒng)及特點3、mtDNA轉(zhuǎn)錄的特點對稱性轉(zhuǎn)錄，重鏈啟動子啟動重鏈順時針方向轉(zhuǎn)錄，輕鏈啟動子啟動輕鏈逆時針方向轉(zhuǎn)錄。成熟的m

6、RNA只在3末端加polyA尾巴，5 末端不修飾帽子結(jié)構(gòu)（二）線粒體基因表達(dá)系統(tǒng)及特點4、線粒體蛋白質(zhì)的合成特點 自主編碼合成13個多肽，其余功能所需蛋白均由核基因組編碼，與細(xì)菌合成蛋白質(zhì)體系十分相似?！肮采鷮W(xué)說”18核基因組編碼了1500多個線粒體蛋白線粒體基因組只編碼了13條多肽鏈“交叉對話（cross-talk）”機(jī)制（三）mtDNA與nDNA的相互關(guān)系1、nDNA的表達(dá)狀況可直接影響和調(diào)控mt DNA的表達(dá)和線粒體蛋白質(zhì)的生物合成。2、 mt DNA突變可直接影響mt DNA所編碼蛋白多肽的合成，而影響有氧呼吸、物質(zhì)代謝和能量代謝，并進(jìn)一步通過線粒體功能變化反饋影響nDNA的復(fù)制和表達(dá)

7、。3、各種轉(zhuǎn)錄因子是其通訊的基礎(chǔ)?！敖徊鎸υ挘╟ross-talk）”機(jī)制二、線粒體病的概念因線粒體功能受損或缺陷而導(dǎo)致的疾病。主要累及大腦和肌肉組織。分為線粒體肌病，線粒體腦病、線粒體腦肌病線粒體功能涉及眾多的組織器官21三、線粒體病的特征（一）母系遺傳與遺傳早發(fā)線粒體疾病的母系遺傳(二)同質(zhì)性突變與異質(zhì)性突變與發(fā)病閾值效應(yīng)24線粒體基因同質(zhì)性（Homoplasmy）0 或 100%異質(zhì)性（Heteroplasmy） 0-100%核基因純合子（Homozygous） 0 或 100%雜合子（Heterozygous）50%mtDNA同質(zhì)性/異質(zhì)性突變與閾值25線粒體DNA的突變率極高，約比核

8、DNA高10-20倍。 線粒體DNA排列緊湊，沒有內(nèi)含子，任何mtDNA的突變都可能影響其基因組的重要功能；線粒體DNA缺少組蛋白的保護(hù)；線粒體DNA容易被呼吸鏈生成自由基氧化損傷；線粒體中沒有DNA損傷的修復(fù)系統(tǒng)；四、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗標(biāo)志四、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗標(biāo)志（一）mtDNA堿基位點1、點突變 1）結(jié)構(gòu)基因點突變包括同義突變和錯義突變，錯義突變導(dǎo)致氨基酸的替換，由此引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，導(dǎo)致疾病。Leber視神經(jīng)?。↙HON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）1、點突變 2）tRNA基因的點突變，可以降低線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成的能力，從

9、而影響線粒體氧化磷酸化的功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。MELAS綜合征（線粒體腦肌病乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作）：A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(UUR)基因）四、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗標(biāo)志2、單核苷酸多態(tài)性位點單個核苷酸變異引起的mtDNA序列的多態(tài)性，與不同人群有關(guān)。3、線粒體單體群 在進(jìn)化過程中，母系遺傳的mtDNA為適應(yīng)環(huán)境所形成的堿基位點多態(tài)性集合。（二） mtDNA缺失或插入片段 大片段重組包括缺失和重復(fù)，以缺失較為常見。 大片段的缺失往往涉及多個基因，可導(dǎo)致線粒體OXPHOS功能下降，產(chǎn)生的ATP減少，從而影響組織器官的功能。 常見缺失： 848313459：

10、Kearns-Sayre綜合癥（KSS）、缺血性心臟病 ； 863716073：與衰老有關(guān)的退行性疾??； 438914812：能量代謝受到嚴(yán)重破壞 。（二） mtDNA拷貝數(shù)的變化mtDNA拷貝數(shù)可作為評價線粒體功能的指標(biāo)，當(dāng)拷貝數(shù)減少時導(dǎo)致細(xì)胞能量缺乏，由此引發(fā)疾病，在胃癌、食管鱗癌等腫瘤細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)下降，有可能成為一種新的腫瘤標(biāo)志物。第二節(jié)線粒體病分子生物學(xué)檢驗技術(shù)及質(zhì)量控制一、線粒體病分子生物學(xué)檢驗策略二、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)（一）PCR-RFLP技術(shù)PCR-RELP的質(zhì)量控制（1）模板DNAD的制備和引物設(shè)計：設(shè)計合適的引物擴(kuò)增目的模板DNA（2）酶的選擇：去除干擾物

11、質(zhì)，根據(jù)酶活性要求選擇適宜的緩沖液、活性劑等，酶的用量不超過總體積的10%。（3）PCR擴(kuò)增體系和酶切反應(yīng)條件：優(yōu)化保證PCR產(chǎn)物的純度和精度，設(shè)計好酶切反應(yīng)體系，根據(jù)內(nèi)切酶活性，適時終止反應(yīng)。（4）結(jié)果分析：根據(jù)酶解片段選擇不同濃度的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，染色后觀察擴(kuò)增基因的變異情況。二、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)（二）變性高效液相色譜法在部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間的差異，發(fā)現(xiàn)DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現(xiàn)

12、為雙峰或多峰的洗脫曲線。 DHPLC檢測的質(zhì)量控制1、 DHPLC檢測的樣本要求（1）片段大小：最好在200-500bp.敏感性最好。（2）樣品質(zhì)量：檢測前不許純化，核苷酸和引物會很早被洗脫，模板大分子在樣品峰后洗脫。引物二聚體和非特異性擴(kuò)增及堿基數(shù)類似的污染物需優(yōu)化PCR去除。（3）樣品含量：PCR濃度必須足夠大，要求2微升產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見清晰條帶，相當(dāng)于濃度至少20ng/ul.（1）PCR引物的設(shè)計：引物長度200-500bp范圍，且只有一個溶解區(qū)域，無錯配的PCR片段（2）PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，控制好溫度和時間達(dá)到模板雙鏈完全變性、復(fù)性（3）DHPLC檢測上樣前要驗證PCR產(chǎn)物質(zhì)

13、量，以保證結(jié)果準(zhǔn)確性。（4）結(jié)果分析：在部分變性條件下出現(xiàn)異源雙鏈峰，表明異質(zhì)性突變位點，反之則為同源單峰。建議購買陽性質(zhì)控品。2、DHPLC檢測的條件優(yōu)化二、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)（三）DNA芯片技術(shù)略（四）DNA測序技術(shù)略三、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗應(yīng)用（一）MELAS綜合征11月23日，讀初三的曉炎從學(xué)?；丶液?，顧春娜就感覺女兒臉色不好，以為曉炎在學(xué)校吃的沒有營養(yǎng)，就趕緊給女兒做了頓好飯。可曉炎吃過飯后不久，就開始嘔吐。當(dāng)晚凌晨2點鐘，曉炎出現(xiàn)了全身抽搐的癥狀，看到女兒四肢顫抖，嘴眼歪斜，顧春娜趕緊撥打120，急救車將女兒送到醫(yī)院救治。入院后的曉炎，直接被送進(jìn)了ICU重癥監(jiān)護(hù)室。經(jīng)

14、過醫(yī)院的多次檢查，也沒有最終確診，院方建議顧春娜帶曉炎去北京治療。到了北京兒童醫(yī)院，終于確診曉炎患上的是一種因遺傳基因的缺陷而導(dǎo)致的線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常，病癥名稱為線粒體腦肌病。MELAS綜合征發(fā)病特點母系遺傳1040歲發(fā)病，10歲前發(fā)育正常。首發(fā)癥狀為運(yùn)動不耐受、卒中樣發(fā)作、偏輕癱、失語、皮層盲或聾。并有肢體無力、抽搐或陣發(fā)性頭痛、智能低下癡呆及乳酸血癥MELAS基因已發(fā)現(xiàn)4種點突變與大多數(shù)MELAS病例有關(guān)，其中2種分別在第A3243G、T3271C位核苷酸，最常見其中80%是A3243G的突變45399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G 為異

15、質(zhì)性突變PCR-RFLP（限制酶Apa）PCR-DHPLCWTA3242Gmt3243 突變DNA序列測定 3243正常序列突變雜合子三、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗應(yīng)用（二）Leber遺傳性視神經(jīng)病變Leber遺傳性視神經(jīng)病是以德國眼科醫(yī)生Theodor Leber的名字命名的，又稱Leber視神經(jīng)萎縮，為一種急性或亞急性發(fā)作的母系遺傳病，男女病人比例5:1，至今尚未發(fā)現(xiàn)一個男性患者將此病傳給后代。視神經(jīng)與視網(wǎng)膜神經(jīng)元退化，發(fā)病較早，表現(xiàn)急性亞急性視力減退，中心視野喪失明顯，導(dǎo)致失明。突變位點基因同質(zhì)性/異質(zhì)性首次報道*G3316AND1同質(zhì)性Saillard et al.(2000)T3394

16、CND1同質(zhì)性Hofmann et al.(1997)G3460A*ND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Huoponen et al.(1991)C3497TND1同質(zhì)性Kong et al.(2003）G3733AND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Valentino et al.(2004)C4171AND1同質(zhì)性/異質(zhì)性Kim et al.(2002)T4216CND1同質(zhì)性Torroni et al.(1994）A4435GtRNAMet同質(zhì)性Herrnstadt et al.（2002）G7444ACO同質(zhì)性Huoponen et al.（1993）T10663CND同質(zhì)性Brown et al.(1995)G11

17、696AND4同質(zhì)性/異質(zhì)性Zhou et al.（2006）G11778A*ND4同質(zhì)性/異質(zhì)性Wallace et al.(1988)T12338CND4同質(zhì)性Wong et al.（2002）G14459AND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Jun et al.(1994)C14482G/AND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Howell et al.(1998)T14484C*ND6同質(zhì)性/異質(zhì)性Johns et al.(1992)A14495GND6異質(zhì)性Chinnery et al.(2001)T14502CND6同質(zhì)性O(shè)zawa et al.（1991）C14568TND6同質(zhì)性Wissinger et al.

18、(1997)A14693GtRNAGlu同質(zhì)性/異質(zhì)性Tzen et al.（2003）A15951GtRNAThr同質(zhì)性Li et al.（2006）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College49原發(fā)性突變：G3460A， G11778A，T14484C的突變，占全部LHON的 80-90繼發(fā)性突變：T3394C ，T4216C ，C4019T，G5244A ，C4777T，G9438A ，G13708A ，G15257A新突變： A4435G 位于tRNAMet 基因可以調(diào)節(jié)ND4 G11778A 突變的外顯率與Leber遺

19、傳性視神經(jīng)病變相關(guān)的mtDNA突變11778GA 90. 9%,3460GA 1. 8%, 14484TC 7. 3% 是目前公認(rèn)的致病性最強(qiáng)的三種原發(fā)性突變11778GA發(fā)病時視力多低于0.1，視力預(yù)后也最差；14484TC發(fā)病時視力及視力恢復(fù)情況明顯好于11778GA患者 11778GA導(dǎo)致編碼NADH脫氫酶亞單位4(ND4)中第340位的Arg精His組，改變ND4空間構(gòu)型，NADH脫氫酶活性降低，線粒體產(chǎn)能效率下降，視神經(jīng)細(xì)胞提供能量不能長期維持視神經(jīng)完整結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞退行性變、死亡。11778 GA3460GA(ND1) 14484TC(ND6)Leber病變相關(guān)的mtDNA突變

20、常用檢測技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)PCR-SSCP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測序技術(shù)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College52G3460A， G11778A，T11484C原發(fā)性突變測序圖三、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗應(yīng)用（三）藥物性耳聾突變位點基 因同質(zhì)性/異質(zhì)性疾 病首次報道aT961delT+C(n)ins961insC12S rRNA同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Bacino et al.(1995)Tang et al.(2002)T1095C12S rRNA同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Thyagaraja

21、n et al. (2000)C1494T12S rRNA同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Zhao et al.(2004)A1555G12S rRNA同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Prezant et al.(1993)G1606AtRNAVal異質(zhì)性綜合征型耳聾Tiranti et al.(1998)A3243GtRNALeu(UUR)異質(zhì)性綜合征型耳聾van den Ouweland, et al.(1992)G7444ACO1/ tRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Pandya et al.(1999)A7445GCO1/ tRNASer(UCN)

22、同質(zhì)性/異質(zhì)性非綜合征型耳聾Reid et al.(1994)7472insCtRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性綜合征型耳聾Tiranti et al.(1995)T7511CtRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性非綜合征型耳聾Sue et al.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同質(zhì)性/異質(zhì)性綜合征型耳聾Nakamura et al. (1995)A8344GtRNALys異質(zhì)性綜合征型耳聾Shoffner et al. (1990)G8363AtRNALys異質(zhì)性綜合征型耳聾Santorelli et al. (1996)T14709CtRNAGlu同質(zhì)性綜合征型耳聾Ri

23、goli et al.(2001)G15927AtRNAThr同質(zhì)性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Wang et al.(2008)第二節(jié) 線粒體基因組與耳聾耳聾相關(guān)的mtDNA突變的檢測PCR-RFLP技術(shù)DHPLC技術(shù)DNA測序技術(shù)基因芯片技術(shù)55檢測位點引物序列(53)退火溫度() 產(chǎn)物長度(bp)A1555GC1494TCGA TCA ACC TCA CCA CCT CT58802TGG ACA ACC AGC TAT CAC CAA7445GACG CCA AAA TCC ATT TCA CT58987CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT三、線粒體病的分子生物學(xué)檢驗應(yīng)用（

24、四）線粒體糖尿病線粒體糖尿病美國糖尿病協(xié)會(1997)/世界衛(wèi)生組織(1999)制定了新的糖尿病分型標(biāo)準(zhǔn)，將線粒體基因缺陷型糖尿病列為特殊類型糖尿病，屬于細(xì)胞功能遺傳缺陷型糖尿病，約占糖尿病總數(shù)的13據(jù)浙江省糖尿病防治中心提供的數(shù)據(jù)，浙江省糖尿病患病率為2.96%線粒體DNA突變與糖尿病突變位點累及基因同質(zhì)性/異質(zhì)性疾病首次報道C1310T12S rRNA同質(zhì)性糖尿病臨床表型Guan et al. (2010)A1438G12S rRNA同質(zhì)性糖尿病臨床表型Vawter et al.(2009)A3243G*tRNA Leu (UUR)異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Van den et al.(1992

25、)C3254AtRNA Leu (UUR)異質(zhì)性妊娠糖尿病Ng et al. (2000)T3264CtRNA Leu (UUR)異質(zhì)性糖尿病Matsuoka et al.(1997)T3271CtRNA Leu (UUR)異質(zhì)性糖尿病Jaksch et al. (1995)G3316AMT-ND1同質(zhì)性非胰島素依賴性糖尿病Ogihara et al. (1995)T3394CMT-ND1同質(zhì)性非胰島素依賴性糖尿病Wallace et al. (1995)T3398CMT-ND1同質(zhì)性糖尿病合并耳聾Jaksch et al. (1995)A3399TMT-ND1同質(zhì)性妊娠糖尿病Ng et al

26、.(2000)T4291CtRNA Ile同質(zhì)性糖尿病臨床表型Lifton et al. (2004)A4833GMT-ND2同質(zhì)性非胰島素依賴性糖尿病Onaya et al. (2000)A7472CtRNA Ser (UCN)同質(zhì)性糖尿病合并耳聾Hanna et al. (2005)A8296GtRNA Lys同質(zhì)性/異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Ohsawa et al. (1998)A10398GMT-ND3同質(zhì)性2型糖尿病Kato et al. (2003)A12026GMT-ND4同質(zhì)性糖尿病Onaya et al. (1998)C12258AtRNA Ser (AGY)異質(zhì)性糖尿病合并耳聾

27、Turnbull et al. (1998)T14709C*tRNA Glu同質(zhì)性/異質(zhì)性糖尿病合并耳聾Moraes et al. (1995)T16189CMT-DLOOP同質(zhì)性2型糖尿病Poulton et al. (1998)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College5758攜帶tRNA Leu(UUR) A3243G突變的糖尿病家系School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College59399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A324

28、3G 為異質(zhì)性突變RFLPDNA SequencingDHPLCControl A3243GA3242GWTSchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College60School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 第十六章 腫瘤的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)濱醫(yī)附院檢驗科 袁笑常見腫瘤標(biāo)志物與腫瘤 前列腺癌PSAEAP睪丸癌AFP, hCG胰腺癌CA 199乳房癌CA 153卵巢癌CA 125肝癌AFP肝癌AFP 腫瘤 首選標(biāo)志物 補(bǔ)充標(biāo)志物 肺癌 CEA、NSE、CYFRA21-1 TP

29、A、SCC、ACTH、降鈣素、TSA肝癌 AFP AFU、GT、CEA、ALP乳腺癌 CA15-3、CEA CA549、hCG、降鈣素、鐵蛋白 胃癌 CA72-4 CEA、CA19-9、CA242前列腺癌 PSA、f-PSA PAP結(jié)腸直腸癌 CEA CA19-9、CA50 胰腺癌 CA19-9 CA50、CEA、CA125 卵巢癌 CA125 CEA、hCG、CA19-9 睪丸腫瘤 AFP、hCG宮頸癌 SCC CA125、CEA、TPA 膀胱癌 無 TPA、CEA 骨髓瘤 本-周蛋白、2-M 常用腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測的臨床應(yīng)用腫瘤的分子診斷腫瘤從本質(zhì)上來講是基因出現(xiàn)了問題，本質(zhì)上是一種基因病

30、同一種腫瘤其驅(qū)動基因可能完全不同，對治療的反應(yīng)，腫瘤的發(fā)展以及預(yù)后可能完全不同不同的腫瘤其驅(qū)動基因可能相同，對相同的針對性治療方案反應(yīng)相似因此，針對腫瘤的分子診斷愈發(fā)重要第一節(jié)腫瘤的分子生物學(xué)檢驗策略一、腫瘤的分子生物學(xué)檢驗策略1、檢測腫瘤相關(guān)基因包括癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等。2、檢測腫瘤相關(guān)病毒的基因致瘤性DNA病毒：HPV,HBV,EBV等致瘤性RNA病毒：人類T細(xì)胞白血病/淋巴瘤病毒1和HCV.3、檢測腫瘤標(biāo)志物基因或Mrna在血液中的含量能反應(yīng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及對治療的反應(yīng)二、腫瘤的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)1、標(biāo)本的來源： 容易獲得（無創(chuàng)或微創(chuàng)）2、分析方法的選擇：敏感性高、

31、特異性強(qiáng)，適合相應(yīng)樣本的檢測方法分析DNA,RNA仍然是分子雜交、PCR、基因測序。3、新技術(shù)產(chǎn)生：基因芯片，高通量測序，分子病理學(xué)，分子顯像技術(shù)，高通量質(zhì)譜技術(shù)等。68腫瘤分子診斷的常用方法染色體數(shù)目異常：熒光原位雜交技術(shù)FISH致病基因結(jié)構(gòu)異常檢測（1） 斑點雜交（dot blot hybridization）（2）等位基因特異的寡核苷酸探針雜交（ASO） （3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP） （4）限制性內(nèi)切酶圖譜（restriction map）分析 （5）限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP ）（6）DNA 分

32、子雜交（Southern blot）致病基因表達(dá)異常檢測（1） mRNA檢測 定量PCR（2）蛋白檢測免疫組化：定性、半定量、定位Western blot ：定量第二節(jié)腫瘤診斷的生物標(biāo)志物70腫瘤診斷的生物標(biāo)志物的發(fā)展第1階段（1963-1978）：癌胚性抗原1963年 Abelev AFP1965年 Gold & Freeman CEA第2階段（1979-1989）：糖鏈抗原為主1980年 Koprowski CA19-9（1116-NS-19-9）1981年 Bast CA125（OC125）第3階段（1990以后）：基因標(biāo)志腫瘤基因標(biāo)志71一、腫瘤相關(guān)的染色體異常1、數(shù)目異常：某個癌細(xì)胞

33、的染色體共104條，包括許多異常的染色體 722. 染色體結(jié)構(gòu)異常易位、缺失、重復(fù)、環(huán)狀染色體和雙著絲粒染色體 例：Ph染色體（費(fèi)城1號染色體），慢性粒細(xì)胞性白血病（CML） ，9號和22號染色體長臂易位 9號原癌基因abl和22號bcr基因組合成融合基因增高的酪氨酸激酶活性。 Ph臨床意義在于：95的CML都是Ph陽性，可以作為診斷的依據(jù)。有時Ph先于臨床癥狀出現(xiàn)，故又可用于早期診斷。 73二、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)異常 原癌基因: sis、VEGF、EGFR、c-myc抑癌基因: APC、BRCA、p53、Rb細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因: cyclins、CDKs、CKIs細(xì)胞凋亡相關(guān)基因: Bcl-1、

34、p53、bcr-abl基因組穩(wěn)定相關(guān)基因(DNA修復(fù)基因): APE1腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因:nm23、WDNM、sis、p53腫瘤血管生成相關(guān)基因: VEGF 、EGFR、p53（一）原癌基因普遍存在于人類或其他動物固有的一類基因，其在生物進(jìn)化過程中高度穩(wěn)定，對細(xì)胞無害，而且在控制細(xì)胞生長和分化中起重要作用。在環(huán)境致癌因素作用下，原癌基因發(fā)生點突變、易位激活、原癌基因擴(kuò)增、癌基因甲基化程度降低被激活成活性形式的癌基因才引起細(xì)胞癌變。(一)原癌基因點突變(point mutation) 癌基因在編碼順序的特定位置上的某一個核苷酸發(fā)生突變，使其表達(dá)蛋白質(zhì)中相應(yīng)的氨基酸發(fā)生變化，從而獲得了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的活性

35、 75mutation (二)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（translocation）基因重排（rearrangemant）： 有些癌基因從其染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到另一染色體的某個位置，由于調(diào)控環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致從相對靜止?fàn)顟B(tài)變成激活狀態(tài)，使原癌基因表達(dá)產(chǎn)物顯著增加而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 76(三)原癌基因獲得外源啟動子而激活 腫瘤細(xì)胞中原癌基因的表達(dá)水平可以其轉(zhuǎn)錄的mRNA或翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的含量來表示 在原癌基因的上游插入外源性啟動子或增強(qiáng)子可激活原癌基因，使其表達(dá)產(chǎn)物增多 病毒的增強(qiáng)子常位于5端的長末端重復(fù)序列(1ong terminal repeat，LTR)內(nèi)。如果增強(qiáng)子插入到原

36、癌基因的附近或遠(yuǎn)處，均使之激活，促使癌基因的表達(dá)比正常表達(dá)增高幾十甚至上百倍 77 (四)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的甲基化(methylation)對阻抑基因的轉(zhuǎn)錄具有重要作用 78（二）抑癌基因又稱腫瘤抑制基因，為一類可編碼對腫瘤形成起阻抑作用的蛋白質(zhì)基因，正常情況下抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化。抑癌基因失活方式： 1）DNA點突變或缺失導(dǎo)致一個等位基因失活。 2）DNA甲基化和組蛋白去乙酰化抑制一個等位基因表達(dá)。（三）細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因細(xì)胞周期：正常連續(xù)分裂的細(xì)胞從前一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的連續(xù)動態(tài)過程，也是多階段多因子參與的精確而有序的調(diào)控過程。特點：1

37、）單向性：G1 S G2 M 2）階段性：因某種原因停滯下來，條件好轉(zhuǎn)，進(jìn)入下一時項 3）檢查點：細(xì)胞各時項交叉處存在檢查點，通過檢查點才能進(jìn)入下一個時項。細(xì)胞周期運(yùn)行的動力主要來自細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，它的活性受細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑調(diào)控。這些調(diào)控方式相互制約，形成一個復(fù)雜的細(xì)胞周期分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶CDK1-132、細(xì)胞周期蛋白CCND13、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDK4、細(xì)胞周期檢查點Chk1(三)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因（四）細(xì)胞凋亡相關(guān)基因大致分為三組1、促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因2、抑制細(xì)胞凋亡基因3、細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)的基因（五）維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定

38、相關(guān)基因DNA修復(fù)基因及基因組不穩(wěn)定性基因（六）促進(jìn)和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因（七）腫瘤血管生成相關(guān)基因VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)84三、腫瘤相關(guān)單核苷酸多態(tài)性1. SNP與腫瘤腫瘤易感基因、腫瘤藥物治療相關(guān)基因腫瘤個體化診療2. SNP的研究思路研究對象差異性研究技術(shù)：PCR、芯片研究難點：樣本采集85四、腫瘤相關(guān)表觀遺傳異常 （一）表觀遺傳（epigenetics）是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。這種改變是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變，且這種改變在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞。（二）分子機(jī)制：1、基因印記丟失，一對等位基因只表達(dá)來自親本一方的

39、等位基因，而與性別無關(guān)。 2、DNA甲基化：例如啟動子區(qū)域的CpG島高甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄沉默 3、組蛋白修飾與染色體重塑86五、腫瘤相關(guān)miRNA1、 miRNA與腫瘤miRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療、預(yù)后2、miRNA類腫瘤標(biāo)志物的研究思路研究對象：實體瘤、細(xì)胞、循環(huán)血、其他研究技術(shù)：定量PCR、western blot、芯片、免疫組化、細(xì)胞培養(yǎng)（增殖、遷移、浸潤）等等第三節(jié)腫瘤分子生物學(xué)檢驗的臨床應(yīng)用 肺癌肺癌的分子遺傳特征1、細(xì)胞色素P450家族，絕大多數(shù)的致癌物包括內(nèi)源性和外源性都需經(jīng)過P450轉(zhuǎn)化，研究最多的CYP1A12、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）家族,使致癌物失活3、NA

40、T2家族，解毒作用90肺癌的分子生物學(xué)檢驗1、EGFR（原癌基因表皮生長因子受體）基因檢測 大多數(shù)在NSCLC中過表達(dá)且是重表皮生長要是治療靶標(biāo)，EGFR是表皮生長因子相關(guān)酪氨酸受體家族的成員，通過與配體的結(jié)合，受體同源和異源二聚體化，從而激活受體內(nèi)源性的酪氨酸激酶，并引發(fā)下游信號級聯(lián)反應(yīng)，主要包括Ras-Raf-MAP激酶信號通路、P3K-Akt信號通路和STAT通路。這些信號通路對細(xì)胞的增值、分化、遷移和血管生成有很強(qiáng)的刺激效應(yīng)。91肺癌的分子生物學(xué)檢驗2、K-ras檢測 ras基因，特別是K-ras基因，與肺癌的發(fā)生及預(yù)后有 關(guān)。有20%-30%的NSCLC患者存在K-ras基因突變。8

41、0%-90%的突變是12密碼子G-T引起的，導(dǎo)致K-ras蛋白組成性活化， NSCLC患者伴隨K-ras突變與預(yù)后不良有關(guān)， K-ras突變與EGFR突變是相互排斥的。伴隨K-ras突變的NSCLC患者EGFR-TK3藥物敏感性較差92肺癌的分子生物學(xué)檢驗3、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF-1）是一種分子量為38-40的核蛋白，在胎兒肺組織及成人型肺泡上皮中存在，而在型肺泡上皮中不表達(dá)，TTF-1高表達(dá)則EGFR突變率高，是服用EGFR-TK3藥物的優(yōu)勢人群。93肺癌的分子生物學(xué)檢驗4、癌胚抗原（CEA） 表達(dá)于胎兒上皮細(xì)胞的一種糖蛋白，用于檢測上皮性腫瘤，尤其是腺上皮來源的腺癌。靶向EGFR的抗腫

42、瘤藥物類別一：小分子酪氨酸激酶抑制劑（ EGFR TKI) 作用機(jī)制：抑制EGFR胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR信號通路； 藥物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄羅替尼（羅氏）。類別二：單克隆抗體(mAb) 作用機(jī)制：與EGFR胞外區(qū)結(jié)合，阻斷配體與EGFR的結(jié)合； 藥物代表：西妥昔（默克）；貝伐單抗（羅氏）。 乳腺癌乳腺癌基因檢測的意義BRCA1:1990年研究者發(fā)現(xiàn)一種直接與遺傳性乳腺癌有關(guān)的基因，命名為BRCA1，1994年又發(fā)現(xiàn)另外一種與乳腺癌有關(guān)的基因，稱為BRCA2。乳腺癌遺傳檢測適宜人群 (如果有以下因素，強(qiáng)烈建議接受乳腺癌BRCA檢查)1、一個或多個直系親屬有乳腺癌史，如母親或

43、姐妹 2、家族成員里有早發(fā)乳腺癌患者，發(fā)病年齡早于40 3、家族成員里兩代以上出現(xiàn)乳腺癌患者 4、家族成員有雙側(cè)乳腺癌患者 5、家族成員里有卵巢癌患者 6、家族成員有男性成員乳腺癌患者 7、一個或多個家族成員攜帶BRCA基因突變，即遺傳檢測陽性 乳腺癌的分子生物學(xué)檢測1、c-erb B-2/HER2基因的檢測是乳腺癌中較常見，易激活的原癌基因c-erb B-2/HER2基因高表達(dá)往往生存率低，惡性程度高2、雌激素受體和孕激素受體的檢測ER和PR陽性的乳腺癌可以進(jìn)行內(nèi)分泌治療腫瘤生物學(xué)行為決定乳癌治療選擇NegativePositiveER / PgRHER-2NegativePositive

44、化療 Avastin內(nèi)分泌治療抗Her-2治療 白血病1、白血病相關(guān)基因突變（1）C-KIT基因突變（2）FLT3基因突變 (3) NPM基因突變 （4）N-ras基因突變 （5）NOTCH1基因突變2、白血病相關(guān)基因異常表達(dá)（1）WT1基因異常表達(dá)，為抑癌基因的一種，是急性白血病獨(dú)立的預(yù)后因子（2）HOX11基因異常表達(dá)，此類患者預(yù)后較好，化療效果佳。3、白血病融合基因 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉(zhuǎn)移到第22對染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達(dá)增高，蛋白質(zhì)產(chǎn)物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生 染色體易位使位于9q3

45、4的c-abl基因轉(zhuǎn)移到第22對染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達(dá)增高，蛋白質(zhì)產(chǎn)物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生 104 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉(zhuǎn)移到第22對染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達(dá)增高，蛋白質(zhì)產(chǎn)物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生 結(jié)直腸癌大腸癌靶向治療敏感基因EGFR的傳導(dǎo)通路大腸癌靶向治療敏感性基因檢測K-RAS基因檢測已經(jīng)成為大腸癌患者治療前必做的常規(guī)檢查，是目前醫(yī)生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法K-RAS基因檢測可以

46、篩選出對抗EGFR(表皮生長因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實現(xiàn)腫瘤病人的個體化治療，從而達(dá)到良好的預(yù)后。早期檢測K-RAS還可以通過該基因的狀態(tài)了解到病人的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，為將來選擇最佳治療做好準(zhǔn)備。 第十七章 藥物代謝與毒副作用相關(guān)基因 的分子生物學(xué)檢驗技術(shù)濱醫(yī)附院檢驗科 袁笑是藥三分毒？ 你吃錯藥啦!你藥吃多啦！不合理用藥導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng) 全球死亡患者中，三分之一是由于不合理用藥，而并非死于自然疾病本身。 WHO（聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織）美國每年有10萬人死于藥物不良反應(yīng)，直接和間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)120億美元。FDA(美國食品和藥物管理局)根據(jù)藥監(jiān)局和食品藥品管理局等機(jī)構(gòu)的統(tǒng)計：1、中國每

47、年有5000萬的住院病人，其中至少250萬與藥物不良反應(yīng)有關(guān)，20多萬人因此而死亡。2、我國住院病人中有20是由于不合理用藥造成二次住院。傳統(tǒng)用藥的弊端 癥狀體征及儀器檢查診斷藥物治療經(jīng)驗處方藥物治療A藥B藥C藥D藥傳統(tǒng)經(jīng)驗性用藥代價1、耗時多2、花費(fèi)大3、療效差4、不良反應(yīng)多5、毒副作用幾率大藥物代謝因人而異生物轉(zhuǎn)化肝臟藥物藥物重吸收代謝產(chǎn)物排泄藥物重吸收腎臟藥物毒性但有效藥物毒性且無效藥物無毒性且有效藥物無毒性也無效同種同量藥物治療一種類型的藥并不適合所有人藥物代謝酶決定藥物反應(yīng)的因素體重/身高性別老人/小孩/孕婦病史并發(fā)癥環(huán)境因素遺傳因素（基因）不同人群藥代動力學(xué)藥效動力學(xué)藥物療效和毒性的個體差異基因組基因變異(單核苷酸多態(tài)性)藥物靶點藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體藥物代謝酶約59%的藥物不良反應(yīng)與遺傳相關(guān)基因變異決定藥物反應(yīng)個體差異 決定性因素單核苷酸多態(tài)性（S